目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及重組子的篩選.ppt

第六章目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及重組子的篩選 第一節(jié)受體細(xì)胞 受體細(xì)胞 receptorcell 又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞 hostcell 從實驗技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞 從實驗?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細(xì)胞 隨著基因工程的發(fā)展 從低等的原核細(xì)胞 到簡單的真核細(xì)胞 進(jìn)一步到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高等動 植物細(xì)胞都可以作為基因工程的受體細(xì)胞 1 受體細(xì)胞的概念 2 受體細(xì)胞選擇所應(yīng)遵循的原則 便于重組DNA分子導(dǎo)入 能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中 如 限制性內(nèi)切酶缺陷型 避免其對重組DNA分子的降解破壞作用 便于重組體的篩選 選擇與載體所含的選擇標(biāo)記相匹配的受體細(xì)胞基因型 遺傳穩(wěn)定性高 易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長 安全性高 無致病性 不會對外界環(huán)境造成生物污染 選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞 利于外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)的積累 或促進(jìn)外源基因的高效分泌表達(dá) 受體細(xì)胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯的偏倚性 具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制 便于真核目的基因的高效表達(dá) 在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值 3 各種類型受體細(xì)胞的優(yōu)缺點 1 原核細(xì)胞 優(yōu)點大部分原核細(xì)胞沒有纖維素組成的堅硬細(xì)胞壁 便于外源DNA的進(jìn)入 沒有核膜 染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì) 這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩 基因組簡單 不含線粒體和葉綠體基因組 便于對引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析 原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物 容易獲得一致性的的實驗材料 并且培養(yǎng)簡單 繁殖迅速 實驗周期短 重復(fù)實驗快 缺點由于原核細(xì)胞缺乏真核生物具有的RNA轉(zhuǎn)錄后加工 修飾系統(tǒng) 蛋白質(zhì)翻譯后加工 修飾 折疊復(fù)性系統(tǒng) 使某些真核細(xì)胞中編碼蛋白的基因不能夠在原核細(xì)胞中表達(dá) 甚至即使獲得了表達(dá) 也不具有正常的生物學(xué)活性 常用作受體細(xì)胞的原核生物 大腸桿菌 枯草桿菌 藍(lán)藻等 大腸桿菌 基因背景清楚 繁殖迅速 培養(yǎng)簡單 細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素 可導(dǎo)致人體熱原反映 目前已實現(xiàn)商品化的基因工程產(chǎn)品中 大部分是由大腸桿菌工程菌生產(chǎn)的 枯草桿菌 基因背景清楚 繁殖迅速 培養(yǎng)簡單 能將基因 表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中 不產(chǎn)生內(nèi)毒素 具有芽孢行成能力 易于保存和培養(yǎng) 藍(lán)藻 是一種自養(yǎng)生物 培養(yǎng)簡便易行 可成為植物基因表達(dá)的宿主 2 真菌細(xì)胞真菌是低等的真核生物 基因結(jié)構(gòu)簡單 基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都有真核生物的特征 因此可用于表達(dá)真核生物的基因 常用的真菌細(xì)胞有酵母等 3 植物細(xì)胞優(yōu)點 植物細(xì)胞具有全能性 一個細(xì)胞就能分化成一株完整的植株 這就意味著一個獲得外源基因的植物細(xì)胞就能培養(yǎng)成穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物 缺點 具有堅硬的細(xì)胞壁 外源基因無法直接導(dǎo)入 方法 a 經(jīng)纖維素酶處理去掉細(xì)胞壁后獲得原生質(zhì)體 b 不必去掉細(xì)胞壁 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等 4 動物細(xì)胞 優(yōu)點 動物細(xì)胞具有RNA的轉(zhuǎn)錄后的剪接 加工機(jī)制 蛋白質(zhì)翻譯后的加工 修飾機(jī)制 蛋白產(chǎn)物的生物學(xué)活性及免疫原性好 易被重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染 具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性 可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中 便于分離 純化 缺點 不能通過一個細(xì)胞的培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因動物 在獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后 需采用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動物 第二節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 1 重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞 1 重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌 轉(zhuǎn)化 transformation 重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞 并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化的方法制備感受態(tài)細(xì)胞法感受態(tài)細(xì)胞 處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞 制備感受態(tài)大腸桿菌一般利用CaCl2處理 電穿孔轉(zhuǎn)化法其基本原理是利用電穿孔儀的高壓電脈沖作用 在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔 形成可逆的瞬間的通道 從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收 轉(zhuǎn)化效率受電場強(qiáng)度 脈沖時間和外源DNA濃度的影響 三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌 轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化率 DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率 轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化子數(shù) DNA分子數(shù) 10 5表示105個DNA分子獲得一個轉(zhuǎn)化子 或轉(zhuǎn)化子數(shù) DNA質(zhì)量 106 g表示1 gDNA分子得106個轉(zhuǎn)化子 影響轉(zhuǎn)化率的因素a 重組DNA分子的大小 構(gòu)型 濃度 純度及載體與受體細(xì)胞的親和性 b 菌株類型c 轉(zhuǎn)化方法 電穿孔法最高 CaCl2誘導(dǎo)法居中 三親本雜交接合法最低 2 重組 嗜菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌 轉(zhuǎn)染 transfection 及轉(zhuǎn)導(dǎo) transduction 轉(zhuǎn)染 將重組 噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程稱為轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)導(dǎo) 通過 噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程 采用 噬菌體DNA直接轉(zhuǎn)染大腸桿菌的效率很低 所以需對重組的 噬菌體DNA進(jìn)行體外包裝后 再通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法感染大腸桿菌 體外包裝體外包裝 在體外模擬 噬菌體DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程 將重組 噬菌體DNA分子包裝成成熟的具有感染能力的 噬菌體顆粒的技術(shù) 原理 根據(jù) 噬菌體DNA分子體內(nèi)包裝的途徑 分別獲得缺失D包裝蛋白的 噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的 噬菌體突變株 由于兩種突變株均不具有完整的包裝蛋白 都不能單獨的包裝 噬菌體DNA 但將兩種突變株分別感染大腸桿菌后 從中提取缺失D蛋白的包裝物 含E蛋白 和缺失E蛋白的包裝物 含D蛋白 兩者混合后就能包裝 噬菌體DNA 2 重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞由于真核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu) 基因組成和基因表達(dá)較為復(fù)雜 適用于原核生物的轉(zhuǎn)基因方法大多難以有效的用于真核生物 但近年來經(jīng)過摸索 建立了一系列適用于真核生物的轉(zhuǎn)基因方法 并用這些方法有效的獲得了轉(zhuǎn)基因真核生物 1 重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌能侵入植物傷口處細(xì)胞中 其所具有的內(nèi)源質(zhì)粒 Ti質(zhì)粒的T DNA能轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部 因此 將外源基因與Ti質(zhì)粒重組構(gòu)建載體 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)可將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中 多聚物介導(dǎo)法一些多聚物 聚乙二醇 多聚賴氨酸 多聚鳥氨酸等 和二價陽離子 Ca2 Mg2 Mn2 等 于DNA混合 能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒 通過原生質(zhì)體的內(nèi)吞噬作用而被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔法同原核細(xì)胞的電穿孔法 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法利用直徑很小 能量很高的激光微束在細(xì)胞膜上造成可逆性微孔 處于細(xì)胞周圍的DNA分子隨之進(jìn)入細(xì)胞 超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化超聲波處理原生質(zhì)體 使其細(xì)胞膜上形成可逆性微孔 使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞 基因槍法利用高速運行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時能進(jìn)入細(xì)胞 將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨之帶入細(xì)胞 脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體 liposome 是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu) 可以將DNA包在其中 并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程 把外源DNA轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi) 顯微注射法顯微注射法是一種利用顯微操作儀 通過機(jī)械的方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)移方法 早期該技術(shù)主要用于動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化等方面 現(xiàn)在逐步應(yīng)用到植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化操作中 成為一種重要的植物轉(zhuǎn)基因手段 花粉管通道法此法是將外源DNA涂于授粉的枝頭上 使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊 轉(zhuǎn)化還不具正常細(xì)胞壁的卵 合子及早期的胚胎細(xì)胞 3 重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 哺乳動物的細(xì)胞很難捕獲外源DNA 這明顯影響了哺乳動物基因工程的發(fā)展 近年來通過探索已建立了幾種能有效地將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法 病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法哺乳動物的細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的DNA 磷酸鈣沉淀物 使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞 DEAE 葡聚糖轉(zhuǎn)染法二乙胺乙基葡聚糖是一種高分子質(zhì)量的多聚陽離子試劑 能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞捕獲外源DNA 實現(xiàn)短時間的有效表達(dá) 聚陽離子 DMSO轉(zhuǎn)染法此方法采用聚陽離子poly brene處理哺乳動物細(xì)胞 增加細(xì)胞表面對DNA的吸附能力 然后再用25 30 DMSO短暫處理細(xì)胞 增加膜的通透性 提高對DNA的捕獲量 顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù) 電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù) 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 活化菌種 擴(kuò)大培養(yǎng) 使其處于對數(shù)生長后期 OD600 0 4 3 4ml菌液冰水浴中10分鐘 4 離心集菌 菌體懸浮于含CaCl2的預(yù)冷緩沖液中 冰水浴15min 4 離心集菌 棄上清 沉淀物重懸于CaCl2的預(yù)冷緩沖液中 4 下放置12 14h 0 2ml新制備好的感受細(xì)胞中加入緩沖液溶解的重組DNA 置于冰水浴中1h以上 期間輕搖幾次 轉(zhuǎn)入42 水浴上2min 使感受態(tài)細(xì)胞吸收重組DNA 轉(zhuǎn)入37 水浴上5min 加入1ml不含選擇性藥物的LB培養(yǎng)基 篩選轉(zhuǎn)化子 37 震蕩培養(yǎng)30 60min 鋪板培養(yǎng) 圖6 1感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 圖6 2 噬菌體的體外包裝 圖6 3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 第三節(jié)重組子的篩選 在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中 并非所有的受體細(xì)胞都能被導(dǎo)入重組DNA分子 一般僅有少數(shù)重組DNA分子能進(jìn)入受體細(xì)胞 再者 在這些被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中 除部分含有我們期待的DNA分子外 另外一些還可能是由于載體自身或一個載體與多個外源DNA片段形成的非期待重組DNA分子導(dǎo)入所致 因此 需要采取必要的方法將重組子從大量的受體細(xì)胞中篩選出來 轉(zhuǎn)化子 導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子 重組子 含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子稱為重組子 陽性克隆子 期望重組子 含有外源目的基因的重組子稱為陽性克隆子或期望重組子 篩選 選擇 經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后 獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選或選擇 1 遺傳表型直接篩選法 在構(gòu)建基因工程載體時 載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基因 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特征 據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選 一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的菌液 包括對照處理 適量涂布在選擇培養(yǎng)基上 在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一段時間 觀察菌落生長情況 即可挑選出轉(zhuǎn)化子 抗藥性篩選氨芐青霉素 Amp 氯霉素 Cmp 卡那霉素 Kan 四環(huán)素 Tet 鏈霉素 Str 主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子的篩選 在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上 含重組質(zhì)粒的受體菌能存活 不含重組質(zhì)粒的受體菌不能存活 插入失活篩選法外源DNA的插入特定載體后導(dǎo)致遺傳標(biāo)記基因失活 借此篩選重組子 插入表達(dá)篩選法與插入失活策略向相反 插入表達(dá)法是利用外源DNA插入特定載體后導(dǎo)致遺傳標(biāo)記基因表達(dá) 借此篩選重組子 顯色互補(bǔ)篩選法LacZ 基因的藍(lán)白斑篩選 形成嗜菌斑篩選法對于 DNA載體系統(tǒng) 只有在外源DNA插入載體后 重組的 DNA分子大小在野生型 DNA分子的78 105 范圍內(nèi)時 才能在體外包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒 后者在轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌后 轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基上被裂解形成嗜菌斑 而非轉(zhuǎn)化子能正常生長 兩者很容易區(qū)分 2 DNA電泳檢測法 直接電泳檢測法重組的質(zhì)粒DNA分子由于有外源DNA的插入 比未插入外源DNA的質(zhì)粒載體大 通過凝膠電泳就可將重組子篩選出來 酶切電泳篩選法通過直接電泳檢測法篩選出來的重組子 插入的外源DNA不一定是目的DNA片段 通過將重組子中的質(zhì)粒進(jìn)行酶切 然后再進(jìn)行電泳 就可將陽性克隆子篩選出來 PCR檢測法外源DNA的兩側(cè)序列多為已知序列 通過PCR擴(kuò)增外源DNA 然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳 就可篩選出陽性克隆子 3 核酸分子雜交檢測法 4 免疫化學(xué)檢測法 基本過程與核酸分子雜交檢測法相似 不同的是該法使用抗體探針 而非DNA探針來鑒定目的基因表達(dá)產(chǎn)物 因而其前提 條件是克隆基因可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 并且有目的蛋白的抗體 放射性抗體檢測法 免疫沉淀檢測法 酶聯(lián)免疫檢測法 ELISA 采用非放射性標(biāo)記物 辣根過氧化物酶 堿性磷酸酶等 偶合第二抗體 然后與目的蛋白抗原 抗體復(fù)合物結(jié)合 通過檢測非放射性標(biāo)記物從而檢測到相應(yīng)的蛋白抗原 5 轉(zhuǎn)譯篩選法 轉(zhuǎn)譯篩選法是通過體外轉(zhuǎn)譯的手段鑒定陽性克隆的方法 可分為雜交抑制轉(zhuǎn)譯和雜交選擇轉(zhuǎn)譯兩種檢測方法 雜交抑制轉(zhuǎn)譯要求 被研究的目的基因編碼有豐富的mRNA 原理 DNA 蛋白質(zhì) mRNA 蛋白質(zhì) 雜交 轉(zhuǎn)化菌落 提取重組DNA 與總mRNA雜交 形成DNA RNA雜種分子 將總mRNA 包括DNA RNA分子 提取出來 體外轉(zhuǎn)譯 蛋白電泳放射自顯影 總mRNA 體外轉(zhuǎn)譯 蛋白電泳放射自顯影 經(jīng)對比 1 比 2 中少了一種蛋白質(zhì) 找到一種轉(zhuǎn)譯作用被抑制了的mRNA 篩選出重組菌落 或噬菌斑 步驟 1 2 3 雜交選擇轉(zhuǎn)譯 重組體庫 提取DNA 固定在NC膜上 與mRNA或總RNA雜交 目的基因與對應(yīng)的mRNA雜交 mRNA固定在NC膜上 將分離的mRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)譯 凝膠電泳或生物活性檢測 找出單菌落重組體 6 DNA 蛋白質(zhì)相互作用篩選法 原理 外源DN