第五章：原生質(zhì)體培養(yǎng).ppt

CHAPTER5植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞雜交 第一節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)細(xì)胞融合 細(xì)胞雜交 第三節(jié)以原生質(zhì)體做受體的遺傳轉(zhuǎn)化 第一節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 原生質(zhì)體的概念 植物細(xì)胞原生質(zhì)體 protoplast 一詞始于Hanstein 1880 在植物學(xué)上它是指植物細(xì)胞通過(guò)質(zhì)壁分離后可以和細(xì)胞壁分開(kāi)的那部分細(xì)胞物質(zhì) 原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用 1植物育種2打破有性雜交的局限 自由雜交局限 減數(shù)分裂局限 胞質(zhì)基因局限 進(jìn)行育種3遺傳轉(zhuǎn)化4避免細(xì)胞壁上核酸酶對(duì)外源基因的破壞5利用原生質(zhì)體瞬間表達(dá)系統(tǒng)6理論研究細(xì)胞起源 細(xì)胞壁再生 質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能 核質(zhì)關(guān)系 胞間作用 激素作用機(jī)理等 一植物原生質(zhì)體研究歷史與現(xiàn)狀 1 機(jī)械法分離原生質(zhì)體時(shí)期1892年由Klercker用于從質(zhì)壁分離的Stratiotesaloides細(xì)胞分離原生質(zhì)體 隨后為Chambers和Hofler 1931 將洋蔥表皮組織的薄片浸在1 0mol L蔗糖溶液中 當(dāng)原生質(zhì)體收縮脫離壁時(shí)用快的刀片切開(kāi)表皮細(xì)胞 獲得了少量表皮細(xì)胞的原生質(zhì)體 2 酶法制備原生質(zhì)體階段 1960年英國(guó)Nottingham大學(xué)植物學(xué)系Cocking首次用纖維素酶從番茄幼苗的根分離得到原生質(zhì)體 從此開(kāi)創(chuàng)了用酶法分離植物原生質(zhì)體的時(shí)期 其后纖維素酶 半纖維素酶 果膠酶的商品化 使得實(shí)驗(yàn)室制備原生質(zhì)體成為一中常規(guī)技術(shù) 二 植物原生質(zhì)體研究進(jìn)展 1 分離方法的改進(jìn) 商品酶的出現(xiàn) 從各類(lèi)植物以及不同的器官 組織 都成功地分離到原生質(zhì)體 2 原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟 培養(yǎng)基 培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)極大地提高了培養(yǎng)的效率 現(xiàn)在常用的瓊脂糖包埋培養(yǎng) 包括瓊脂糖塊周?chē)右后w培養(yǎng)基的方法 液體淺層培養(yǎng) 使用條件培養(yǎng)基或飼喂培養(yǎng)等技術(shù) 以及發(fā)展出來(lái)的一些專(zhuān)門(mén)實(shí)用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基如KM8p V KM D2a等的廣泛使用 均極大改善了培養(yǎng)效率 3 性細(xì)胞原生質(zhì)體研究 花粉原生質(zhì)體 精子和生殖細(xì)胞 胚囊及其組成細(xì)胞分離成功 單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)成功 使人們可以嘗試在離體條件下對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行操作 發(fā)展了雌雄配子的融合技術(shù) 培養(yǎng)小麥和大麥的受精卵形成的原生質(zhì)體發(fā)育形成完整植株 利用花粉四分體原生質(zhì)體與體細(xì)胞原生質(zhì)體融合獲得三倍體雜種植株等 4 原生質(zhì)體遺傳操作 利用原生質(zhì)體導(dǎo)入外源DNA獲得轉(zhuǎn)化植物 在多種植物中獲得成功 已由大豆 杠豆 柑橘 多種蕓薹屬植物 水稻 高粱 玉米 小麥等作物獲得轉(zhuǎn)基因植物 建立起有效的葉綠體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)系統(tǒng) 植物病毒在原生質(zhì)體中增殖系統(tǒng)等 三 植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng) 一 原生質(zhì)體的分離機(jī)械法酶法影響原生質(zhì)體分離質(zhì)量因素 酶的種類(lèi)及其組合 酶液的滲透壓 原生質(zhì)膜的穩(wěn)定劑 酶解時(shí)間與溫度 分離與純化的方法等 1 材料的選擇 要獲得產(chǎn)量高 質(zhì)量好且容易分裂的原生質(zhì)體 就要注意用于制備原生質(zhì)體的起始材料的特性和生理狀態(tài) 茄科植物一般選擇生長(zhǎng)旺盛 生理狀態(tài)一致的剛展開(kāi)的幼嫩葉片分離原生質(zhì)體 十字花科植物 一般認(rèn)為是從種子萌發(fā)4 5天的無(wú)菌苗下胚軸分離原生質(zhì)體 得率高 活力強(qiáng) 再生頻率高 豆科用未成熟種子胚的子葉較好 對(duì)禾本科植物 從幼胚 幼穗 花藥或成熟胚建立胚性愈傷組織及其胚性懸浮細(xì)胞系分離原生質(zhì)體有利于其后的再生 2 酶制劑 植物的細(xì)胞壁主要由纖維素 半纖維素和果膠質(zhì)構(gòu)成 一般而言 纖維素約占細(xì)胞壁干重的25 50 不等 半纖維素約占細(xì)胞壁干重的53 左右 果膠質(zhì)一般約占細(xì)胞壁的5 左右 雙子葉植物的葉片 需用纖維素酶和少量果膠酶愈傷組織細(xì)胞及其懸浮細(xì)胞除用纖維素酶外 還需用較多的果膠酶 有些材料還需加入半纖維素酶 花粉小孢子壁除含有纖維素 果膠質(zhì)外 還有胼胝質(zhì) 分解時(shí)需用蝸牛酶或胼胝質(zhì)酶 3 滲透壓的穩(wěn)定劑 酶液 洗液和培養(yǎng)液中滲透壓應(yīng)和原生質(zhì)體內(nèi)的相同或接近 滲透壓略大些有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定 過(guò)大會(huì)使原生質(zhì)體收縮并阻礙原生質(zhì)體的啟動(dòng)分裂 廣泛使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑使甘露醇和山梨醇 蔗糖 葡萄糖和麥芽糖 其濃度約在0 4 0 6mol L 加入CaCl2 KH2PO4 葡聚糖硫酸鉀都可以提高原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性 增加完整的原生質(zhì)體數(shù)目和活力 葡聚糖硫酸鉀是通過(guò)降低酶液中核糖核酸酶活性 而有利于原生質(zhì)膜的穩(wěn)定 4 酶解處理 酶解植物材料處理 表面滅菌 材料分割 酶的用量 植物材料應(yīng)按比例和酶液混合才能有效地分離原生質(zhì)體 一般葉片 子葉切條和下胚軸切片需酶量少 而胚性愈傷組織和胚性懸浮細(xì)胞則用酶量大 滲透劑的選擇 小麥和水稻胚性懸浮細(xì)胞 用葡萄糖作滲透劑優(yōu)于甘露醇酶解條件 PH值 時(shí)間 溫度 5 原生質(zhì)體的純化 沉降法 用過(guò)濾和離心相結(jié)合的方法 漂浮法 采用較原生質(zhì)體比重大 滲透壓高的溶液 使原生質(zhì)體浮于溶液的表面的 這種方法可以收集較純的原生質(zhì)體 但原生質(zhì)體數(shù)量上損失較多 也往往因采用高滲溶液而對(duì)原生質(zhì)體有害 界面法 利用兩種比重不同的溶液 使健康和完整的原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中 這種方法能使細(xì)胞碎片和細(xì)胞器逐漸清除 并可獲得更純凈的原生質(zhì)體 6 原生質(zhì)體的活力鑒定 1 細(xì)胞壁染色法 熒光增白劑對(duì)植物細(xì)胞壁是一種最優(yōu)越的染料 不僅可鑒定細(xì)胞壁是否完全除盡 而且可檢查原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中壁的再生 細(xì)胞壁與染料形成顯眼的綠色熒光 沒(méi)有細(xì)胞壁的則無(wú)熒光反應(yīng) 略帶紅色 2 原生質(zhì)體活性鑒定 短時(shí)間內(nèi)測(cè)定活力有多種方法 如觀察胞質(zhì)環(huán)流作為旺盛代謝指標(biāo) Evans藍(lán)活性染色 測(cè)定光合活性 用氧電極法測(cè)定氧呼吸 用熒光素雙醋酸酯 FDA 等 二 原生質(zhì)體培養(yǎng) 1 培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)與組織及細(xì)胞培養(yǎng)類(lèi)同 原生質(zhì)體與細(xì)胞的主要差別是除去了細(xì)胞壁 所用培養(yǎng)基一般是加以改良的培養(yǎng)基 如KM8p和K8p培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ) NT培養(yǎng)基則以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ) 禾谷類(lèi)植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)基多數(shù)是以MS Du N6 KM AA為基本培養(yǎng)基 十字花科和豆科植物則多數(shù)以B5 KM8p K8p KM為基本培養(yǎng)基 茄科植物以MS NT K3為基本培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)基中需有一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑 2 培養(yǎng)方法 固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)固液結(jié)合培養(yǎng)念珠培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng) A 固體培養(yǎng)法 平板法 將純化后懸浮在液體培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體懸浮液與熱融并冷至45 的含瓊脂或瓊脂糖或Gelrite的培養(yǎng)基等量混合 并迅速輕輕搖動(dòng) 使原生質(zhì)體均勻分布于培養(yǎng)基中 待凝結(jié)后 將容器倒置于四周墊有保濕紙或含水海綿的培養(yǎng)皿內(nèi) 封口 由于原生質(zhì)體被彼此分開(kāi)并固定了位置 這種方法避免了細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的影響 并便于定點(diǎn)觀察 有利于追蹤單個(gè)原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁的發(fā)育過(guò)程 B 液體培養(yǎng)法 將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中 最常用的是液體淺層培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法 C 固液結(jié)合培養(yǎng)法 最為簡(jiǎn)便的固液結(jié)合培養(yǎng)法為雙層培養(yǎng)法 即在培養(yǎng)皿的底部先鋪一薄層含瓊脂或瓊脂糖或Gelrite固體培養(yǎng)基 含或包含原生質(zhì)體或細(xì)胞 再在其上進(jìn)行印刷體的液體淺層培養(yǎng) 這種培養(yǎng)方式有利于固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分 或細(xì)胞代謝物 可以慢慢地向液體中釋放 以補(bǔ)充培養(yǎng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消耗 同時(shí)培養(yǎng)物所產(chǎn)生的一些有害物質(zhì) 可被固體部分吸收 對(duì)培養(yǎng)物生長(zhǎng)更有利 念珠培養(yǎng)法 Shillito等建立了一種 念珠培養(yǎng)法 將含有原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基切成塊放到大體積的液體培養(yǎng)基中 并在旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩以利于通氣 使用大體積的液體是為了防止瓊脂糖塊過(guò)度破碎 看護(hù)培養(yǎng)法 看護(hù)培養(yǎng)法是固液雙層法的引申 將水稻或玉米懸浮細(xì)胞包埋于瓊脂或瓊脂糖的培養(yǎng)基中 在其上鋪聚脂纖維或硝酸微孔濾膜 將含水稻或玉米原生質(zhì)的液體培養(yǎng)基置于其上進(jìn)行培養(yǎng) 采用看護(hù)培養(yǎng)法在水稻和玉米中 都證明看護(hù)細(xì)胞有促進(jìn)原生質(zhì)體生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的作用 3 培養(yǎng)條件 原生質(zhì)體培養(yǎng)前的熱激處理和超低溫處理可提高原生質(zhì)體植板率 去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體 在培養(yǎng)初期極其脆弱 由于光 溫 濕度等條件的不適往往會(huì)引起培養(yǎng)基成分及滲透壓的變化 影響原生質(zhì)體正常生長(zhǎng)發(fā)育 一般對(duì)于葉肉 子葉 下胚軸等帶有葉綠體的原生質(zhì)體 在培養(yǎng)初期最好置于弱光或漫射光下 由愈傷組織和懸浮細(xì)胞脫壁的原生質(zhì)體應(yīng)避免光照置于暗中培養(yǎng) 培養(yǎng)溫度一般為25 30 隨種而異 二 由原生質(zhì)體再生植株 分離的植物原生質(zhì)體在合適的培養(yǎng)條件下 可以再生形成植株 1971年首次由煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株成功后 現(xiàn)通過(guò)原生質(zhì)體培養(yǎng)形成芽或胚狀體 進(jìn)而再生植株的植物種類(lèi)已達(dá)367種 分布于46科 160屬 成功的種最多的是茄科 隨后依次為豆科 禾本科 菊科 十字花科 傘形科和薔薇科 1 原生質(zhì)體培養(yǎng)中的再生過(guò)程 由植物原生質(zhì)體培養(yǎng)再生完整植株 經(jīng)歷了由細(xì)胞壁的再生 細(xì)胞分裂 細(xì)胞團(tuán)和愈傷組織的形成以及植株再生等幾個(gè)不同的階段 2 原生質(zhì)體再生植株形成的途徑 1 器官形成途徑 1 原生質(zhì)體培養(yǎng)基 2 分化培養(yǎng)基 3 生根培養(yǎng)基 2 胚胎發(fā)生途徑 通過(guò)胚胎發(fā)生途徑再生植株的植物種類(lèi) 多集中在禾本科 傘形科 蕓香科 葫蘆科和豆科中 還有裸子植物的松科 3 原生質(zhì)體再生植株的遺傳特性原生質(zhì)體再生植株往往在形態(tài)和性狀方面出現(xiàn)變異 如出現(xiàn)白化苗 玻璃苗 葉發(fā)生變異 性別 育性及發(fā)育期等發(fā)生變異 除形態(tài)和性狀發(fā)生變異外 染色體的倍性和數(shù)目也常常發(fā)生變化 造成變異的原因是多方面的 一種是分離原生質(zhì)體的材料本身所存在的 這在使用長(zhǎng)期無(wú)性繁殖的植物材料時(shí)更易發(fā)生 另一方面更重要的原因可能在于原生質(zhì)體操作本身引起的 原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體純化原生質(zhì)體培養(yǎng)胞壁再生細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)再生植株 小結(jié) 第二節(jié)原生質(zhì)體融合和細(xì)胞雜交 細(xì)胞融合 細(xì)胞雜交 兩種異源 種 屬間 原生質(zhì)體 在誘導(dǎo)劑誘發(fā)下相互接觸 從而發(fā)生膜融合 胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞 進(jìn)一步發(fā)育成雜種植物體 稱(chēng)為細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交 一 細(xì)胞融合的類(lèi)型 第一類(lèi)最常用的即體細(xì)胞雜交 用雙親的體細(xì)胞原生質(zhì)體或其衍生系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)融合 再經(jīng)培養(yǎng) 篩選 鑒定等步驟得到細(xì)胞雜種 第二類(lèi)是配子間細(xì)胞雜交 即用雙親的性細(xì)胞原生質(zhì)體為融合親本 其他步驟同第一類(lèi) 第三類(lèi)是配子 體細(xì)胞雜交 即一個(gè)融合親本為性細(xì)胞原生質(zhì)體 另一個(gè)為體細(xì)胞原生質(zhì)體 目前工作仍以體細(xì)胞雜交為多 其他兩類(lèi)開(kāi)始有些報(bào)道 1 體細(xì)胞雜交常規(guī)細(xì)胞雜交是用雙親脫去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體來(lái)進(jìn)行的 經(jīng)誘導(dǎo)融合 篩選和鑒定 然后得到細(xì)胞雜種 由于原生質(zhì)體具有各自親本的全部遺傳信息 如果雜交組合是近緣而親和的 則通過(guò)細(xì)胞雜交可以得到具有雙親所有遺傳信息的細(xì)胞雜種 他們是對(duì)稱(chēng)的細(xì)胞雜種 雙親都是二倍體原生質(zhì)體則可以得到雙二倍體 雙親都是單倍體的可以得到雙單倍體 細(xì)胞融合的過(guò)程 膜融合胞質(zhì)融合核融合 植物體細(xì)胞雜交 過(guò)程示意圖 2 不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞雜交 除了用雙親完整的原生質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)融合外 也有用一個(gè)親本的原生質(zhì)體與另一親本原生質(zhì)體的衍生系統(tǒng)如 原生質(zhì)體與胞質(zhì)體原生質(zhì)體與核質(zhì)體甘藍(lán)白化苗下胚軸胞質(zhì)體和甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合得到胞質(zhì)雜種 3 體細(xì)胞與性細(xì)胞雜交 性細(xì)胞原生質(zhì)體融合以及體細(xì)胞原生質(zhì)與性細(xì)胞原生質(zhì)體融合 早已引起人們的注意 但由于性細(xì)胞原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)存在技術(shù)上的問(wèn)題 這方面的進(jìn)展十分緩慢 近年來(lái) 由于制備分離精細(xì)胞原生質(zhì)體與卵細(xì)胞原生質(zhì)體取得成功 使在離體培養(yǎng)條件下探索受精作用有了可喜結(jié)果 4 微細(xì)胞雜交 在哺乳動(dòng)物和人類(lèi)的細(xì)胞生物學(xué)或細(xì)胞工程研究中 常采用微細(xì)胞雜交 microcellhybridization 法 轉(zhuǎn)移單個(gè)完整的染色體以建立單體或多體的 染色體雜種 這種方法也已開(kāi)始在植物中應(yīng)用 其步驟是先用一些處理來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞中形成高頻率的微核 然后再分離和制備具有此微核的原生質(zhì)體 也有人稱(chēng)之為微原生質(zhì)體 將微原生質(zhì)體作為誘導(dǎo)融合的親本進(jìn)行細(xì)胞雜交 這樣的細(xì)胞雜交就是微細(xì)胞雜交 二 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法及融合劑 自發(fā)融合用酶法分離原生質(zhì)體時(shí) 常?？梢钥吹酵N原生質(zhì)體的聚集現(xiàn)象 稱(chēng)為同源自發(fā)融合 這種融合是發(fā)生在親本之一的自身 也稱(chēng)為自體融合 誘導(dǎo)融合加入融合劑有目的的誘導(dǎo)的融合 以融合劑劃分為 鹽類(lèi)融合法高鈣 高pH融合法聚乙二醇融合法聚乙二醇結(jié)合高鈣 高pH法 鹽類(lèi)融合法以硝酸鹽類(lèi) 硝酸鈉 硝酸鉀 硝酸鈣 氯化物類(lèi) 氯化鈉 氯化鈣 氯化鎂 氯化鋇 和葡聚糖硫酸鹽類(lèi) 葡聚糖硫酸鉀 葡聚糖硫酸鈉 為融合劑 對(duì)原生質(zhì)體活力破壞小 但融合頻率低 對(duì)液泡化的原生質(zhì)體不易誘發(fā)融合 高鈣和高pH值融合法用較高濃度的鈣離子和較高的pH值促進(jìn)細(xì)胞融合 PEG法以PEG為融合劑PEG結(jié)合高鈣 高pH值法上面兩種方法相結(jié)合提高融合率 三 細(xì)胞融合程序 雙親原生質(zhì)體制備分離 純化和培養(yǎng)原生質(zhì)體融合融合方法細(xì)胞雜種選擇選擇方法植株再生再生方式 培養(yǎng)基選擇雜種植株鑒定形態(tài) 細(xì)胞和分子鑒定 四 融合體的類(lèi)型 雙親原生質(zhì)體融合時(shí) 首先發(fā)生膜融合 胞質(zhì)融合 最后發(fā)生核融合 由于融合的情況不同 可分為 自體融合 和 異體融合 兩大類(lèi) 自體融合得到 同核體 異體融合得到 異核體 親本原生質(zhì)體ABA AB BA B對(duì)稱(chēng)細(xì)胞雜種不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞雜種異胞質(zhì)細(xì)胞雜種嵌合細(xì)胞雜種 五 細(xì)胞雜種選擇和鑒定 1 選擇意義淘汰雙親原生質(zhì)體 僅異核體能存活 保證異核體分裂 分化和形成細(xì)胞雜種 2 選擇方法互補(bǔ)選擇法白化互補(bǔ)遺傳互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)代謝互補(bǔ)可見(jiàn)標(biāo)記選擇法 3 鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定以親本為對(duì)照 進(jìn)行形態(tài)特征 特性分析細(xì)胞學(xué)鑒定核型分析 顯帶技術(shù)等分子鑒定分子標(biāo)記 同工酶 RAPD AFLP SSR等技術(shù) 第三節(jié)以原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化 植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化 指利用離體培養(yǎng)的植物組織 細(xì)胞及原生質(zhì)體作為受體 通過(guò)某種途徑和技術(shù)將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞 獲得能使外源基因穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的技術(shù) 一 利用原生質(zhì)體導(dǎo)入外源基因的方法 最為常用的有PEG法 電擊法和脂質(zhì)體法 一 PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法PEG即聚乙二醇 為高分子多聚物 最初用作原生質(zhì)體的融合劑 PEG的作用一是粘合細(xì)胞 二是擾亂粘合膜的磷脂雙層膜 1 植物的品種 原生質(zhì)體的質(zhì)量及原生質(zhì)體再生形態(tài)的頻率 2 外源基因的濃度和構(gòu)象 3 攜帶DNA 最常用的是小牛胸腺DNA 它可以提高基因轉(zhuǎn)化頻率 并且這種作用不能被質(zhì)粒DNA完全代替 4 PEG溶液 隨濃度升高 轉(zhuǎn)化頻率一般首先增大 達(dá)到最大值后再逐漸減小 PEG溶液的pH值也影響轉(zhuǎn)化頻率 5 加入DNA和PEG的先后順序 先加DNA 可提高轉(zhuǎn)化頻率 6 轉(zhuǎn)化介質(zhì)中兩價(jià)陽(yáng)離子的種類(lèi)和濃度 Mg2 比Ca2 轉(zhuǎn)化頻率高 7 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選方法 何時(shí)加何種抗生素也影響轉(zhuǎn)化頻率 8 其它 原生質(zhì)體的熱激預(yù)處理 低劑量X 射線照射可提高轉(zhuǎn)化頻率等 影響轉(zhuǎn)化頻率的因素主要有 特點(diǎn) 1 實(shí)驗(yàn)成本低 結(jié)果穩(wěn)定 重復(fù)性較好 不需要特殊儀器設(shè)備 易于推廣 2 兩個(gè)非連鎖基因的共轉(zhuǎn)化頻率可以達(dá)到50 甚至更高 3 用其它植物的基因組總DNA進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化頻率與用質(zhì)粒DNA相近 這說(shuō)明PEG法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化不一定需要克隆的基因和特定的載體 為轉(zhuǎn)移抗之?dāng)?shù)量性狀的基因 和在缺乏合適篩選標(biāo)記條件下進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化也是可能的 4 其局限性在于 以裸露的原生質(zhì)體作基因受體 必須首先建立可靠高效的原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 這對(duì)大多數(shù)農(nóng)作物 尤其是禾谷類(lèi)還是很大的一個(gè)問(wèn)題 二 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 原理 脂質(zhì)體 liposome 是一種磷脂 磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨 膽甾醇和脂肪酸等脂類(lèi)分子組成的球形雙層膜囊結(jié)構(gòu) 可將DNA RNA等大分子物質(zhì)包在脂質(zhì)體內(nèi) 免受細(xì)胞內(nèi)源核酸酶的降解作用 同時(shí)在PEG的作用下 可以更有效地導(dǎo)入受體植物的原生質(zhì)體 缺點(diǎn) 在植物中始終未發(fā)現(xiàn)一種既能與外源DNA分子高效結(jié)合 又能較好地