楓葉色素含量的季節(jié)變化測(cè)定實(shí)驗(yàn)方案.docx

。楓葉色素含量的季節(jié)性變化測(cè)定實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)原理：楓葉中的色素，當(dāng)葉子中所含的葉綠素占主導(dǎo)地位時(shí)，綠色就為主色調(diào)，抑制了其他色素展現(xiàn)本來(lái)面目。入秋后，氣溫逐漸下降，葉綠素的合成速度受阻，破壞卻與日俱增，到后來(lái)葉片中只剩下花青素、類(lèi)胡蘿卜等色素，于是它們便有機(jī)會(huì)盡情展現(xiàn)自己的如花嬌顏。另外，隨著秋季不斷降溫，尤其是霜降之后，為適應(yīng)即將到來(lái)的寒冷氣候，葉肉內(nèi)積累了較多的糖分，這些糖分經(jīng)過(guò)復(fù)雜的反應(yīng)，形成了花青素，也由此形成了秋葉變紅的重要基礎(chǔ)花青素：花青素是具有2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)的衍生物，廣泛存在于植物中的水溶性天然色素。花青素在自然狀態(tài)下常與各種單糖形成糖苷，稱(chēng)為花色苷。溶液PH不同，花色苷的存在形式也不同。對(duì)于一個(gè)給定的PH值，在花色苷的4種結(jié)構(gòu)之間存在著平衡：藍(lán)色的醌式（脫水）堿，紅色的花烊正離子，無(wú)色的甲醇假堿和查爾酮?；ㄉ赵赑H值很低時(shí)，其溶液呈現(xiàn)最強(qiáng)的紅色。隨著PH值的增大，花色苷的顏色將褪至無(wú)色，最后在高PH值時(shí)變成紫色或藍(lán)色。PH示差法測(cè)定花色苷含量的依據(jù)是花色苷發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是PH的函數(shù)，起干擾作用的褐色降解物的特性不隨PH變化。因此在花青素最大吸收波長(zhǎng)下確定兩個(gè)對(duì)花青苷吸光度差別最大但是對(duì)花色苷穩(wěn)定的PH值。根據(jù)Fuleki T經(jīng)驗(yàn)公式 花青素含量（mg/100g)=TO.D/(avE%1cm W 10); TO.D=ADVVF; A=A(pH1.0)-A(pH4.5). 其中：DV-稀釋體積；VF-稀釋倍數(shù)；W-樣品重量；A-總吸光值；avE%1cm-平均消光系數(shù) 代入數(shù)值計(jì)算：葉綠素a.b: 葉綠素是由葉綠酸、葉綠醉和甲醇組成的二醇酷，是四毗咯衍生物， 其中的葉琳環(huán)是處于二氫形式，中心的金屬原子為鎂。蔬菜中的葉綠素有葉綠素a和葉綠素b兩類(lèi)。葉綠素在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠素蛋白 質(zhì)，由多種葉綠素蛋白復(fù)合物構(gòu)成葉綠體，當(dāng)細(xì)胞死亡之后，葉綠素就游離出來(lái)。葉綠 素 是 一種不穩(wěn)定的物質(zhì).不耐光、熱、酸、不溶于水，易溶于堿、乙醉與乙醚，在堿性溶液中，皂化為葉綠素堿鹽。 葉綠素a、b在長(zhǎng)波的最大吸收峰分別在663nm、645nm，據(jù)Lamber-Beer 定律，可得濃度C與光密度D間的關(guān)系式: D663=82.04Ca +9.27Cb D645=16.75Ca +45.6Cb (濃度單位：g/mL）葉綠素a的濃度：Ca= 12.72D663 2.59D645葉綠素b的濃度：Cb= 22.88D645 4.68 D663總?cè)~綠素的濃度：Ct = 20.29D645 +8.02D663 (濃度單位：mg/L）材料與用品：楓葉提取液，乙醇95%（AR），鹽酸 儀器：PHs-3B型酸度計(jì)，紫外分光光度計(jì) 丙酮、石英砂、碳酸鈣 分光光度計(jì)、天平、剪刀、研缽、移液管、漏斗、大試管實(shí)驗(yàn)步驟：1. 花青素測(cè)定： 1，將花青素取液稀釋至一定的體積，用稀氫氧化鈉和稀鹽酸調(diào)節(jié)PH，觀(guān)察提取液在不同PH下的顏色變化。對(duì)提取液進(jìn)行200800nm全波長(zhǎng)掃描，繪制光譜圖PH1.02.0原液4.59.5溶液顏色 2.測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取楓葉花青素提取液用5%HCL-EtOH（15:85）溶液稀釋至一定體積，進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。 紫外可見(jiàn)吸收光譜 3.PH示差法中PH的選擇 在選定PH時(shí)應(yīng)考慮以下因素：在此兩個(gè)PH處測(cè)定的花青素的吸收值差異應(yīng)是最顯著的；單一PH的輕微變動(dòng)，對(duì)花青素吸光值的影響是極小的；花青素在所處的兩個(gè)PH下，應(yīng)是相當(dāng)穩(wěn)定的。由于花青素只有在酸性介質(zhì)中是穩(wěn)定的，因此只測(cè)定PH小于7條件下花青素吸光值的變化。PH為1.0時(shí)，花青素以紅色的2-苯基苯并吡喃的形式存在PH為4.5時(shí)，花青素以無(wú)色的甲醇假堿的形式存在。因此選擇PH為1.0和4.5。 4.平衡時(shí)間的確定 因?yàn)榛ㄇ嗨卦谌芤航橘|(zhì)中存在4種結(jié)構(gòu)形式，這4種結(jié)構(gòu)形式在某一PH下處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)PH改變時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生轉(zhuǎn)移，總的趨勢(shì)是PH降低時(shí)，平衡向紅色的2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子移動(dòng)；PH升高時(shí)平衡向藍(lán)色醌式移動(dòng)。一定時(shí)間后達(dá)到一個(gè)新的平衡。因此提取液用緩沖液稀釋后，必須靜置一段時(shí)間，等動(dòng)態(tài)平衡處于穩(wěn)定后，才能測(cè)定吸光值?；ㄇ嗨卦诰彌_液中的吸光度值與時(shí)間的變化關(guān)系（= nm）T（min）01020305080110PH1.0 bufferPH4.5 buffer 結(jié)果表明，花青素在緩沖液中的吸光度值隨時(shí)間變化，在PH1.0( )基本穩(wěn)定，在PH4.5時(shí)( )基本穩(wěn)定。所以綜合考慮，選擇平衡時(shí)間為 5.火棘果花青素含量的測(cè)定 移取濃縮液2ml，用5%HCL-EtOH稀釋、定容至100ml，分別移取10ml，用PH1.0和PH4.5的緩沖液稀釋至100ml，平衡（ ）min，在波長(zhǎng) 處測(cè)定吸光值。根據(jù)Fuleki T經(jīng)驗(yàn)公式 花青素含量（mg/100g)=TO.D/(avE%1cm W 10); TO.D=ADVVF; A=A(pH1.0)-A(pH4.5). 2.葉綠素a.b測(cè)定：稱(chēng)1.25g葉用丙酮研磨勻漿過(guò)濾（用80%丙酮洗研缽及殘?jiān)喜V液）濾液用80%丙酮定容至25mL適當(dāng)稀釋后測(cè)A645、A6631 取樣：稱(chēng)取1.25g剪碎的葉片（提供的樣品即為剪碎后凍于-80的葉片）放入研缽中。注意取樣時(shí)要避開(kāi)大的葉脈。2 研磨提取：向研缽中加入80%丙酮2.5ml，以及少許（約0.002g）CaCO3 (中和酸性，防止葉綠素酯酶分解葉綠素) 和石英砂，研磨成勻漿，再加入3ml 80%丙酮，繼續(xù)研磨至組織變白，在暗處?kù)o止35min后，用一層干濾紙過(guò)濾到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮將研缽洗凈，清洗液也要過(guò)濾到容量瓶中，并用80%丙酮沿濾紙的周?chē)疵撋?，待濾紙和殘?jiān)孔儼缀螅?0%丙酮定容至刻度。3 讀取吸光度：取厚度為lcm的潔凈比色皿，注意不要用手接觸比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗時(shí)要使清洗液接觸比色皿內(nèi)壁的所有部分，然后將色素提取液倒入比色皿中，液面高度約為比色皿高度的4/5，將撒在比色皿外面的溶液用濾紙吸掉（注意不能擦），再用擦鏡紙擦干擦凈。將比色皿放入儀器的比色皿架上，注意不要將溶液撒入儀器內(nèi)。第一個(gè)位置放盛有80%丙酮的比色皿，做為空白對(duì)照。將儀器波長(zhǎng)分別調(diào)至663、645nm處，以80%丙酮做為空白對(duì)照調(diào)透光率100%，分別測(cè)定溶液在上述2個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。注意，每次在轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)時(shí)，都要用80%丙酮調(diào)透光率100%。結(jié)果計(jì)算：根據(jù)Fuleki T經(jīng)驗(yàn)公式 （1）花青素含量（mg/100g)=TO.D/(avE%1cm W 10); TO.D=ADVVF; A=A(pH1.0)-A(pH4.5). 其中：DV-稀釋體積；VF-稀釋倍數(shù)；W-樣品重量；A-總吸光值；avE%1cm-平均消光系數(shù) 代入數(shù)值計(jì)算：（2） D663=82.04Ca +9.27Cb D645=16.75Ca +45.6Cb (濃度單位：g/mL） 葉綠素a的濃度：Ca= 12.72D663 2.59D645葉綠素b的濃度：Cb= 22.88D645 4.68 D663總?cè)~綠素的濃度：Ct = 20.29D645 +8.02D663 (濃度單位：mg/L） 14級(jí)生物科學(xué) 植物生理學(xué)研究性實(shí)驗(yàn)第二組 （ ）小組組員：黃志高（201407040