實驗四原子吸收分光光度法測定金屬元素含量.doc

蘭 州 理 工 大 學現代生物儀器分析實驗指導書（四年制生物工程、食品科學與工程專業(yè)）王永剛 編寫生命科學與工程學院二零一二年十月 目 錄實驗一、紫外吸收光譜法同時測定Vc和VE3實驗二 氣相色譜法測定酒或酊中C2H5OH含量5實驗三 高效液相色譜法測定維生素B1含量7實驗四 原子吸收分光光度法測定金屬元素含量10實驗一、紫外吸收光譜法同時測定Vc和VE一、 實驗目的1 掌握Cary 50紫外可見分光光度計的使用；2 學會用解聯(lián)立方程組的方法，定量測定吸收曲線相互重疊的二元混合物。二、方法原理 維生素C（抗壞血酸）和維生素E（ 生育酚）起抗氧劑作用，即它們在一定時間內能防止油酯變酪。兩者結合在一起比單獨使用的效果更佳，因為它們在抗氧劑性能方面是“協(xié)同的”。因此，它們作為一種有用的組合試劑用于各種食品中。 抗壞血酸是水溶性的， 生育酚是酯溶性的，但它們都能溶于無水乙醇，因此，能用在同一溶液中測定雙組分的原理來測定它們。根據朗伯比爾定律，用紫外可見分光光度法很容易定量測定在此光譜區(qū)內有吸收的單一成分。由兩種組分組成的混合物中，若彼此都不影響另一種物質的光吸收性質，可根據相互間光譜重疊的程度，采用相對應的方法來進行定量測定。如：當兩組分吸收峰部分重疊時，選擇適當的波長，仍可按測定單一組分的方法處理；當兩組分吸收峰大部分重疊時，則宜采用解聯(lián)立方程組或雙波長法等方法進行測定。解聯(lián)立方程組的方法是以朗伯比爾定律及吸光度的加合性為基礎，同時測定吸收光譜曲線相互重疊的二元組分的一種方法。從圖中可以看出，混合組分在1的吸收A組分和B組分分別在1的吸光度之和A1A+B，即A1A+B=1AbcA+1BbcB同理，混合組分在2的吸光度之和A2A+B應為A2A+B=2AbcA+2BbcB若首先用A，B組分的標樣，分別測得A，B兩組分在1和2處的摩爾吸收系數1A，2A和1B，2B，當測得未知試樣在1和2的吸光度A1和A2后，解下列二元一次方程組：A1 =1AbcA+1BbcBA2 =2AbcA+2BbcB即可求得A，B兩組分各自的濃度cA和cB。一般來說，為了提高檢測的靈敏度，1和2宜分別選擇在A，B兩組分最大吸收峰處或其附近。三、儀器和試劑儀器： Cary 50紫外可見分光光度計：美國瓦里安中國有限公司； 石英比色皿2只；50mL容量瓶9只，；10mL吸量管2只。試劑：抗壞血酸：稱3mg抗壞血酸，溶于無水乙醇中，并用無水乙醇定容于100mL； 生育酚：稱8mg 生育酚溶于無水乙醇中，并用無水乙醇定容于100mL四、實驗步驟1. 配制標準溶液 （1）分別取抗壞血酸貯備液1.00、1.50、2.00、2.50mL于4只10mL比色管中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。（2）分別取生育酚貯備液1.00、1.50、2.00、2.50mL于4只10mL比色管中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。2. 繪制吸收光譜以無水乙醇為參比，在320220nm范圍測繪出抗壞血酸和生育酚的吸收光譜，并確定和。3. 繪制標準曲線以無水乙醇為參比，在波長和，分別測定步驟1配制的8個標準溶液的吸光度。4. 未知液的測定取未知液5.00mL于50mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。在和分別測其吸光度。五、數據處理1. 繪制抗壞血酸和生育酚的吸收光譜，確定和。2. 分別繪制抗壞血酸和生育酚在和時的4條標準曲線，求出4條直線的斜率，即、和。3. 計算未知液中抗壞血酸和生育酚的濃度。六、問題討論1 今有吸收光譜曲線相互重疊的三元體系混合物，能否用解聯(lián)立方程組的方法測定它們各自的含量？2設計一個用雙波長法測定本實驗內容的實驗方案。七、實驗報告要求Vc、VE紫外掃描圖，四條標準工作曲線 （要求編輯成WORD文檔打印，并作標注）結果計算報告實驗二 氣相色譜法測定酒或酊中C2H5OH含量一、目的要求1學習氣相色譜法測定含水樣品中的C2H5OH含量。2學習和熟悉氫火焰檢測器的調試及使用方法。3學習和掌握色譜內標定量方法。二、實驗原理內標法是一種準確而應用廣泛的定量分析方法，操作條件和進樣量不必嚴格控制，限制條件較少。當樣品中組分不能全部流出色譜柱，某些組分在檢測器上無信號或只需測定樣品中的個別組分時，可采用內標法。內標法就是將準確稱量的純物質作為內標物，加入到準確稱取的樣品中，根據內標物的質量m 。與樣品的質量m 及相應的峰面積A 求出待測組分的含量。待測組分質量mi與內標物質量ms 之比等于相應的峰面積之比。式中：fi 、fs 為i 組分和內標物的相對質量校正因子；Ai 、As 為i 組分和內標物的峰面積。三、實驗用品1儀器Varian CP3800毛細管氣相色譜儀 氫火焰檢測器（FID） 石英毛細管色譜柱（30m0.32mm，涂層厚0.25mm） 微量注射器 容量瓶（50mL） 吸量管（2mL 、5mL )2藥品： C2H5OH 無水 AR; n-C3H7OH 無水 AR 3 其它：食用酒 酊劑檢品四、操作步驟1色譜操作條件柱溫升溫程序：60 1min，10/min升至200，并維持5min.進樣溫度200 ，檢測器溫度300 ，N2（載氣）流速1.0mLmin-1，分流比20：1， H2流速為30mLmin-1，空氣流速300mLmin-1，尾吹氣25ml/min.2 標準溶液的測定準確移取2.50 mL 無水C2H5OH 和2.50 mL 無水n-C3H7OH于50 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.2L 標準溶液，注入色譜儀內，記錄各峰的保留時間tR，測量各峰的峰面積，求以n-C3H7OH為標準的相對校正因子。3 樣品溶液的測定準確移取5.00 mL 酒樣及2.50 mL 內標物無水n-C3H7OH于50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.2 L 樣品溶液注入色譜儀內，記錄各峰的保留時間tR，以標準溶液與樣品溶液的tR對照，定性樣品中的醇，測定C2H5OH 、n-C3H7OH的峰高及半峰寬，求樣品中C2H5OH的含量。五、數據處理本實驗C2H5OH的含量按下列公式計算：式中：iC2H5OH 的質量濃度（單位為g mL-1) ;mi樣品中C2H5OH質量（單位為g ) ; V樣品溶液體積（單位為mL ) ; 10稀釋倍數；Ai / As 樣品溶液中C2H5OH與n-C3H7OH的峰面積比；Ai/ A s標準溶液中純C2H5OH 與n-C3H7OH的峰面積比；mi標準溶液中純C2H5OH的質量，它等于體積V 乘密度 。六、思考題1. 內標物的選擇應符合哪些條件？用內標法定量有何優(yōu)缺點？2. 熱導檢測器和氫火焰檢側器各有什么特點？七、實驗報告要求附標準溶液和樣品溶液色譜圖 （要求編輯成WORD文檔打印，并作標注）結果計算報告 （注意：計算需要無水C2H5OH和無水n-C3H7OH密度，實驗中根據標簽記錄）實驗三 高效液相色譜法測定維生素B1含量一、實驗目的1. 學習和掌握含維生素樣品的處理和HPLC檢測方法。2. 進一步了解高效液相色譜儀的使用操作性能。3. 掌握標準工作曲線的建立、數據的處理及定量分析。二、實驗原理果蔬及其制品、各種飲料制品中的主要維生素B1可用高效液相色譜進行測定。樣品經過酸水解處理、離心及超濾，用C-18反相柱和甲醇-庚烷磺酸鈉溶液作流動相，在紫外280nm處定量測定。本法可同時測定維生素B2、B3、B6、B12及煙酰胺等多種維生素含量。三、材料與儀器材料：果汁。儀器：100ml量筒、燒杯、移液管、高效液相色譜儀、分析天平、0.45m濾膜、溶劑過濾器、樣品過濾器，微量進樣器等。4、 試劑 冰醋酸、三乙胺、庚烷磺酸鈉為分析純；甲醇為色譜純；維生素B1標準品（純度大于98%）。流動相的制備：0.005mol/L庚烷磺酸鈉（0.05%三乙胺和0.5%冰醋酸）-甲醇 （72:28）用0.45m膜過濾，置超聲波振蕩儀上脫氣1h，待用。維生素B1標準母液配制（1mg/mL）：稱取維生素B1 100mg，加適量水，置65水浴中振搖15分鐘，冷卻至室溫，定容至100mL。五、操作步驟（一）樣品制備取5 mL果汁至燒杯中，用流動相定容至100mL容量瓶中，再用0.45m微孔濾膜過濾，作為待測液。（二）色譜條件色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠填料Octadecylsilyl，簡稱ODS C-18柱（4.6mm250mm， 5m）；流動相：0.005mol/L庚烷磺酸鈉（0.05%三乙胺和0.5%冰醋酸）-甲醇 （72:28）流速：1.0 ml/min檢測波長：UV 280nm 柱溫：30進樣量：20l（三）標準曲線的制作 取維生素B1標準液，用倍比稀釋法稀釋成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/ml濃度，進樣量為20l，進行分離，并以各種維生素B1的濃度對峰高（或峰面積）分別制成標準曲線。在標準曲線的線性范圍內進行樣品中各種維生素B1含量的測定。（四）樣品測定取樣品處理液20l 進行色譜分析，以標準色譜圖進行對照，根據保留時間確定樣品中的維生素B1，并計算含量。六、計算按下列公式計算樣品中維生素B1的含量（C） C=N*（H/Hm）*F.50.（V/W）.（1000/1000） 式中：C各種維生素的含量，以mg/kg（L）表示 N20l維生素含量 g/20l H樣品中某種維生素的峰高（mm） Hm標準溶液中某種維生素的峰高（mm） F稀釋倍數 V樣品的定容體積（100ml） W樣品的稱取量（g或ml） 七、注意事項上機之前對各樣品及標樣用0.45m膜過濾2ml左右，并用剩余的樣品測 pH值，pH小于2.5不能上機。手動進樣時必需用力均勻，水平注入，避免進樣引起誤差。八、實驗報告要求 1、各濃度標準維生素的洗脫圖 2、樣品洗脫圖。（要求編輯成WORD文檔打?。?3、繪制標準工作曲線（在EXCEL中進行打?。?4、結果計算報告思考題1、維生素B1的測定HPLC法中樣品峰的定性依據是什么？2、通過本次實驗要想得到分離效果較好的樣品洗脫圖譜的工作條件主要取決于哪些？3、HPLC法測定維生素B1與其它方法比較有哪些優(yōu)點？實驗四 原子吸收分光光度法測定金屬元素含量一、實驗目的1 掌握原子吸收分光光度法的特點及應用； 2 了解原子吸收分光光度計的結構及其使用方法。二、原子吸收光譜法的基本原理 原子吸收光譜分析是基于從光源中輻射出的待測元素的特征光波通過樣品的原子蒸氣 時，被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子所吸收，使通過的光波強度減弱，根據光波強度減弱的程 度，可以求出樣品中待測元素的含量。 利用銳線光源在低濃度的條件下， 基態(tài)原子蒸氣對共振線的吸收符合朗伯比爾定律式中，A 為吸光度，I0 為入射光強度，Iv 為經原子蒸氣吸收后的透射光強度，K 為吸光系數，l 為輻射光穿過原子蒸氣的光程長度，N為基態(tài)原子密度。 當試樣原子化，火焰的絕對溫度低于 3000 K 時，可以認為原子蒸氣中基態(tài)原子的數目 實際上接近原子總數。在固定的實驗條件下，原子總數與試樣濃度 c 的比例是恒定的，則等 式（1）可記為： A=Kc 是原子吸收分光光度法定量分析的基本關系式。常用標準曲線法、標準加入法進行定量分析。三、儀器設備1）原子吸收分光光度計2）50mL容量瓶3）250mL容量瓶4）分析天平5）銅、鈣、鉛等的空心陰極燈四、試劑1標準貯備液（1000ug/mL）2標準使用液（100ug/mL）準確吸取10mL上述標準貯備液于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度線，搖勻備用。五、試驗步驟1. 樣品前處理樣品消化或灰化。2. 配制標準工作液3. 配制樣品溶液準確吸取適量樣液置于25mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，使測定結果落在標準曲線范圍內。4. 測定開機前先檢查水封是否有水，乙炔管道有無泄漏（空氣中有無乙炔氣味）, 打開抽風機 打開電腦以及原子吸收分光光度計電源開關。分析方法設計 進入軟件點文件選擇新建選擇分析方法（火焰法、石墨法、氫化物法等） 分析任務選擇（Cu、Pb、Ca 等）填寫數據表（批數、個數、測量次數、稀釋倍數） 展開完成儀器控制點擊自動波長精調完成檢測（準備兩杯水，一杯 調零，另一杯洗樣管） 將元素燈預熱 30min 打開空壓機，將壓力調到 0.3Mpa 打開乙炔鋼瓶閥，將出氣閥壓力調到 0.050.06Mpa 之間 調整燃燒器高度，對好光路 旋開儀器上的乙炔伐，按點火開關，點火，調節(jié)火焰大小.依次檢測標準空白（純水）、標液 14標液，未知樣品。 檢測完畢后，保存數據吸去離子水 10min，關乙炔，使管道中氣體燒完再關儀器、電腦、空壓機。六、數據及處理1. 記錄實驗條件（1）儀器型號（2）吸收線波長（nm）（3）空心陰極燈電流（mA）（4）狹縫寬度（mm）（5）燃燒器高度（mm）（6）乙炔流量（L/min）（7）空氣流量（L/min）列表記錄