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小鼠nanos2Nanos2基因的研究進(jìn)展摘要：Nanos是最先被鑒定的一個(gè)母源效應(yīng)基因，后來(lái)在其他生物中都發(fā)現(xiàn)有其同源物存在，主要作用是促進(jìn)性腺的發(fā)育。不同物種或同一物種不同的nanos同源物的功能和作用機(jī)制都不盡相同。在小鼠中nanos有三個(gè)同源物nanos1，2，3.Nanos1在性腺和腦組織中都有表達(dá)，nanos2和Nanos3具有生殖特異性，只在性腺中表達(dá)，尤其是nanos2，在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中不可或缺。Nanos2不僅維持PGC和SSC的自我更新，而且是一種啟動(dòng)雄性分化程序的內(nèi)源性因子，在胚胎發(fā)育時(shí)期只表達(dá)于雄性生殖細(xì)胞中。了解nanos2的功能和作用機(jī)理有助于讓我們對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程和性別決定調(diào)控有更清楚的認(rèn)識(shí)。關(guān)鍵詞：nanos2 精源干細(xì)胞 性別決定 自我更新Nanos基因最早由 在果蠅中發(fā)現(xiàn)，它編碼一種RNA結(jié)合蛋白，這種蛋白與pumilioRNA結(jié)合蛋白相互作用形成一種核糖核蛋白復(fù)合物一起抑制母源mRNA hunchback的翻譯，從而調(diào)控果蠅胚胎后腹部細(xì)胞的分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步研究表明nanos對(duì)果蠅生殖細(xì)胞的發(fā)育是必須的，Nanos基因的缺失將使果蠅不能形成性腺，產(chǎn)生異常生殖細(xì)胞。隨后，科學(xué)家在線(xiàn)蟲(chóng)，、蜜蜂，、家蠶等物種中也相繼發(fā)現(xiàn)nanos同源物，它們的功能也都和個(gè)體發(fā)育或生殖細(xì)胞的發(fā)育分化有關(guān)。小鼠中含有三個(gè)nanos的同源物，分別命名為Nanos1，2，3.。其中 小鼠中，Nanos1在小鼠胚胎，、成體睪丸，成體和腦組織中都有表達(dá)。Nanos1基因敲除的小鼠并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)性腺的異常，說(shuō)明Nanos1對(duì)小鼠性腺的發(fā)育不是必須的或其功能是其功能可以被其他基因代替。Nanos2和nanos3都是生殖細(xì)胞特異性的，其基因敲除的小鼠都不能形成正常的性腺，成體中nanos2Nanos2或Nanos3的缺失將導(dǎo)致生殖細(xì)胞的丟失。Nanos3在胚胎期兩性中都有表達(dá)而nanos2Nanos2只在雄性中表達(dá)，所以因此，nanos2Nanos2是一個(gè)嚴(yán)格的雄性生殖特異性基因。現(xiàn)本文就對(duì)nanos2Nanos2的結(jié)構(gòu)，, 功能以及分子機(jī)制等方面做一番綜簡(jiǎn)述。一Nanos2的結(jié)構(gòu)Nanos基因在不同物種中差異較大，介于幾十到上千bp不等。Nanos2基因全長(zhǎng)1439，只含有一個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子，編碼區(qū)長(zhǎng)為410 bp，在靠近C端的序列編碼了兩個(gè)特異鋅指結(jié)構(gòu)域CCHC（Cys-Cys-His-Cys），這兩個(gè)特異鋅指結(jié)構(gòu)域在目前發(fā)現(xiàn)的所有物種的nanosNanos基因中都是高度保守的。同時(shí)敲除這兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)⑹筺anosNanos基因功能喪失。Nanos2的非編碼區(qū)3UTR部分長(zhǎng)為900 bp, Yaga等（ ）通過(guò)基因敲除比較含有和不含nanos2 3UTR部分的小鼠，發(fā)現(xiàn)不含3UTR部分的小鼠曲細(xì)精管中生殖細(xì)胞的數(shù)量明顯少于含有3UTR部分的小鼠，這表明在沒(méi)有3UTR部分的情況下肯定有一部分生殖細(xì)胞丟失了部分的情況下肯定有一部分生殖細(xì)胞凋亡了，。我們可以據(jù)此可以推斷nanos2Nanos2表達(dá)水平對(duì)正常精子的發(fā)生是必須的，而nanos2Nanos2的3UTR部分對(duì)這個(gè)過(guò)程起著調(diào)控作用。另外，在基因敲除的小鼠中導(dǎo)入含有報(bào)告基因Lacz和nanos2含有3UTR部分的載體，檢測(cè)到Lacz在兩性細(xì)胞中都有表達(dá)，但nanos2Nanos2只在雄性細(xì)胞中表達(dá)，暗示3UTR部分在雄性中上調(diào)nanos2Nanos2的表達(dá)水平，在雌性中下調(diào)nanos2的表達(dá)水平，推測(cè)3UTR部分可能存在不同的增強(qiáng)子結(jié)合區(qū)。前面說(shuō)到的那部分丟失的細(xì)胞可能是因?yàn)閚anos2Nanos2表達(dá)缺失導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，也可能是nanos2表達(dá)水平下調(diào)導(dǎo)致的生殖母細(xì)胞的分化大于增殖，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)表明了后者的正確性。二 nanos2Nanos2的功能2.1 nanos2在胚胎時(shí)期通過(guò)啟動(dòng)雄性發(fā)育程序。 在胚胎發(fā)育早期原始生殖細(xì)胞PGC并非產(chǎn)生在真正的性腺位置產(chǎn)生，所以PGC在形成后會(huì)在微環(huán)境的影響下穿過(guò)體細(xì)胞進(jìn)入生殖嵴，即將來(lái)發(fā)育成性腺的地方。在PGC遷移的過(guò)程中這些生殖細(xì)胞的性別還沒(méi)有被確定，它們具有向兩性分化的潛能。大多數(shù)人認(rèn)為生殖細(xì)胞周?chē)捏w細(xì)胞對(duì)生殖細(xì)胞起著性別決定的作用，而nanos2是一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的起性別決定作用的生殖細(xì)胞內(nèi)源性基因的因子。PGC生殖細(xì)胞定植置于生殖嵴后開(kāi)始性別分化，大約在E10.5天，此后，雌性生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂并停留在減數(shù)分裂一期雌性生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂并停留在減數(shù)分裂前期，而雄性生殖細(xì)胞開(kāi)始增殖或停留在G1G0期并伴隨基因甲基化和印跡基因表達(dá)等。Nanos2在13.5天開(kāi)始表達(dá)，15.5天達(dá)到高峰之后迅速下降到消失天達(dá)到高峰之后迅速下降直至消失。敲除nanos2基因的小鼠不能產(chǎn)生完整的性腺，生殖細(xì)胞不斷丟失，說(shuō)明nanos2對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)育是必須的。通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)，nanos2基因敲除的生殖細(xì)胞中許多和減數(shù)分裂有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而雄性特異性基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。暗示nanos2可能是通過(guò)抑制雌性化而啟動(dòng)雄性分化程序。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)，如果將nanos2在胚胎階段一直超表達(dá)在胚胎期一直超表達(dá)，結(jié)果超表達(dá)的雌鼠在E13.5天生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂被抑制，并且趨向雄性化發(fā)育，例如雄性生殖細(xì)胞特異性基因Dnmt3l,、TdrdI等表達(dá)水平上調(diào)。，此這個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了研究進(jìn)一步證明了nanos2可能通過(guò)抑制雌性化而促進(jìn)雄性生殖細(xì)胞發(fā)育。上述結(jié)論。2.2 nanos2在小鼠出生后維持出生后小鼠精原干細(xì)胞的數(shù)量和的自我更新。 在小鼠出生后，nanos2又開(kāi)始表達(dá)，但僅存在于一小部分生殖細(xì)胞中。由于傳統(tǒng)的基因敲除會(huì)使小鼠在胚胎期由于缺少nanos2使生殖細(xì)胞凋亡，所以為研究nanos2在小鼠出生后的功能Saga等人采用條件性敲除的方法，使nanos2的缺失時(shí)始于出生后。研究發(fā)現(xiàn)，nanos2基因缺失后，新生鼠的生殖細(xì)胞數(shù)量會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)而不斷減少。這可能是細(xì)胞凋亡的結(jié)果，也可能是生殖細(xì)胞的來(lái)源精原干細(xì)胞數(shù)量的不斷減少。可是，檢測(cè)多聚二磷酸核糖聚合酶的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組和nanos2缺失實(shí)驗(yàn)組睪丸中并沒(méi)有明顯的不同，提示我們生殖細(xì)胞在Nanos2缺失的情況下不斷減少不是生殖細(xì)胞加速凋亡的結(jié)果。那么也就是第二種可能，也就是說(shuō)nanos2對(duì)精原干細(xì)胞的自我更新維持是必須的，沒(méi)有了nanos2，精原干細(xì)胞都走向了分化，生殖細(xì)胞沒(méi)有了持續(xù)的細(xì)胞來(lái)源而導(dǎo)致生殖細(xì)胞數(shù)量不斷減少。為了驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論，研究人員將CAG-floxed-CAT-3Flag-Nanos2轉(zhuǎn)基因小鼠與Nanos3-Cre 小鼠雜交，得到從胚胎早期就開(kāi)始表達(dá)nanos2的子代雄性小鼠。這種Nanos2超表達(dá)小鼠是不育的，睪丸重量輕，曲細(xì)精管多數(shù)細(xì)胞都在基底膜上，也就是精原干細(xì)胞所在位置。對(duì)特異基因進(jìn)行分析，減數(shù)分裂晚期的基因Scp3表達(dá)量減少，C-kit也減少，未分化精原細(xì)胞標(biāo)記基因Plzf表達(dá)增強(qiáng)。這些生殖細(xì)胞的增殖能力低，凋亡水平正常。這些結(jié)果表明nanos2超表達(dá)使精原細(xì)胞積累，抑制分化而不是抑制生殖細(xì)胞凋亡。三 nanos2分子機(jī)制 在果蠅中Nanos蛋白與RNA結(jié)合蛋白pumilio形成一種核糖核蛋白復(fù)合物一起抑制母源mRNA hunback 的翻譯，從而啟動(dòng)胚胎后腹部細(xì)胞的特異性分化過(guò)程。 在人中同樣發(fā)現(xiàn)nanos蛋白與pumilio的同源物Pumilio2的相互作用。但在小鼠中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)nanos2與Pumilio同源物的結(jié)合現(xiàn)象。說(shuō)明Nanos2有另外的分子機(jī)制，Nanos基因在不同物種中作用機(jī)制不盡相同。3.1 nanos2定位應(yīng)用免疫共沉淀和Western手段，分析到nanos2在E13.5天開(kāi)始表達(dá)，并在表達(dá)水平增強(qiáng)的過(guò)程中形成聚點(diǎn)，果蠅中Vasa和Tudor會(huì)形成細(xì)胞質(zhì)聚點(diǎn)，但經(jīng)檢測(cè)這些在小鼠中的同源物并非和nanos2聚點(diǎn)在一起。用雙重免疫沉淀反應(yīng)發(fā)現(xiàn)nanos2聚點(diǎn)與P小體復(fù)合物組分DCP2和XRN1結(jié)合。在E13.5天P小體只存在于生殖細(xì)胞中，不存在于成體細(xì)胞中，之后在雌性生殖細(xì)胞中逐漸減小，E14.5天消失，在雄性生殖細(xì)胞中則逐漸增大伴隨nanos2的表達(dá)。這表明Nanos2即定位于P小體。P小體是一個(gè)RNA降解中心，含有多種RNA降解酶，其中DCP2是一種RNA去頭酶，XRN1是一種核酸外切酶。所以nanos2很可能與RNA降解有關(guān)。3.2 nanos2相互作用的蛋白復(fù)合物CCR4-NOT免疫共沉淀進(jìn)一步去研究nanos2相互作用蛋白，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CNT1，CNT3等一些屬于CCR4-NOT脫腺苷復(fù)合物元件蛋白都與nanos2相結(jié)合。而且在體外CCR4-NOT脫腺苷復(fù)合物與nanos2蛋白的結(jié)合物具有脫去RNA的polyA的活性。雖然與nanos2相結(jié)合去識(shí)別結(jié)合目的RNA的蛋白沒(méi)有找到，但我們可以推測(cè)出一種模式，就是nanos2與某個(gè)蛋白相結(jié)合去識(shí)別目的RNA，然后這個(gè)蛋白R(shí)NA復(fù)合物在與CCR4-NOT脫腺苷復(fù)合物結(jié)合托運(yùn)到P小體并在此過(guò)程中將目的RNA的polyA尾裂解掉，托運(yùn)到P小體后，目的RNA被進(jìn)一步降解。3.3 nanos2結(jié)合的目的RNA對(duì)nanos2的免疫沉淀物純化后進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示，Sycp3，Stra8，Dazl等只有在減數(shù)分裂中高水平表達(dá)的RNA在nanos2蛋白沉淀物種被特異性的檢測(cè)到了，而G3pdh，Dumt3l和Dnmt3a等在雄性生殖細(xì)胞中高度表達(dá)的mRNA在nanos2的沉淀物中并沒(méi)有特異性的。這可能是因?yàn)閚anos2的目的RNA和減數(shù)分裂有關(guān)。Nanos2蛋白復(fù)合物通過(guò)托運(yùn)降解與減數(shù)分裂有關(guān)的目的RNA而抑制生殖細(xì)胞雌性化，啟動(dòng)雄性分化程序。四討論四 小 結(jié)Nanos2是生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因子，它不僅在胚胎期PGC定植后通過(guò)抑制雌性分化程序，而且在出生后性腺中僅存在于精原干細(xì)胞中，維持著精原干細(xì)胞的自我