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目的 了解底物濃度與酶反應(yīng)速度間的關(guān)系 學(xué)習(xí)求蔗糖酶米氏常數(shù)的方法 原理 米氏方程式v 米氏常數(shù)的求法很多 最常用的是Lineweaver Burk的作圖法 雙倒數(shù)作圖法 米氏方程式可改寫為下列倒數(shù)形式 選擇不同的 s 測(cè)定相應(yīng)的v 求出兩者的倒數(shù) 以1 s 為橫坐標(biāo) 以1 v為縱坐標(biāo)作圖 繪出一條直線 外推至橫軸相交 橫軸截距即為 1 Km 蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定 1 2 3 還原糖與3 5 二硝基水楊酸 DNS 試劑反應(yīng) 4 2020 2 5 5 儀器與試劑 1 儀器 分光光度計(jì) 恒溫水浴 試管 吸管 秒表 坐標(biāo)紙2 試劑標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 1mg mL 3 蔗糖溶液 87 7mM 0 2mol LNaAc緩沖溶液 pH4 6 0 5mol LNaOH溶液3 5 二硝基水楊酸試劑 6 操作步驟 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 將各管溶液混合均勻 在沸水浴中加熱5min 取出后立即用冷水冷卻至室溫 以蒸餾水稀釋至25mL 搖勻 測(cè)540nm處A值 以葡萄糖含量 mg 為橫坐標(biāo) A值為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 7 取試管8支編號(hào) 按下表將蔗糖溶液 醋酸緩沖液分別加入試管 于37 水浴中保溫10min 一定量酶液同一水浴中保溫約10min 于各管中依次按同樣間隔 0 5min 加入已保溫過(guò)的酶液1 0mL 計(jì)時(shí) 立即搖勻 在37 中準(zhǔn)確溫浴5min 按同樣次序和時(shí)間間隔 加入1mL0 5mol LNaOH 搖勻 終止反應(yīng) 吸取反應(yīng)物1 0mL 加入盛有3 0mL3 5 二硝基水楊酸試劑和1 0mL水的試管中混勻 放入沸水浴中加熱5min 冷卻后稀釋至25mL 搖勻 在540nm比色測(cè)定A值 以A值對(duì)應(yīng)的葡萄糖量為相對(duì)反應(yīng)速度 以1 S 為橫坐標(biāo) 1 v為縱坐標(biāo)作圖

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