兩種蘆薈多糖的分析方法比較.doc

學(xué)年論文（課程論文、課程設(shè)計(jì)） 題 目： 兩種蘆薈多糖分析方法的比較 姓 名： 學(xué) 號(hào)： 專業(yè)年級(jí)： 成 績(jī)： 指導(dǎo)教師（職稱）： 兩種蘆薈多糖分析方法的比較摘要：目的：通過(guò)比較兩種蘆薈多糖的分析方法，明確兩種方法適合的范圍。目前蘆薈多糖的提取方法多數(shù)為水提醇沉淀法，但是對(duì)于水提醇沉法，又有多種分析蘆薈多糖的方法。為尋找比較簡(jiǎn)單易行的蘆薈多糖提取工藝，本文主要比較了兩種常見(jiàn)的分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法，對(duì)這兩種方法中的儀器和材料、實(shí)驗(yàn)方法及過(guò)程復(fù)雜程度、效率這三個(gè)部分進(jìn)行比較。通過(guò)比較得出，利用苯酚硫酸法分析多糖適合小型研究和實(shí)驗(yàn)室使用。而蒽酮硫酸法分析多糖用于工廠生產(chǎn)。關(guān)鍵詞：蘆薈多糖；分析方法；蒽酮硫酸分析法；苯酚硫酸分析法 自古以來(lái)，蘆薈作為一種天然的藥用植物在民間就得到廣泛的應(yīng)用1。它被用于治療便秘、燒傷、燙傷等多種疾病，同時(shí)具有安全、有效、易用等突出特點(diǎn)2。蘆薈是屬多年生肉質(zhì)本草植物，具有生命力強(qiáng)、藥用價(jià)值高等特點(diǎn)3。早在唐代，中國(guó)的本草拾遺就簡(jiǎn)略記載了蘆薈的藥用價(jià)值4。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代大量研究進(jìn)一步證明蘆薈具有抗菌消炎、抗?jié)?、抗癌、促進(jìn)傷口愈合、抗腫瘤、保健美容等作用5 。其性味苦，寒，入肝、心、脾經(jīng)，可清熱、通便、殺蟲(chóng)、治熱結(jié)便秘、婦女閉經(jīng)、癬瘡等疾病6。蘆薈中的化學(xué)成分復(fù)雜，目前已知的主要有蒽醌類化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多糖等7。蘆薈多糖是一大類分子化合物，一般是由葡萄糖以及葡萄糖聚合物組成，占蘆薈的0.05%3%8。隨著糖類生化技術(shù)和免疫學(xué)研究的發(fā)展，人們對(duì)蘆薈多糖有了越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)。 盡管蘆薈藥用價(jià)值很高，但是近年來(lái)的多數(shù)研究主要是集中在蘆薈多糖的藥效上，并沒(méi)有深入而細(xì)致的開(kāi)展關(guān)于其提取工藝的方法研究，我國(guó)蘆薈產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也受到一定的制約9。本實(shí)驗(yàn)是在一般蘆薈多糖的水提醇沉淀法提取工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)蘆薈多糖分離提純后的分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法這兩種方法的探討，比較兩種方法的材料需要和效率，分析提取蘆薈多糖的最佳的提取方法，進(jìn)一步明確蘆薈多糖分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法實(shí)用的范圍，區(qū)別和明確實(shí)驗(yàn)室和工廠生產(chǎn)適合的提取方法。1方法一：苯酚硫酸法1.2 材料與儀器“日歷高冷卻離心機(jī)（himacR22E）；熱重分析儀（STA 409C）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-134）；酸度計(jì)；榨汁機(jī)；7530紫外分光光度計(jì)；BS110S電子分析天平；1000r/min高速自控組織搗碎機(jī)。無(wú)水乙醇；濃硫酸；丙酮；去離子水；苯酚；乙醚；D-甘露糖；試劑均為分析純。1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取105干燥至恒重的甘露糖0.100g于100mL容量瓶中，加蒸餾水定容。用移液管精密移取5ml置于50mL容量瓶中，加蒸餾水定容。分別精密移取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于50mL容量瓶中，加蒸餾水定容。然后分別精密吸取2ml于試管中，加1mL苯酚搖勻，加5mL濃硫酸迅速搖勻后，靜置5分鐘，后用沸水浴15分鐘加熱，冷卻至室溫，用分光光度法于波長(zhǎng)為490nm處測(cè)吸收光度。得出結(jié)果列表顯示，以濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出回歸方程10。1.3.2 蘆薈多糖的提取 采用水提醇沉法提取蘆薈多糖苯酚硫酸法進(jìn)行分析。取蘆薈葉片洗凈、去刺。在去離子水中浸泡，除去表皮滲出的黃色液汁。然后切去表皮，將內(nèi)層凝膠至于離心水中浸洗，搗碎，紗布過(guò)濾，次日離心，抽濾，所得蘆薈汁經(jīng)濃縮后，再次離心，以除盡纖維質(zhì)，冷藏備用。然后向蘆薈凝膠濃縮汁加入無(wú)水乙醇，使其乙醇終濃度為80%，沉淀12h后，高速離心得多糖沉淀。取沉淀物溶于蒸餾水中配成溶液，過(guò)濾，搖勻，定容至250ml容量瓶中，既得蘆薈多糖溶液。1.3.3 總糖含量測(cè)定 精密量取蘆薈粗多糖溶液5mL置于50mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，從中精密吸取2mL置于試管中，照1.3.1項(xiàng)下自加苯酚起以此操作，測(cè)得吸收度依回歸方程計(jì)算，再乘上稀釋倍數(shù)，得蘆薈多糖相對(duì)含量”11。1.3.4 精密度試驗(yàn) 平行取六份甘露糖和蘆薈多糖溶液，苯酚-硫酸法顯色后測(cè)定D值。1.3.5 回收實(shí)驗(yàn)加樣回收率試驗(yàn)取蘆薈多糖提取液5份,分別加入一定量的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)液,進(jìn)行回收試驗(yàn)。2 方法二：蒽酮硫酸法2.1 材料與儀器 蘆薈凝膠凍干粉；乙醇；乙醚；蒽酮；葡萄糖；三氯乙酸；濃硫酸；試劑均為分析純。超濾膜（截留分子量為3萬(wàn)和10萬(wàn)）；722型分光光度計(jì)；LDZ4-08型自動(dòng)平衡離心機(jī)；BS11OS電子分析天平。2.2 實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 蘆薈凝膠凍干粉中總糖的測(cè)定 采用蒽酮-硫酸法測(cè)定，葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品?？偺怯蓡翁?、寡聚糖和多糖組成。寡聚糖和多糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糖醛或羥甲基糖醛，生成的糖醛或羥甲基糖醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糖醛衍生物12。在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與含糖量成正比，故可利用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總糖量5。2.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取無(wú)水葡萄糖0.010g加蒸餾水溶解，定容至10mL。得濃度為1.0mg/mL的葡萄糖溶液，用蒸餾水稀釋10倍，配制成100g/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。2.2.4 蒽酮試劑的配制 稱取2000g蒽酮，溶于80%濃硫酸1000mL中，冷卻至室溫，貯于具塞棕色瓶?jī)?nèi)，冰箱保存，可使用2到3周。2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定分別取100g/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL加入10mL離心管中，加蒸餾水定容至1mL，用移液管加入5mL蒽酮試劑，搖勻置沸水浴中煮15min，冰水冷卻，空白管調(diào)零，1cm光徑比色皿于分光光度計(jì)620nm處測(cè)定溶液吸光度A值。以A值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。用A值和樣品稀釋倍數(shù)可以算出多糖濃度C，通過(guò)C和樣品中凝膠粉的濃度計(jì)算出凝膠粉中多糖的含量X14。2.2.6 蘆薈凝膠凍干粉中多糖的分離純化及含量測(cè)定2.2.6.1 蘆薈多糖的分離取50.000g蘆薈凝膠粉，加入適量蒸餾水，60提取1h重復(fù)2次，收集移取夜，濃縮，緩緩加入95%乙醇，至含醇量為80%，放入4冰箱過(guò)夜，真空抽濾，濾液離心，合并兩次收集的沉淀物，得粗多糖。2.2.6.2 蘆薈粗多糖的純化：依次用分析純無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌、干燥，得精制粗多糖。將其配制成1%濃度溶液，以30%CCL5COOH除蛋白，4冰箱過(guò)夜，離心除去沉淀，上清液減壓濃縮，加乙醇至80%，離心收集沉淀。50干燥得精制多糖AP1。取部分AP1溶于雙蒸水中，配成透明溶液，選用不同規(guī)格的超濾膜截留不同分子量的蘆薈多糖。得到多糖AP11(分子量3萬(wàn))、多糖AP12(3萬(wàn)分子量3萬(wàn)）。將制備好的多糖干燥，放于陰涼干燥處、備用。2.2.6.3 蘆薈多糖含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱取AP1、AP11、AP12、AP13各0.010g分別加入10mL水，60水浴30min溶解，配制成1mg/ml的多糖溶液。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線2.2.5的制備方法，加入樣品量100L，測(cè)定樣品溶液吸光度A值。按照總糖含量計(jì)算方法計(jì)算其中多糖含量15?！? 兩種方法的區(qū)別3.1 儀器和試劑3.1.1 儀器：通過(guò)比較，兩種方法使用的儀器都需要分光光度計(jì)、分析天平、離心機(jī)。但是方法一需用的儀器比方法二多，且價(jià)格高昂。3.1.2 試劑：兩種方法需要的試劑都比較常見(jiàn)，都需要乙醇、濃硫酸等。但是方法二中需用大量的蒽酮和濃硫酸試劑，濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在一定的安全隱患。方法二使用的蘆薈材料是蘆薈凝膠凍干粉16，此材料需要更多的加工步驟，需要消耗更多的時(shí)間和精力以及財(cái)力，但是原料比較純，可以減少蘆薈濃縮、離心、抽濾等步驟。方法一的蘆薈原料為蘆薈植株在使用時(shí)需人工去刺和切去表皮，得到的蘆薈原料不純且沒(méi)有方法二的效率高。3.2 實(shí)驗(yàn)方法及過(guò)程復(fù)雜程度3.2.1 方法一：采用水提醇沉法提取蘆薈多糖苯酚硫酸法進(jìn)行分析，以甘露糖標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用苯酚-硫酸、紫外分光光度法于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定蘆薈多糖的含量。該實(shí)驗(yàn)主要采取的方法共分為4大步驟：標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、蘆薈多糖的提取、總糖的含量測(cè)定、精密度試驗(yàn)17。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)操作中步驟比較多，而且步驟之間時(shí)間聯(lián)系緊密，很容易漏做，或者做錯(cuò)，耗時(shí)也較多，實(shí)驗(yàn)用時(shí)大約為4天。實(shí)驗(yàn)操作比較簡(jiǎn)易，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求一般，但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較瑣碎，容易損失有效成分，影響結(jié)果，且計(jì)算過(guò)程也較為復(fù)雜。3.2.2 方法二：該實(shí)驗(yàn)主要采取的方法是：水提醇沉法提取蘆薈多糖蒽酮硫酸法分析多，用乙醚洗滌、無(wú)水乙醇、丙酮、三氯乙酸等除蛋白,得精制蘆薈粗多糖AP1，超濾膜截留得不同分子量蘆薈多糖AP11、AP12、AP1318。該方法是共分為5大步驟：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、蒽酮試劑的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定、總糖的含量測(cè)定、蘆薈凝膠凍干粉中多糖的分離。方法二的實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)比較多，過(guò)程比較復(fù)雜，但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有幾個(gè)步驟是可以同時(shí)進(jìn)行的，比如蒽酮試劑的配制和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。該實(shí)驗(yàn)耗用時(shí)間大約3天。這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)于溫度的要求較多，主要涉及溶液的移取操作，因?yàn)橐迫〉脑噭┝勘容^小，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求嚴(yán)格。涉及的數(shù)據(jù)較多，計(jì)算過(guò)程復(fù)雜。3.3 實(shí)驗(yàn)效率比較從兩種方法的過(guò)程來(lái)看，方法一的步驟雖容易，但是較為復(fù)雜和瑣碎，實(shí)驗(yàn)步驟越多在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑就越容易被帶走或者遺失19。方法二的步驟比較分散，該方法是先測(cè)總糖再求多糖的含量。3.4 綜合3.1到3.3的各項(xiàng)比較綜合了儀器設(shè)備的需要和材料來(lái)源的難易程度，總結(jié)得出方法一優(yōu)于方法二。實(shí)驗(yàn)耗時(shí)來(lái)看方法二優(yōu)于方法一，計(jì)算復(fù)雜程度方法二難于方法一，從實(shí)驗(yàn)最終得出成品的效率方法二優(yōu)于方法一。但是方法一的操作相對(duì)于方法二較為基礎(chǔ)一點(diǎn)，要求的實(shí)驗(yàn)技術(shù)比方法二的簡(jiǎn)單，雖然方法一的步驟比較繁瑣但是同時(shí)也比較經(jīng)典。所以，兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和不足，建議實(shí)驗(yàn)室提取蘆薈多糖采用方法一，方法一的原料較便宜來(lái)源廣，實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求基礎(chǔ)。方法二的設(shè)備要求相對(duì)簡(jiǎn)單，適合工廠大量生產(chǎn)，且蘆薈原料較純，可以直接購(gòu)買，實(shí)驗(yàn)效率高，所以該方法適合工廠生產(chǎn)采用。參考文獻(xiàn)1中國(guó)藥典.2005.1部.112-113.2苗艷艷,黃兆勝蘆薈多糖的藥理作用研究現(xiàn)狀與分析J.遼寧中醫(yī)雜志, 2009, 36(6): 898-9001.3蔡健.蘆薈的功能成分與保健功效.食品與藥品, 2006,8(08A): 27.4趙明敏.蘆薈多糖抗病毒作用研究進(jìn)展J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(3):894-897.5鄒翔,汲晨鋒,高世勇,等. 3種蘆薈多糖抗腫瘤作用的比較分析J.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2004, 20(1): 14-17.6金雪梅,金光洙.天然蒽醌抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29(3): 221.7馮詠梅.蘆薈活性成分的含量及其穩(wěn)定性研究J.中國(guó)海洋大學(xué), 2004, 12:5.8林雪,賈敬芬,黃林娟,等.RP-HPLC用于蘆薈多糖的單糖成分研究J.食品科學(xué),2006,27(4):192-1959皮文霞,丁輝,程愛(ài)斌,等.蘆薈多糖的純化工藝與體外抗腫瘤活性J.中國(guó)天然藥物, 2007, 5(6): 425-427.10傅繼華,溫 濤.蘆薈多糖提取工藝研究J.中草藥藥,2006,36(6):324-326.(6):359-360.18.11林新華,陳俊,等.蘆薈多糖的分離提取與含t測(cè)定J.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2(X)3,37(2):214一215.12梁 艷.蘆薈凍干及多糖提取研究J.食品研究與開(kāi)發(fā),2005,26(3):71-73.13鄒翔,王洪亮,孫宇.3種蘆薈多糖體外抗腫瘤作用的比較研究J.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,20(5):512-518.14陳玲. 蘆薈的藥理及應(yīng)用.全國(guó)中醫(yī)藥科研與教學(xué)改革研討會(huì)論文集，2004.