「綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆和表達(dá)(新手詳細(xì)注釋版)」.doc

綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆和表達(dá)背景知識綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，GFP 發(fā)射綠色熒光。它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子。發(fā)色團(tuán)是其蛋白質(zhì)一級序列固有的。GFP 由3 個(gè)外顯子組成，長2.6kb；GFP 是由238 個(gè)氨基酸所組成的單體蛋白,相對分子質(zhì)量為27. 0kMr，其蛋白性質(zhì)十分穩(wěn)定，能耐受60處理。1996 年GFP 的晶體結(jié)構(gòu)被解出，蛋白質(zhì)中央是一個(gè)圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長420 nm，寬240 nm，由11 個(gè)圍繞中心螺旋的反平行折疊組成，熒光基團(tuán)的形成就是從這個(gè)螺旋開始的，桶的頂部由3 個(gè)短的垂直片段覆蓋，底部由一個(gè)短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔內(nèi)。發(fā)色團(tuán)是由其蛋白質(zhì)內(nèi)部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身環(huán)化和氧化形成.實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的分離與純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆找环N最常用的質(zhì)粒DNA提取方法：堿裂解法。該法用于從小量培養(yǎng)物中抽提質(zhì)粒DNA，比較方便、省時(shí)，提取的質(zhì)粒DNA質(zhì)量較高，可用于DNA的酶切、PCR甚至測序。二、基本原理質(zhì)粒是一類在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立于染色體外，能夠自主復(fù)制的穩(wěn)定的遺傳單位。迄今為止，從細(xì)菌中分離得到的質(zhì)粒都是環(huán)型雙鏈DNA分子，分子量范圍從1kb到200kb。質(zhì)粒DNA可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。在大多數(shù)情況下質(zhì)粒DNA復(fù)制中的酶體系和細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)所用的酶是相同的。有些質(zhì)粒復(fù)制受宿主細(xì)胞復(fù)制作用的嚴(yán)格限制，因此每個(gè)細(xì)胞中只含一個(gè)或幾個(gè)拷貝，稱為嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒，有的質(zhì)粒的復(fù)制受宿主細(xì)胞的控制不嚴(yán)，稱為松弛型質(zhì)粒，它們在每個(gè)細(xì)胞中的數(shù)目可達(dá)10-200個(gè)拷貝。當(dāng)宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成受到抑制時(shí)（例如經(jīng)氯霉素處理），細(xì)菌染色體雖不再增加，但松弛型質(zhì)粒DNA可繼續(xù)被復(fù)制，以至每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)可以增至一千到幾千。質(zhì)粒具有一定的生物功能，它們往往帶有一些抗藥標(biāo)記，當(dāng)質(zhì)粒DNA用人為的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌時(shí)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌會表現(xiàn)出質(zhì)?；蛩哂械男碌纳锉憩F(xiàn)型，例如，把一個(gè)含有抗藥基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌后，原來無抗藥性的細(xì)菌則表現(xiàn)出抗藥的新表型。借助轉(zhuǎn)化菌獲得的新表型特征，可證實(shí)質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入宿主細(xì)菌中，這樣就可以作為轉(zhuǎn)化菌的選擇性標(biāo)記。質(zhì)粒作為基因克隆載體分子的重要的條件是獲得批量的純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，它們都包括三個(gè)基本的步驟：細(xì)菌的生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增；菌體的收集裂解，質(zhì)粒DNA的分離；質(zhì)粒DNA的純化。1、 細(xì)菌的生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增從瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對于松弛型質(zhì)粒（如pUC系列）來說，只要將培養(yǎng)物放到標(biāo)準(zhǔn)的LB或2YT培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提取質(zhì)粒，而不必選擇性地?cái)U(kuò)增質(zhì)粒DNA。但對于嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒（如pBR322）來說，則需在得到部分生長的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)，以便對質(zhì)粒進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。2、菌體的收集、裂解和質(zhì)粒DNA的分離質(zhì)粒分離的基本原理是利用宿主菌（一般是大腸桿菌菌株）DNA與質(zhì)粒DNA之間的兩種主要性質(zhì)差異：（1）大腸桿菌的染色體較一般的載體質(zhì)粒DNA大得多。（2）從細(xì)胞中提取得到的大腸桿菌DNA主體是變性的線性分子，而大多數(shù)質(zhì)粒DNA是共價(jià)閉合的環(huán)狀分子。這里主要介紹堿裂解法的基本原理：在細(xì)菌懸浮液中加入SDS（十二烷基硫酸鈉）和NaOH使菌體裂解（有時(shí)需要先使用溶菌酶水解細(xì)胞壁）。此處理可破壞堿基配對，故可使細(xì)菌的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)（如加入酸性的NaAc或Kac中和堿性NaOH），質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配對，重新恢復(fù)成天然的超螺旋分子。通過離心，可以使染色體DNA與變性蛋白質(zhì)、RNA分子一起沉淀下來，而質(zhì)粒超螺旋分子仍滯留于上清中。3、質(zhì)粒DNA的提純對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等簡單步驟除去殘余蛋白質(zhì)及RNA，達(dá)到純化的目的。質(zhì)粒DNA分子具有三種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA，SC構(gòu)型）、開環(huán)DNA（OC構(gòu)型）和線性分子（L構(gòu)型）。在細(xì)菌體內(nèi)，質(zhì)粒DNA是以負(fù)超螺旋構(gòu)型存在的。在瓊脂糖凝膠電泳中不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA，盡管分子量相同，但具有不同的電泳遷移率。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑1. 在含有pEGFPN3質(zhì)粒的DH5平板上菌落上挑取菌種，置于含有5mL LB培養(yǎng)基的試管中。搖晃過夜。 （DH5是一種大腸桿菌的誘變菌株，主要表現(xiàn)對外源DNA的免疫缺乏，是用于基因工程的菌種）在含有pET-28a質(zhì)粒的平板上挑取單菌落于另外一個(gè)試管中，同樣搖蕩培養(yǎng)過夜。2、使用儀器 恒溫培養(yǎng)箱，超凈臺，恒溫?fù)u床，制冰機(jī)，臺式離心機(jī)，小型混合器，冰箱四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 取1.5ml DH5培養(yǎng)液倒入1.5mL eppendorf 管（一種離心管）中, 13000rpm離心1min。2. 重復(fù)1。3. 棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 4. 菌體沉淀重懸浮于100L溶液中(需劇烈振蕩),室溫下放置10min。 （溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液I的作用；mM為mmol/L。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好處是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 ）5. 加入新配制的溶液200l, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf 管5次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5min。 （溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液II的作用；這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱堿性。其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過長，因?yàn)閴A性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。）6. 加入150L預(yù)冷的溶液,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩3次,使沉淀混勻,冰浴中15分鐘,13000rpm離心5min。 （溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。溶液含3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸。溶液III加入后就會有大量的沉淀，這其實(shí)是SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀。大腸桿菌的基因組DNA也會一起被共沉淀，因?yàn)榛蚪MDNA太長，容易被PDS共沉淀，注意SDS并不與DNA分子結(jié)合。 2M的醋酸是為了中和NaOH，因?yàn)殚L時(shí)間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實(shí)沒有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。）7. 上清液移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1),振蕩混勻, 13000rpm離心2min。 （PDS沉淀的形成后有些蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時(shí)間一長就會因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。這里用25：24：1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的。酚（Phenol）對蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點(diǎn)，酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。）8. 將水相移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)振蕩混勻, 13000rpm離心2min。 9. 將水相移入干凈eppendorf 管中,加入2 倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后，置于室溫下2min，然后13000rpm離心5min。 （回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。）10. 棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1mL 70乙醇洗沉淀一次, 振蕩混勻后，13000rpm離心5min。 （高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個(gè)小時(shí)以上，并用移液槍槍頭（tip）將沉淀打碎，就能得到好的樣品。）11. 吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,室溫干燥。 12. 將沉淀溶于30L TE緩沖液(pH8.0，含20g/mL RNaseA)中，保存在-20冰箱中。 （溶解已經(jīng)講解的RNA，防止未降解的RNA會干擾電泳結(jié)果。）13. 按照同樣的流程和方法將pET-28a的質(zhì)粒也提出來，保存在-20冰箱中。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA濃度的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)利用核酸蛋白測定儀測算核酸的濃度和純度。二、基本原理核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通過260nm下核酸的吸光值計(jì)算核酸濃度（mg/ml），并通過測定與280nm和230nm的比值，估算DNA的純度。（除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如 A 260 / A 280的比值,用于評估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?280 nm.純凈的樣品,比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A 230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物,多肽,苯酚等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A 320 一般是 0。）三、實(shí)驗(yàn)材料與儀器1、實(shí)驗(yàn)材料pEGFPN3和pET-28a DNA2.使用儀器Eppendorf核酸蛋白測定儀，移液槍四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 按下Eppendorf核酸蛋白測定儀dsDNA，比色皿中加入100l ddH2O，blank空白對照。2. 取一0.5ml離心管，吸取質(zhì)粒DNA 5l，然后再加入95l ddH2O，混勻。3. 將100l的溶液轉(zhuǎn)移到比色皿中，注意不要出現(xiàn)氣泡。4. 按下sample，記錄260nm下DNA的濃度（mg/ml）。并同時(shí)記錄OD260nm/280nm，OD260nm/230nm的比值，估測DNA的純度。5. 計(jì)算質(zhì)粒DNA母液的濃度=OD260nm下的濃度20（mg/ml），DNA的純度：OD260nm/280nm=1.80.1(如果低于1.7，說明樣品中蛋白質(zhì)去除的不完全，或樣品中有苯酚的污染；如果高于1.9，說明樣品中RNA去除的不完全。) 正常OD260nm/230nm約為2.5，OD260nm/230nm 小于2.0，表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物,多肽,苯酚等鹽和小分子。實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握一種最常用的分離、鑒定、純化DNA片段的比較方便、省時(shí)的技術(shù)：瓊脂糖凝膠電泳的基本原理和操作方法。二、基本原理影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小 雙鏈DNA分子在凝膠基質(zhì)中遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)成反比。分子越大，遷移的越慢，因?yàn)槟Σ磷枇υ酱?，也因?yàn)榇蠓肿油ㄟ^凝膠孔徑的效率低于較小的分子。（2）瓊脂糖濃度 給定大小的線狀DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移速率不同。在DNA電泳遷移速率的對數(shù)和凝膠濃度之間存在線性相關(guān)。（3）DNA的構(gòu)象 超螺旋環(huán)狀（型）、切口環(huán)狀（型）和線狀（型）DNA在瓊脂糖凝膠中以不同速率遷移。其相對遷移速率主要取決于瓊脂糖凝膠的濃度和類型，其次是電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度和型超螺旋絞緊的程度或密度。一些條件下，型DNA比型遷移得快；在另一些條件下，順序可能相反。（4）所用的電壓 低電壓時(shí)，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。電場強(qiáng)度升高時(shí)，高分子量片段的遷移率遂不成比例的增加。所以，當(dāng)電壓增大時(shí)瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用電壓不應(yīng)高于5-8V/cm。（5）電泳緩沖液 DNA的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。缺乏離子則電導(dǎo)率降低，DNA或者不動或者遷移很慢。高離子強(qiáng)度時(shí)（如10buffer），電導(dǎo)率升高，使得應(yīng)用適中的電壓也會產(chǎn)生大量的熱能，最嚴(yán)重時(shí)凝膠會熔化，DNA變性。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑1、實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒DNA2、使用儀器核酸電泳儀，小型混合器，冰箱，藍(lán)盾可見光透射儀四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 1%瓊脂糖凝膠的配制（1） 加20ml 1TBE緩沖液于三角瓶中。（TBE緩沖液為Tris硼酸-EDTA緩沖溶液，適合長時(shí)間電泳，但測得分子質(zhì)量大于實(shí)際分子質(zhì)量，；TAE緩沖液為Tris醋酸-EDTA緩沖溶液，運(yùn)用最廣泛，較準(zhǔn)確但不適合長時(shí)間；TPE緩沖液為Tris磷酸-EDTA緩沖溶液，磷酸鹽易在乙醇沉淀過程中析出，不適合DNA回收。）（2）精確稱取0.2g瓊脂糖加到三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化，（3）冷卻至60左右，（4）輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上，（5）將膠板除去封膠帶，放入電泳緩沖液（TBE）中，使電泳緩沖液剛好沒過凝膠約1mm，輕輕拔除梳子，（6）取5l質(zhì)粒DNA及2l Genefinder混勻上樣。（也可使用GelRed熒光核酸凝膠染色試劑，用凝膠成像儀顯影）（7）50-100v約電泳0.5-1小時(shí)。（8）藍(lán)盾可見光透射儀觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)四 酶切及連接1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)使用限制型內(nèi)切酶進(jìn)行DNA酶切的原理和方法。2. 實(shí)驗(yàn)原理迄今已發(fā)現(xiàn)了3000多種限制性內(nèi)切酶。傳統(tǒng)上將限制性內(nèi)切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點(diǎn)、輔助因子等因素劃分為三大類。II型酶在其識別位點(diǎn)之中或臨近的確定位點(diǎn)特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段，因此是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類。5-GAATTC-33-CTTAAG-5II型限制性內(nèi)切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I這樣在識別序列中進(jìn)行切割的酶。這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要部分。大部分這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識別的是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)的序列（如EcoR I識別GAATTC；Hind III識別AAGCTT;BamHI識別GGATCC; Not I識別GCGGCCGC）；而另一些識別不連續(xù)的序列（如Bgl I識別GCCNNNNNGGC）。限制性內(nèi)切酶酶切DNA后形成兩種類型的末端：(i)兩條鏈斷裂的位置是交錯地，產(chǎn)生粘性末端，如EcoR I酶切后產(chǎn)生末端；(ii)兩條鏈的斷裂位置處在一個(gè)對稱結(jié)構(gòu)5-GGCC-33-CCGG-5。的中心，產(chǎn)生平末端，如HaeIII酶切后產(chǎn)生 DNA連接酶能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在一條DNA鏈的3-末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）。ligase53533. 實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑3.1 實(shí)驗(yàn)材料 pEGFPN3和pET-28a DNA3.2 儀器準(zhǔn)備水浴鍋、移液器、電泳槽、電泳儀、振蕩器、制冰機(jī)、藍(lán)盾可見光透射儀、凝膠成像儀3.3 試劑BamH I(10U/L) (TaKaRa公司); Not I(10U/L) (TaKaRa公司),T4 ligase4. 操作步驟4.1 酶切按如下雙酶切體系（30L）混合 ：反應(yīng)物（L）pEGFP-N3 pET-28a 質(zhì)粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10buffer K 3 3 0.1%BSA緩沖液 3 3 （BSA緩沖液為牛血清白蛋白，穩(wěn)定酶的活性。）1. 離心10s，混勻。2. 37水浴酶切3-4h。3. 配制1.0%（M/V）普通瓊脂糖凝膠30ml。（1%（m/v）指：一般是固體溶于液體的，1g固體溶于100mL水中。）4. 適當(dāng)放置冷卻，45左右倒于電泳膠板上，插好梳子。5. 待凝膠凝固好以后，撥下梳子。6. 酶切樣品中加入5l溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液混勻，上樣。7. 1TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳30min。8. 熒光激發(fā)器觀察質(zhì)粒DNA條帶的酶切情況，并照像。4.2 回收酶切產(chǎn)物（采用天為時(shí)代DNA回收試劑盒進(jìn)行回收） 1) 配30mL 1進(jìn)口瓊脂糖凝膠，盡量長一些（用粗梳子），對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離； 2) 將酶切產(chǎn)物全部加入加樣孔中 3) 跑膠，觀察結(jié)果，并且拍照。 4) 用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來，稱取重量。 5) 以0.1g凝膠對應(yīng)300L的體積加入PN（溶膠液）。 6) 50水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動離心管至膠完全融解。 7) 將上一步得到的溶液加入到一個(gè)吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm離心60s，棄掉廢液。（吸附柱，用于吸附層析）8) 加入800L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。（PW是去鹽的洗脫液，目的是洗脫脂類、蛋白及鹽類等雜質(zhì)）9) 加入500L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。 10) 將離心吸附柱放回收集管，13000rpm離心2min。 11) 取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適量洗脫緩沖液EB 30L，洗脫緩沖液先在65水浴預(yù)熱，室溫放置2min，13000rpm離心1min，然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，13000rpm離心1min。 12) 置于20保存。 4.3 連接按照連接體系進(jìn)行，16連接過夜。 反應(yīng)物 體積/L 回收純化的pET-28a質(zhì)粒 5gfp基因片段 12 T4連接酶 1 緩沖液（10） 2 實(shí)驗(yàn)五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夂驼莆沾竽c桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法的原理和操作要點(diǎn)，以及質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的原理和方法。二、基本原理外源DNA只有轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)才能得到擴(kuò)增。感受態(tài)指細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。大腸桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生：將正在生長的大腸桿菌細(xì)胞在0下加入到低滲的CaCl2溶液中，便會使細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞即呈現(xiàn)為感受態(tài)。這一方法可以用于批量制備感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到5106-2107個(gè)轉(zhuǎn)化克隆子/g超螺旋質(zhì)粒DNA。制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞可在-70凍存。在0下外源DNA可吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面，短時(shí)間的熱刺激（42，90s）誘導(dǎo)細(xì)胞吸收DNA。(Ca2+會使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞。將該體系熱激，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生劇烈擾動，并隨機(jī)出現(xiàn)許多間隙，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。) 轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌隨后在培養(yǎng)基中37培養(yǎng)1hr，可使質(zhì)粒DNA中編碼抗生素抗性的基因得以表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌細(xì)胞可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長，而沒有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無法生長。三. 實(shí)驗(yàn)材料、儀器1. 實(shí)驗(yàn)材料DH5，BL21，pET-28a重組質(zhì)粒DNA2. 使用儀器水浴鍋，高壓滅菌鍋、移液器、超凈工作臺、離心機(jī)、振蕩培養(yǎng)箱，制冰機(jī)四、操作步驟1. LB（Luria-Bertain）液體和固體培養(yǎng)基的配制（參考附錄）氨芐青霉素和卡那霉素等抗生素不抗熱，如果培養(yǎng)基溫度過高，容易導(dǎo)致抗生素失效，應(yīng)使培養(yǎng)基降溫至60左右后，再加入抗生素。但也不應(yīng)使培養(yǎng)基的溫度過低，否則容易出現(xiàn)氣泡。75mm直徑的培養(yǎng)皿約需15ml培養(yǎng)基。2感受態(tài)細(xì)胞的制備 (CaCl2法) （1） 挑一大腸桿菌單菌落放入3ml LB液體培養(yǎng)基（含Kan+），37培養(yǎng)過夜。（2） 活化大腸桿菌：取3ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基加入50-150l的過夜菌，培養(yǎng)2-3個(gè)小時(shí)。（3） 將昨夜搖出來的DH5或BL21培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10min,然后于4下4000rpm離心5min。 （4） 棄去上清,用預(yù)冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液600L輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置20min, 4下4000rpm離心5min。 （5） 棄去上清,加入300L預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置5min,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液，可-80長期保存。3. 轉(zhuǎn)化涂板 （1）取2個(gè)無菌離心管，分別加入100L DH5感受態(tài)細(xì)胞懸液，第1管加5l無菌水，第2管加入質(zhì)粒DNA溶液5l,輕輕搖勻,冰上放置30min。（2）42水浴中熱激90s,熱激后迅速置于冰上冷卻5min。 （3）分別向管中加入100L LB液體培養(yǎng)基,混勻后在37振蕩培養(yǎng)30min。 （4）從管1中取50L涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,從管2中取50L和100L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置約10分鐘,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)20小時(shí)。（50L和100L構(gòu)成濃度梯度，便于后續(xù)篩選菌落密度合適的平板）Kan-Kan+Kan+Kan+管1 管1 管2 管250L 50L 50L 100L實(shí)驗(yàn)六 重組質(zhì)粒DNA的鑒定（雙酶切法和菌落PCR法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆针p酶切法鑒定重組質(zhì)粒DNA的基本原理和操作步驟，以及菌落PCR法鑒定重組質(zhì)粒DNA的基本原理。了解菌落PCR法鑒定菌落及保存的操作方法。二、基本原理重組質(zhì)粒DNA是利用限制性內(nèi)切酶（如BamH I和Not I）分別酶切基因片段和質(zhì)粒后，利用基因片段和質(zhì)粒DNA一端帶有相同的粘性末端連接起來的重組質(zhì)粒，如果再利用相同的限制性內(nèi)切酶識別重組基因片段兩側(cè)的酶切位點(diǎn)，通過酶切下的重組片段的大小與連接的基因片段大小是否相同判斷質(zhì)粒DNA是否為重組質(zhì)粒。單菌落或提取的質(zhì)粒DNA也可以通過PCR方法鑒定正確克隆。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。典型的PCR由高溫變性、低溫退火和適溫延伸等三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)周期，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的DNA置于高溫下使之解鏈，人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫下分別在目的片段兩側(cè)與DNA兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72將單核苷酸從引物的3端開始摻入，沿模板從53方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。具體地說，PCR反應(yīng)系統(tǒng)有寡核苷酸引物，反應(yīng)緩沖液，熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶），脫氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分組成，缺一不可。PCR技術(shù)能在試管中建立反應(yīng)，經(jīng)數(shù)小時(shí)之后，就能將極微量的某一特定的目的DNA片段擴(kuò)增106倍以上，而無需經(jīng)過煩瑣的基因克隆程序便可獲得足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝。它操作簡單，易于掌握，結(jié)果也較為可靠，為基因的分析和研究提供了一種強(qiáng)有力的手段，對整個(gè)生命科學(xué)的研究與發(fā)展都有深遠(yuǎn)的影響。因此，PCR技術(shù)產(chǎn)生的時(shí)間雖不長，卻以驚人的速度廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它可用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析、突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)制的探索及法醫(yī)鑒定等諸多方面。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑1. 實(shí)驗(yàn)材料pET-28a重組質(zhì)粒DNA或菌落2. 使用儀器PCR儀，掌中寶離心機(jī)，冰箱，小型混合器，電泳槽和電泳儀，1.5ml離心管，移液器及吸頭，藍(lán)盾可見光透射儀，恒溫培養(yǎng)箱3. 試劑BamH I(10U/L) (TaKaRa公司); Not I(10U/L) (TaKaRa公司)四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 雙酶切法（1） 隨機(jī)挑取2個(gè)單菌落，接種，37振蕩培養(yǎng)過夜。（2） 質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）。（3） 雙酶切鑒定體系(10l)。反應(yīng)物(l) 管1 管2 質(zhì)粒DNA 22 BamH I 0.5 0.5 Xho I 0.5 0.5 10buffer K 1 1 ddH2O/l 6 6 （4） 室溫酶切2.5-3h。（5） 配制1.0%（M/V）普通瓊脂糖凝膠20ml。（6） 酶切樣品中加入5l溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液混勻，上樣。（7） 1TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳30min。（8） 熒光激發(fā)器觀察質(zhì)粒DNA條帶的酶切情況，并照像。并確定最終的陽性克隆2. 菌落PCR法（1） 挑取菌落隨機(jī)挑取5個(gè)菌落。首先使用無菌槍頭挑取菌落，在已準(zhǔn)備好的含有卡那抗菌素，分好區(qū)的固體培養(yǎng)基中輕劃一下（為保菌種），然后將余下菌置于eppendorf管中（作為PCR反應(yīng)模板）。（2） PCR反應(yīng)體系（20l）反應(yīng)物 體積/ dNTP（10mM）2 左引物0.5 右引物0.5 Taq酶（5U/L）0.5 MgCl2(25mM)1.210Buffer 2 ddH2O13.3 （3） PCR循環(huán)： 95 5min予變性（95 60s；58 60s；72 90s）30cycles 72 10min延伸（4） PCR產(chǎn)物的檢測PCR產(chǎn)物加入5l溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液，分別按編號加入DNA瓊脂糖凝膠電泳的加樣孔，使用1%瓊脂糖電泳分離。（5） 用熒光激發(fā)器看結(jié)果，確定陽性克隆的位置。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)七 GFP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼肐PTG誘導(dǎo)GFP基因表達(dá)的基本原理及基本操作步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理IPTG（異丙基硫代-L半乳糖苷）是一種常見的誘導(dǎo)基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，結(jié)構(gòu)類似乳糖。GFP基因連接到pET-28a的多克隆位點(diǎn)（MCS），GFP基因的表達(dá)受其上游T7啟動子和操縱基因O位點(diǎn)以及結(jié)合到這些順式作用元件的蛋白因子的控制。LacI基因編碼調(diào)節(jié)蛋白，可以四聚體的形式結(jié)合到操縱基因O位點(diǎn)上，關(guān)閉GFP基因的表達(dá)。IPTG可與四聚體調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，從而改變調(diào)節(jié)蛋白的構(gòu)象，使調(diào)節(jié)蛋白不再與O位點(diǎn)結(jié)合。接著BL21編碼的T7 RNA聚合酶結(jié)合到T7啟動子位點(diǎn)，從而啟動GFP基因的表達(dá)。三、實(shí)驗(yàn)材料和儀器1.實(shí)驗(yàn)材料BL21，pET-28a重組質(zhì)粒DNA2.使用儀器離心機(jī)，冰箱，小型混合器，移液器，恒溫培養(yǎng)箱，手持式紫外燈，超凈工作臺。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 取陽性克隆質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化BL21；2.