引物設(shè)計002[1].ppt

PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用 主要內(nèi)容 背景PCR引物設(shè)計原則常用PCR引物設(shè)計軟件PrimerPremier5 0介紹Oligo6 22介紹在線Primer3介紹 PCR 聚合酶鏈反應(yīng) PolymeraseChainReaction PCR 是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù) 它具有特異 敏感 產(chǎn)率高 快速 簡便 重復(fù)性好 易自動化等突出優(yōu)點 能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍 使肉眼能直接觀察和判斷 可從一根毛發(fā) 一滴血 甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定 PCR引物設(shè)計 引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán) 使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實驗失敗 表現(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶 如形成引物二聚體帶 不出帶或出帶很弱 等等 現(xiàn)在PCR引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行 可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁 得到設(shè)計好的引物 也可以在本地計算機上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件 引物設(shè)計的原則 引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng) 即錯配 如引物長度 primerlength 產(chǎn)物長度 productlength 序列Tm值 meltingtemperature 引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性 internalstability 用 G值反映 形成引物二聚體 primerdimer 及發(fā)夾結(jié)構(gòu) duplexformationandhairpin 的能值 在錯配位點 falseprimingsite 的引發(fā)效率 引物及產(chǎn)物的GC含量 composition 等等 必要時還需對引物進行修飾 如增加限制性內(nèi)切酶位點 引進突變等 具體因素 一般原則 引物的長度一般為15 30bp 常用的是18 24bp 但不應(yīng)大于38 引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象 一般來說引物長度大于16bp是必要的 不容易引起錯配 例如 一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點 3x109 412 200 而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1 400個 較長的引物 28 35bp 一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點 Tm值的計算一般的公式Tm 4 G C 2 A T 對于長一些的引物可用更為準確的nearest neighbor Frieretal 1986 一般原則 2 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高 尤其是3 端相似性較高的序列 否則容易導(dǎo)致錯配 引物3 端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基 如GGG或CCC 也會使錯誤引發(fā)機率增加 一般原則 3 引物3 端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響 不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率 末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基 因此應(yīng)當避免在引物的3 端使用堿基A 另外 引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗 5 端序列對PCR影響不太大 因此常用來引進修飾位點或標記物 一般原則 4 引物序列的GC含量一般為40 60 過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng) 上下游引物的GC含量不能相差太大 不同的算法推薦45 55 或50 60 一般原則 5 G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能 該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性 應(yīng)當選用3 端 G值較低 絕對值不超過9 而5 端和中間 G值相對較高的引物 引物的3 端的 G值過高 容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng) 能值越高越容易結(jié)合 一般原則 6 對引物的修飾一般是在5 端增加酶切位點 應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定 一般原則 7 引物二級結(jié)構(gòu)對PCR反應(yīng)的影響 盡可能少的引物二聚體 常用的引物設(shè)計軟件 Oligo6 引物評價 PrimerPremier 自動搜索 VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 在線服務(wù) PrimerPremier5 0的使用技巧簡介 主要功能 1 即引物設(shè)計2 限制性內(nèi)切酶位點分析3 DNA基元 motif 查找4 同源性分析 簡并引物設(shè)計 根據(jù)氨基酸序列來設(shè)計引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1 纖毛蟲大核 CiliateMacronuclear 2 無脊椎動物線粒體 InvertebrateMitochondrion 3 支原體 Mycoplasma 4 植物線粒體 PlantMitochondrion 5 原生動物線粒體 ProtozoanMitochondrion 6 一般標準 Standard 7 脊椎動物線粒體 VertebrateMitochondrion 8 酵母線粒體 YeastMitochondrion PrimerPremier5 0使用介紹 1 PreimerPremier啟動界面 Loadsequence 基本信息 Sequencename Originalsequence UsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好 Chooseafunction 引物設(shè)計界面 Firstyoucandesigntheprimermanually Sensestrandoranti sensestrand Usefulinformationoftheprimer 引物搜索選項設(shè)定 引物類型 搜索模式 5 引物位置范圍 3 引物位置范圍 產(chǎn)物大小范圍 引物長度 搜索結(jié)果 28對引物 引物分值100分為滿分 每對引物的信息 雙擊選中一對引物 引物信息 回到主窗口 引物及產(chǎn)物信息 是否出現(xiàn)hairpin dimer falseprimingandcrossdimer 一對理想的引物應(yīng)當不存在任何一種上述結(jié)構(gòu) 因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But 引物編輯 引物編輯 Editprimerhere Analysistheeditresult AccepttheeditresultReturntothemainwindow SomeotherusefulfunctionofPP5 Enzyme Meltingtemperaturegraph Per25 mer GC graph Per25 mer Stability Per5 mer Oligo6 44使用說明 主要功能 專門的引物設(shè)計軟件 Oligo6 44啟動界面 Opensequencefile 3個彈出窗口 Meltingtemperature GInternalStability Frq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率 該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性 用Oligo設(shè)計引物時的3個標準 Tm值曲線以選取5 到3 的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng) Frq曲線宜選用3 端Frq值相對較低的片段 G值在5 端和中間值比較高 而在3 端相對低 選中引物 上游引物 下游引物 只是示意圖 引物分析 首先檢查引物二聚體尤其是3 端二聚體形成的可能性 引物分析 二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu) hairpin 與二聚體相同 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好 引物分析 第三項檢查為GC含量 以45 55 為宜 第四Falsepriming檢查 引物分析 Keyinformationof