DC培養(yǎng).docx

1. 定義和縮寫2.1.DC樹(shù)突狀細(xì)胞2.2.CTL細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞2.3.rhIL-4人源重組白細(xì)胞介素4 2.4.rhGM-CSF人源粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子2.5.rhTNF-人源腫瘤壞死因子2.6.PE-antihCD80白細(xì)胞分化抗原802.7.FITC-antihHLA-DR人白細(xì)胞DR抗原2.8.APC-antihCD54白細(xì)胞分化抗原542.9.L-GlnL-谷氨酰胺2.10.DMSO二甲基亞砜2.11.Anti-CD3-McAb 抗CD3單克隆抗體3. 主要儀器、耗材和試劑注意：所有用于臨床研究的DC細(xì)胞必須是在符合GMP條件的超凈環(huán)境下制備。與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的材料必須是無(wú)菌、無(wú)致熱原的，并嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，有特殊說(shuō)明的可以除外。若需要使用同等的材料和設(shè)備，對(duì)于任何改變都需要做詳細(xì)的記錄。3.1. 儀器3.1.1 生物安全柜3.1.2 水平低速離心機(jī)3.1.3 CO2 孵箱3.1.4 倒置顯微鏡3.1.5 液氮罐3.1.6 水浴鍋3.1.7 移液器3.1.8 熱合機(jī)3.1.9 -20冰箱3.1.10 4冰箱3.1.11 -80冰箱3.2. 耗材3.2.1 75cm2、225cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)袋3.2.3 移液管3.2.4 50ml、250ml離心管3.2.5 Tip頭3.2.6 細(xì)胞刮刀3.2.7 細(xì)胞凍存管3.2.8 5ml、50ml注射器3.2.9 細(xì)胞篩網(wǎng)3.2.10 血瓊脂培養(yǎng)皿3.3. 試劑3.3.1 無(wú)血清培養(yǎng)液3.3.2 rhGM-CSF3.3.3 rhIL-43.3.4 T細(xì)胞因子3.3.5 Anti-CD3-McAb3.3.6 人血白蛋白3.3.7 生理鹽水3.3.8 人淋巴細(xì)胞分離液3.3.9 0.4%苔盼藍(lán)溶液3.3.10 DMSO3.4. 原材料3.4.1 腫瘤病人外周血單核細(xì)胞4. 操作步驟 貼壁的外周血單核細(xì)胞的制備4.1. 將血細(xì)胞分離機(jī)分離的腫瘤病人的血細(xì)胞懸液（一般50100ml）分成23份加到50ml離心管中，補(bǔ)生理鹽水至50ml，混勻。室溫，2000rpm，離心15min。4.2. 吸棄上層的血漿層，加生理鹽水稀釋剩余的血細(xì)胞懸液至30ml，混勻，分別加至15ml的淋巴細(xì)胞分離液上（23管）。室溫，2000rpm，離心20min。4.3. 取出離心的細(xì)胞，吸去最上層的液體，收集PBMC層液體至2個(gè)50ml離心管中，并加生理鹽水至50ml，混勻。室溫，1800rpm，離心8min。4.4. 棄上清，用手指輕彈開(kāi)沉淀的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于50ml的生理鹽水中。室溫，1800rpm，離心8min。并用生理鹽水重復(fù)洗滌細(xì)胞兩次。4.5. 棄上清，用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀。4.6. 取100l細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)（具體方法詳見(jiàn)白細(xì)胞計(jì)數(shù)和成活率計(jì)算SOP），苔盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.7. 將細(xì)胞懸液稀釋至120ml，混勻后鋪6個(gè)75cm2的培養(yǎng)瓶，每瓶加細(xì)胞懸液20ml，置于37，5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)30min。4.8. 30min后，取出培養(yǎng)瓶，小心晃下貼壁不牢的細(xì)胞，吸去上層未貼壁的細(xì)胞懸液，并用每瓶10ml無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌貼壁的細(xì)胞一次，合并至未貼壁細(xì)胞懸液中。在75cm2培養(yǎng)瓶中添加15ml的含100ng/ml rhGM-CSF、30ng/ml rhIL-4、2%人血白蛋白及2mmol/L Gln的人DC細(xì)胞完全培養(yǎng)液，輕輕搖勻后，將75cm2培養(yǎng)瓶置于37，5%CO2的培養(yǎng)箱中，作為DC培養(yǎng)。未貼壁的細(xì)胞懸液共約180ml，取樣計(jì)數(shù)，留1-2108放入包被好的225cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)入含T細(xì)胞因子的培養(yǎng)基至100ml，余的細(xì)胞全部轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋，補(bǔ)入含T細(xì)胞因子及50ng/ml Anti-CD3-McAb的培養(yǎng)基至1000ml，二者置于37，7.5%CO2的培養(yǎng)箱中，作為CTL培養(yǎng)。DC培養(yǎng)DC補(bǔ)液4.9. 第二天及第四天，給每瓶補(bǔ)加含100ng/ml rhGM-CSF、30ng/ml rhIL-4、2%人血白蛋白及2mmol/L Gln的人DC細(xì)胞完全培養(yǎng)液5ml。DC的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)4.10. 于第六天收獲未成熟DC細(xì)胞。4.11. 用細(xì)胞刮刀將一瓶DC細(xì)胞刮起，收集細(xì)胞懸液，混勻后吸出100l細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，苔盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.12. 6瓶75cm2培養(yǎng)瓶中每瓶吸出10ml培養(yǎng)液（剩余15ml培養(yǎng)液），至50ml的離心管中，室溫，1800rpm，離心8min。刮過(guò)的培養(yǎng)瓶標(biāo)記后分開(kāi)處理。4.13. 棄上清，用含100ng/ml rhGM-CSF、30ng/ml rhIL-4、2%人血白蛋白及2mmol/L Gln的DC細(xì)胞培養(yǎng)液50ml重懸沉淀的細(xì)胞，并進(jìn)行腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞懸液中加入iAPA細(xì)胞因子，加入的量為10000vp/cell。但最多轉(zhuǎn)染2支iAPA因子。4.14. 細(xì)胞懸液混勻后鋪回75cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶約8.6ml。4.15. 培養(yǎng)瓶置于37，5%CO2孵箱中過(guò)夜培養(yǎng)。 DC細(xì)胞的成熟4.16. 第七天，取出6個(gè)75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用細(xì)胞刮刀將全部細(xì)胞刮起，收集細(xì)胞懸液至50ml離心管中，并用5ml生理鹽水將每個(gè)培養(yǎng)瓶洗一遍，合并洗液和細(xì)胞懸液，混勻，配平。室溫，1800rpm，離心8min。4.17. 棄上清，用手指輕輕彈開(kāi)細(xì)胞沉淀，并將全部DC合并重懸于31ml的生理鹽水中，混勻，取出100l細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，苔盤藍(lán)染色，使用血細(xì)胞記數(shù)器按照標(biāo)準(zhǔn)的操作程序進(jìn)行計(jì)數(shù)。留1ml（細(xì)胞106以上）作表面分子CCR7、HLA-DR、CD54、CD80、CD83、CD86以及PI熒光直標(biāo)抗體染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)(具體方法詳見(jiàn)流式檢測(cè)SOP)。其余30ml平分2份，分別補(bǔ)生理鹽水至40ml。室溫，1800rpm，離心8min。4.18. 棄上清，彈勻細(xì)胞，一管細(xì)胞用生理鹽水重懸至40ml，混勻。室溫，1800rpm，離心8min。另一管細(xì)胞，加入1ml細(xì)胞凍存液（人血白蛋白:無(wú)血清培養(yǎng)基:DMSO=5:4:1），混勻后凍存于2ml的凍存管中，置于凍存盒中，放入-80冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮保存。4.19