化驗(yàn)技術(shù)協(xié)會(huì)第九期培訓(xùn)資料.doc

*化驗(yàn)技術(shù)協(xié)會(huì)第九期培訓(xùn)資料（微生物檢定工）*微生物菌種的使用、保存與管理、驗(yàn)證 微生物菌種的使用、保存與管理是微生物檢驗(yàn)室的一項(xiàng)重要工作，檢驗(yàn)室必須保藏一批形態(tài)、生物化學(xué)、血清學(xué)特性穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株，以便用于中國(guó)藥典規(guī)定的無(wú)菌檢查、微生物限度檢查、抗生素微生物(效價(jià))測(cè)定及測(cè)定、評(píng)價(jià)防腐劑和抗菌劑的抗菌效果，以及確認(rèn)滅菌工藝的效果、檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證、培養(yǎng)基的促菌生長(zhǎng)能力(靈敏度)、樣品檢驗(yàn)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照等許多的檢測(cè)工作中。因此，菌種是微生物實(shí)驗(yàn)使用頻率最高的對(duì)照物質(zhì)，相當(dāng)于在化學(xué)或者儀器分析中使用的標(biāo)準(zhǔn)品。微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)菌種的管理除了與化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品一致的管理要求外，還因微生物的特性有一些特殊的要求。菌種是活的微生物，在菌種的使用保藏過(guò)程中需定期傳代，并防止變異；因此，菌種保藏和傳代是微生物檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)重要技術(shù)。不然的話，因菌種管理不善，將會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)很大的差異，給生產(chǎn)帶來(lái)重大影響。下面分述有關(guān)事項(xiàng)。 (一)制定菌種使用、保藏管理程序 微生物檢定室應(yīng)制定出本室菌種的使用、保藏管理規(guī)程來(lái)規(guī)范菌種的來(lái)源、申購(gòu)、使用、保管、接種傳代、存儲(chǔ)和領(lǐng)用等方面的要求，確保菌種溯源性和穩(wěn)定性；防止試驗(yàn)用菌種因使用過(guò)程中多次傳代而失去典型生物學(xué)特征發(fā)生變異或死亡，保證菌種長(zhǎng)期正確、穩(wěn)定，從而確保實(shí)驗(yàn)的靈敏度和重現(xiàn)性。 1做好菌種的來(lái)源登記，確保溯源性清楚 制藥行業(yè)微生物檢驗(yàn)用的標(biāo)準(zhǔn)菌株主要來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心(China Medical Culture Collection，CMCC)的系列，或美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)系列等國(guó)際法定菌種保藏機(jī)構(gòu)。此外還有來(lái)自其他保藏單位或同行相互轉(zhuǎn)讓的有關(guān)菌種。由中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌種的標(biāo)簽CMCC(B)代表細(xì)菌(bacteria)，CMCC(F) 代表真菌(fungi)。每種菌種都具有固定的編號(hào)，如金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、生孢梭菌CMCC(B)64941、白色念珠菌CMCC(F)98001、大腸桿菌CMCC(B)44102、沙門(mén)菌CMCC(B)50094、銅綠假單胞菌CMCC(B)10104等。無(wú)論來(lái)自何處的菌種，一定要保存好菌種溯源性的原始記錄。接著就可進(jìn)行下一步工作。 2菌種的接收與復(fù)活 從菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)的原始菌種管是玻璃安瓿裝的凍干粉劑，同時(shí)隨菌種附有相關(guān)資料。菌種購(gòu)到實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)按安瓿的數(shù)量和名稱和每一支安瓿的完整性在相應(yīng)的菌種接收記錄上記上所購(gòu)菌種的信息，如名稱、數(shù)量和接收日期等。將安瓿貼好標(biāo)簽并儲(chǔ)存于-20，直到需要時(shí)使用。一般安瓿凍干品可在5年之內(nèi)使用。 原始菌種使用時(shí)，首先需復(fù)活凍干菌種，按(菌種保藏中心提供的)相關(guān)資料的要求進(jìn)行復(fù)溶、培養(yǎng)和保存。一般包括以下幾個(gè)步驟： (1)冷凍菌種的復(fù)活 清潔安瓿(可用75的乙醇)后，用砂輪在安瓿的上部劃線，將安瓿掰開(kāi)。用一無(wú)菌吸管吸取1-2ml適量的液體培養(yǎng)基（生孢梭菌用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯；白色念珠菌、黑曲霉菌用液體真菌培養(yǎng)基)滴加到安瓿中，輕輕旋轉(zhuǎn)安瓿使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解，再將安瓿內(nèi)的菌液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的培養(yǎng)基試管中，根據(jù)菌種類(lèi)型將其放入適宜的培養(yǎng)條件(細(xì)菌培養(yǎng)溫度32.52.5，18-24h；真菌培養(yǎng)溫度25.52.5，3-5d)下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基是否渾濁，渾濁說(shuō)明菌種復(fù)活生長(zhǎng)(如不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7d天以上，真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至14d以上，仍不渾濁，按相關(guān)規(guī)定滅菌處理，并且丟棄之前應(yīng)滅菌處理并詳細(xì)記錄)。在應(yīng)用前，還應(yīng)確認(rèn)菌種的純度和特性。 (2)菌種確認(rèn) 用無(wú)菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板(營(yíng)養(yǎng)瓊脂、大豆胰蛋白胨瓊脂)上或相應(yīng)的細(xì)菌鑒別平板(如伊紅亞甲藍(lán)、麥康凱、十六烷基三甲胺、甘露醇高鹽)上劃線分離單個(gè)菌落，置適宜條件下培養(yǎng)(若該類(lèi)微生物為厭養(yǎng)菌，則培養(yǎng)條件應(yīng)為厭養(yǎng)條件)。以同樣方法取真菌和酵母菌培養(yǎng)物至SDA(薩布羅培養(yǎng)基)平板上或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基平板上，23-28下培養(yǎng)7d；培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落狀態(tài)，然后挑取單一的純菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特征及菌體形態(tài)，并進(jìn)一步做生化鑒定實(shí)驗(yàn)以確定菌種。也可使用API鑒定系統(tǒng)做鑒定。對(duì)已鑒定確認(rèn)的菌種進(jìn)行菌種傳代和保藏。 (3)污染處理 假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長(zhǎng)，則說(shuō)明操作有污染或菌種不純。要將該污染培養(yǎng)物做滅菌處理，尋找原因，重新分離挑選純菌落。 (二)嚴(yán)格控制菌種的傳代，做好保藏工作 中國(guó)藥典(2005年版)做出“菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代)”的明確規(guī)定。另外我國(guó)GMP認(rèn)證中對(duì)傳代次數(shù)也有要求，要按照實(shí)驗(yàn)室制定的菌種使用與管理規(guī)程進(jìn)行傳代與保藏。各個(gè)微生物實(shí)驗(yàn)室放棄傳統(tǒng)單一的斜面?zhèn)鞔４娣?，用?jiǎn)便易行的方法來(lái)傳代保藏，保證菌種的長(zhǎng)期有效，避免頻繁購(gòu)買(mǎi)菌種及復(fù)壯等費(fèi)時(shí)、耗力的工作。 微生物菌種的傳代保藏過(guò)程： 1復(fù)溶菌種并轉(zhuǎn)種 按菌種說(shuō)明書(shū)要求復(fù)溶所轉(zhuǎn)菌種并轉(zhuǎn)接于適當(dāng)?shù)脑鼍囵B(yǎng)基內(nèi)(F1)，經(jīng)復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，適溫培養(yǎng)一定時(shí)間，分離出單個(gè)純種菌落，此為第2代(F2)。 2鑒定菌種后制甘油冷凍管 經(jīng)菌種特性鑒定后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，同時(shí)挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時(shí)，保藏菌種為第2代(F2)，但工作用菌種則為第3代(F3)。 3將第2代(F2)菌種管冷凍保存，將工作用菌(F3)以適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后可用于試驗(yàn)。 4取1支冷凍保存的F2代種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的菌種制成冷凍包藏管第3代(F3)斜面培養(yǎng)基，經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用作工作用菌種(F3)。 5將第3代菌種(F3)冷凍或低溫保存，將生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)種后的F2菌種經(jīng)滅菌處理后丟棄。 6當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如F3可直接轉(zhuǎn)接為F4。 7按上述程序操作，直至F4轉(zhuǎn)為F5為止，需重新開(kāi)啟安瓿，再重復(fù)上述操作程序，保藏和使用菌種。圖3-1菌種的傳代保藏方法與工作用菌種示意 圖31所表示的菌種傳代保藏方法能滿足這個(gè)要求，在這個(gè)方法中，菌種被分為兩類(lèi)，傳代用菌種和工作用菌種，傳代用菌種用甘油冷凍管法或試管熔封法保藏，工作用菌種用斜面低溫保藏法保藏。實(shí)驗(yàn)證明，甘油冷凍管的有效期至少為兩年，而試管熔封法保藏至少為2-3年，按圖31所示，最早的甘油冷凍管代數(shù)為第2代(F2)，以每個(gè)兩年轉(zhuǎn)接一次計(jì)算，轉(zhuǎn)至第4代時(shí)(F4)，需耗時(shí)6年，即1支凍干管內(nèi)提供的菌種，按照此方法保藏使用可在6年內(nèi)為整個(gè)實(shí)驗(yàn)室提供有效菌種，從而使菌種傳代和保藏工作大大簡(jiǎn)化。但是，這種方法主要使用于細(xì)菌、酵母菌的傳代、保藏，對(duì)真菌和芽孢類(lèi)細(xì)菌則需應(yīng)用其他方法。 (三)常用菌種保藏方法 眾所周知，微生物具有容易培養(yǎng)易于變異的特點(diǎn)，因此必須采用合適方法保藏菌種。菌種保藏最基本的原理是：創(chuàng)建一些不利于其生長(zhǎng)繁殖的條件，使其代謝與生長(zhǎng)處于最不活躍或相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，從而在一定時(shí)間內(nèi)不發(fā)生變異并保持生命活力。一般來(lái)說(shuō)低溫、干燥或缺乏營(yíng)養(yǎng)、隔絕空氣(厭氧)對(duì)好氧微生物而言是使微生物代謝能力降低的重要因素和條件，菌種保藏方法都是依據(jù)這些因素制定的。下面介紹幾種簡(jiǎn)便而又實(shí)用的菌種保藏方法，一般條件的實(shí)驗(yàn)室都可以實(shí)施。 1甘油冷凍管保藏法 其保藏原理是低溫或缺乏營(yíng)養(yǎng)。方法是將待保藏菌接種至平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間后(細(xì)菌需要24-48h的培養(yǎng)物，酵母菌需要72h的培養(yǎng)物，形成孢子的微生物則宜保藏孢子，放線菌和絲狀真菌則應(yīng)培養(yǎng)710d)，用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過(guò)接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無(wú)菌蒸餾水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于麥?zhǔn)媳葷峁艿?0號(hào)管，向已制備好的菌懸液中加入等體積、濃度為20的無(wú)菌甘油，得到10甘油菌懸液。注意甘油濃度不宜過(guò)高，否則會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞滲透壓，引起細(xì)菌死亡。輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無(wú)菌小試管，制好的甘油冷凍管最好在-30條件下貯存，從冷凍之日起一般可保存2年。該保藏管制法簡(jiǎn)單，保存不占太多位置。但是在制作過(guò)程中，應(yīng)注意使用純菌懸液而不是含有培養(yǎng)基的增菌液，這樣可保證不帶入培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分；同時(shí)菌液濃度要達(dá)到10，以防止在長(zhǎng)時(shí)間保存中不至于因自然死亡后造成菌數(shù)下降過(guò)量。保存厭氧菌和霉菌不宜采用該法。 2試管熔封(密封)保藏法 其保藏原理是低溫或缺乏營(yíng)養(yǎng)與隔絕空氣。筆者曾采用試管熔封法，室溫與冰箱條件下保存十多種細(xì)菌菌種，該法簡(jiǎn)便實(shí)用，效果很好。現(xiàn)推薦介紹如下： 用各種瓊脂斜面(普通肉湯等)常規(guī)滅菌后，經(jīng)接種，室溫培養(yǎng)24-48h后，將接種菌生長(zhǎng)旺盛的試管用噴燈將其管口熔封，分別置室溫和冰箱下保存。到使用時(shí)，用砂輪在管口劃一圈，并在乙醇燈下火焰滅菌后敲開(kāi)管口即可轉(zhuǎn)接到另一斜面上。由于試管經(jīng)熔封后，可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又可減緩細(xì)菌的代謝速度，并能防止雜菌污染。經(jīng)試驗(yàn)此法可用來(lái)保存金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、藤黃微球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣桿菌、副傷寒桿菌、沙門(mén)桿菌sp，銅綠假單胞菌、枯草桿菌、短小芽孢桿菌、膠冰樣芽孢桿菌。室溫保存期最長(zhǎng)達(dá)3年，特別是適宜保存一些因培養(yǎng)物陳舊極易死亡的銅綠假單胞菌。該法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單方便，不易污染，適應(yīng)面廣，轉(zhuǎn)種容易，成本低。由于熔封后，隔絕氧氣，隔絕雜菌污染。經(jīng)保存后細(xì)菌生物學(xué)性狀良好，形態(tài)、G染色及各種色素，生化反應(yīng)特性不變，故是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便實(shí)用的有效保存方法。 密封法保藏將需保藏菌種按無(wú)菌操作要求接種至固體培養(yǎng)基(細(xì)菌采用肉湯瓊脂、酵母采用蔡氏培養(yǎng)基、放線菌采用高氏1號(hào)培養(yǎng)基)上，經(jīng)適溫培養(yǎng)后(細(xì)菌1-2d，芽孢菌、放線菌5-7d，酵母菌3d)，塞緊棉花塞，放在干燥器內(nèi)，干燥器密封處涂上凡士林，蓋緊后使之與真空泵相連接。開(kāi)動(dòng)真空泵抽真空30min至1h(此時(shí)真空度約為640)，關(guān)閉密封口，拔出膠塞，置于室溫下保存。待使用時(shí)，打開(kāi)蓋，取出菌種，接種至培養(yǎng)基上即可。筆者經(jīng)試驗(yàn)保存17個(gè)月后，培養(yǎng)基未見(jiàn)干枯，僅有少部分試管的瓊脂斜面有開(kāi)裂口現(xiàn)象。經(jīng)實(shí)驗(yàn)本法適宜保存大腸埃希菌、副傷寒菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、磷細(xì)菌、酵母21189、酵母211190等10種微生物。但此法不適宜保存銅綠假單胞菌、谷氨酸發(fā)酵菌(T613)。實(shí)踐證明，此法具有簡(jiǎn)便實(shí)用的特點(diǎn)，值得試用。 3液體石蠟覆蓋保藏法 此法是傳代培養(yǎng)的變相方法，可適當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間，將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，然后，無(wú)菌操作，在層流臺(tái)下用無(wú)菌吸管吸取無(wú)菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm，將試管直立，置于2-8冰箱中或室溫下保存。需要指出的是，有些菌種在室溫下比在冰箱保存的時(shí)間還要長(zhǎng)，如銅綠假單胞菌。覆蓋在菌種表面的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡；另一方面可阻止氧氣進(jìn)入以減弱菌種代謝作用。此法制備簡(jiǎn)單，不需要其他特殊設(shè)備，并且效果也好，用此法保藏霉菌、放線菌、芽孢桿菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般無(wú)芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右，且不需要經(jīng)常移種。但是此法的缺點(diǎn)是保存時(shí)必須是直立放置，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶；從液體石蠟下面取培養(yǎng)物接種時(shí)，當(dāng)接種環(huán)在火焰上灼燒時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意或是使用一次性無(wú)菌接種環(huán)。 4斜面低溫保藏法 此法為實(shí)驗(yàn)室工作用菌種的最常用的保藏方法，操作簡(jiǎn)單，使用方便，不需特殊設(shè)備。操作時(shí)，將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌生長(zhǎng)充分以后，轉(zhuǎn)移至2-8冰箱中保藏。保藏時(shí)間依微生物的種類(lèi)而有所不同，霉菌、放線菌及芽跑菌保存24個(gè)月，移種1次；酵母菌2個(gè)月移種次，細(xì)菌最好每月移種1次。此法的缺點(diǎn)是菌種容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，傳代過(guò)多會(huì)使微生物的性狀和代謝發(fā)生變異，在傳代過(guò)程中，污染各種雜菌的機(jī)會(huì)也較多。因此，此法僅能用于工作用菌種的短期保藏，并應(yīng)隨時(shí)檢查是否污染雜菌和變異等情況，傳代代數(shù)超過(guò)5代的菌種應(yīng)滅菌處理后拋棄。 5芽孢液保藏法 對(duì)于產(chǎn)芽孢的微生物可以收集芽孢，制成芽孢菌懸液后保藏。其原理是利用芽孢抗性強(qiáng)的自然特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行保存，制備方法如下： 無(wú)菌操作，分別將微生物孢子液適量接入適合芽孢生長(zhǎng)的茄型瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，使菌液均勻分布于培養(yǎng)基表面。在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)27d或更長(zhǎng)時(shí)間以能達(dá)到50以上的芽孢，這樣可確保得到濃度較高的芽孢懸浮液。如需較長(zhǎng)時(shí)間或較高溫度(55)培養(yǎng)，最好將培養(yǎng)皿進(jìn)行適當(dāng)密封，以免培養(yǎng)基失水干裂，培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺(tái)下，取3.0-5.0ml氯化鈉磷酸鹽緩沖液(pH7NaClPBS)加入培養(yǎng)后的各個(gè)集菌培養(yǎng)皿內(nèi)。用無(wú)菌玻璃L棒在瓊脂表面輕輕刮下菌苔，注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)墓。傾斜培養(yǎng)皿，使菌懸液集中于培養(yǎng)皿一端，用無(wú)菌注射器或無(wú)菌吸管吸取菌懸液，收集到大小合適，便于封口的無(wú)菌西林瓶或試管中。再將芽孢液放在80-90水浴中加熱15min(目的殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞)冷卻。按菌種保藏標(biāo)簽規(guī)范貼上標(biāo)簽和做好標(biāo)記，然后放至28冰箱中保藏，可保存1年。每次使用該原始菌液時(shí)，不論直接使用或用其配置工作菌液，都應(yīng)事先用平皿法重新標(biāo)定其濃度，前一次標(biāo)定濃度僅供參考。 以上實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常用的簡(jiǎn)單易行的菌種保藏方法，無(wú)論使用哪種方法，都應(yīng)對(duì)所采用的保存方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確保在相應(yīng)保存條件下的菌種不會(huì)變異并且性能穩(wěn)定。 (四)菌種保藏標(biāo)簽的規(guī)范與要求 菌種保藏標(biāo)簽必須規(guī)范、清晰，所有保藏的菌種容器表面均應(yīng)貼有相應(yīng)的標(biāo)簽，容器表面的標(biāo)簽或標(biāo)記必須字跡清晰可見(jiàn)，不得模糊不清或因潮濕或其他原因而致模糊或損壞。標(biāo)簽上應(yīng)注明：菌種的名稱，系列號(hào)(CMCC號(hào)或ATCC號(hào))，傳代的次數(shù)，接種時(shí)間等。需要指出的是，一旦新一代菌種制備成功，務(wù)必要將上一代菌種處理掉。處理過(guò)程應(yīng)記錄下來(lái)并存檔。 (五)嚴(yán)格菌種的質(zhì)量控制，確保菌種的質(zhì)量 菌種的質(zhì)量對(duì)檢驗(yàn)至關(guān)重要，對(duì)實(shí)驗(yàn)室貯備的菌種而言，除了在起始階段要對(duì)菌種進(jìn)行純度和屬性確認(rèn)外，還應(yīng)對(duì)每一次傳代都要進(jìn)行確認(rèn)的質(zhì)量控制系統(tǒng)。因?yàn)楫?dāng)微生物菌種從上代傳至下代時(shí)，很可能發(fā)生污染或變異，因此每次傳代中至少要對(duì)菌種進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察(在可能情況下，用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)檢查)和革蘭染色檢查，必要時(shí)應(yīng)做菌種鑒定實(shí)驗(yàn)，一旦出現(xiàn)偏差，應(yīng)做進(jìn)一步調(diào)查，所有被確認(rèn)受到污染的菌種應(yīng)及時(shí)銷(xiāo)毀，不得用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)。 為保證試驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)程制備和使用菌種，并對(duì)每種微生物的存貯條件(需氧或厭氧狀態(tài)、溫度和時(shí)間)進(jìn)行確認(rèn)，一般來(lái)說(shuō)，低溫保存(2-8)時(shí)細(xì)菌和酵母菌的菌懸液應(yīng)在制備后的24h內(nèi)使用(用于抗生素效價(jià)測(cè)定的除外)，霉菌孢子液應(yīng)在制備后的7d內(nèi)使用。不管菌懸液制備后的時(shí)間為多長(zhǎng)，在使用時(shí)(在24h之內(nèi))均應(yīng)同時(shí)進(jìn)行菌數(shù)復(fù)核檢查?？刹捎梅止夤舛确ɑ螓?zhǔn)蠞岫确ü烙?jì)當(dāng)時(shí)的菌液濃度。可以制備不同濃度的菌懸液，用分光光度計(jì)在550nm或580nm波長(zhǎng)處測(cè)出不同菌液濃度下的光吸收值。然后，將菌液濃度與對(duì)應(yīng)的吸收值作圖，便得到了相應(yīng)菌液濃度與吸收值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。由于不同微生物的細(xì)胞大小不同，細(xì)胞大小會(huì)影響其吸收值，要分別制定出每種微生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。有了標(biāo)準(zhǔn)曲線后