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人的外周血淋巴細胞培養(yǎng) 摘 要 淋巴細胞是免疫系統(tǒng)中最重要的細胞，在免疫中起關鍵作用，維持內環(huán)境的穩(wěn)定。對人的外周血淋巴細胞進行染色體核型分析對人類遺傳研究及臨床應用有重大意義。每一物種都有一定數目及一定形態(tài)結構的染色體，可在顯微鏡下觀察到。本次實驗的目的就是掌握人體微量血液體外培養(yǎng)制備染色體標本的方法并學習對人的外周血淋巴細胞進行核型分析。每1ml 外周血中一般含有約13106個小淋巴細胞， 幾乎都處于G1期或G0期的非增殖狀態(tài) ，一般情況下是不再分裂的。但當在培養(yǎng)液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴細胞受刺激便轉化為淋巴母細胞，重新進入增殖周期，進行有絲分裂。經過6672小時(三個周期)的短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得大量的有絲分裂相細胞，從而進行染色體標本制備和核型分析。這種微量全血培養(yǎng)技術已在臨床醫(yī)學、病毒學、藥理學、遺傳毒理學等方面得到了廣泛應用。本實驗采取了人類的外周血進行實驗，經各種技術處理后最后得到較為清晰的人體染色體照片。 通過實驗發(fā)現(xiàn)：人類每個體細胞有46條染色體，22對常染色體和一對性染色體，男性是46，XY；女性是46，XX。 根據染色體的形態(tài)、大小、及著絲粒的位置，將人的外周淋巴細胞的46條染色體分為A、B、C、D、E、F、G7組共23種類型。 關鍵詞 人的外周血淋巴細胞 染色體 低滲溶液 核型分析 秋水仙素 動物細胞體外培養(yǎng) Human Peripheral Blood Lymphocyte Culture Abstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.In human bodys 1ml circumference blood includes approximately 13106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 6672 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro whole blood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.Key words: Human blood lymphocytes Chromosome Low permeability solution Karyotype analysis Autumn daffodils element zooblast in vitro raise offcenter前 言 細胞培養(yǎng)技術是目前生命科學研究領域的一項常用而重要的技術，它涉及的技術有：無菌操作技術、細胞分離技術、細胞培養(yǎng)技術、顯微攝影技術、圖像分析技術等。Moorhead和Levan等(1960)建立的人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)技術，以及Rothrels等(1958)建立的氣干法制片技術，成了研究人與哺乳類染色體的最主要技術。這種取材簡易、用血量少的培養(yǎng)方法已被臨床醫(yī)學、病毒學、藥理學，遺傳毒理學等方面廣泛采用。細胞培養(yǎng)是一種程序復雜而又要求十分嚴謹的實驗技術。要使細胞在體外長期生存，必須模擬體內環(huán)境，共給細胞存活所必需的條件。如供給適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及有關的生長因子；氧氣及適宜的溫度；注意調節(jié)其外環(huán)境的酸堿度（pH）與滲透壓；以及為排除細胞代謝產物的危害，保持良好適宜的外環(huán)境而進行必需的傳代等等。所有這一切條件與操作都要保持在無菌條件下進行。人們對許多動植物的染色體進行廣泛研究【1】，并取得了可喜成果，可對哺乳動物及人類染色體研究進展不大。其原因在于：1）不易獲得分裂過程中的細胞；2）過去的傳統(tǒng)方法多為切片、壓片，對描述染色體結構不準確，技術不高；3）人類染色體數目多，大小不同，彼此重疊。1912年，Warfter 最先研究人類染色體。1923年，報道人類染色體的二倍體為48條。1956年，J.H.Tjio A.Levan 培養(yǎng)人胚組織細胞，計數人體細胞染色體數為46條。1960年，Moorhead建立人體外周血培養(yǎng)技術，使染色體的研究躍進一步。1968年，T.U. Casperssan提出染色體顯帶技術。自1956年Tjio（莊有興）和Levan確定人類染色體數目為46個后，在1960年的Denver會議和1963年的London會議制定了統(tǒng)一的人類染色體命名體制：按照染色體的相對長度、臂比和著絲粒指數，將常染色體（22對）按大小用阿拉伯數字標記，順次排列為122號，性染色體用X和Y標記；并按染色體大小和著絲粒位置，把人類染色體分為七個組，用大寫字母AG表示，把人的46個染色體分為7個群【2】。但對識別每一個染色體仍有很大困難，尤以C組更難區(qū)別。1970年，發(fā)現(xiàn)染色體分化染色，并于1971年召開了國際性巴黎會議，為G、Q、C和R帶四種分帶技術建立了命名法。以后又逐步建立了Giemsa11分化染色法及染色體脆性位點顯示法。為染色體遺傳病診斷、雜種細胞檢定、特殊細胞株標記、染色體的識別等開創(chuàng)了一系列檢測方法，大大加速了染色體研究的進展。 細胞遺傳學組織培養(yǎng)技術為人類染色體的研究提供了條件。技術突破主要在于【3】4：1）人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)和PHA的應用。PHA 是從菜豆種子中提取出來的，大量的PHA具有凝血作用。如果適合，可刺激細胞轉為母細胞，從而進行有絲分裂。2）秋水仙素的應用。秋水仙素可阻斷紡綞體截止于中期，使染色體個體大，結構清晰，縮短適度，細胞質粘度降低。3）低滲處理（水或0.075mlKCl）使紅細胞脹破，白細胞脹大，染色體空間變大，易伸展,便于觀察。 通過本實驗掌握人體外周血離體培養(yǎng)制備染色體標本的方法。人體外周血的形成包括紅細胞、白細胞、血小板，其中紅細胞和血小板不能離體培養(yǎng)，白細胞中含有小淋巴細胞。 所謂外周血培養(yǎng)即是將外周血接種在適當的培培養(yǎng)物中加入適量的秋水仙素，使紡錘體微管解聚，這樣細胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細胞。外周血淋巴細胞是不能增殖的分化細胞群，在體外無菌培養(yǎng)條件下，若于培養(yǎng)基中植物凝集素(PHA)則可刺激處于G1期或G0期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，重新有絲分裂的能力，經一段時間的培養(yǎng)，秋水仙素的處理 ，低滲和固定， 即可獲得大量分裂期細胞以供染色體分析。秋水仙素可通過干擾微管組裝而抑制紡錘絲形成，使細胞分裂順利進入后期而停滯于中期，從而可在短期內積累大量最適于進行染色體分中期分裂相【5】。此外，秋水仙素還能使染色單體縮短、分開，使染色體呈現(xiàn)明顯形而利于辨認。本實驗中采用體外培養(yǎng)和低滲技術。體外培養(yǎng)的原理是將離體的細胞放入培養(yǎng)基中進行生長繁殖，保持細胞的生命活力，便以對細胞進行各方面的研究。通過許多學者的改進和革新，培養(yǎng)基由天然的動物血漿改為合成培養(yǎng)基，促進細胞生長的物質從胎汁改為動物血清，本實驗中用的小牛血清。體外培養(yǎng)技術已經廣泛應用在雜交瘤技術制備單克隆抗體，動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，微生物制藥技術，基因轉染與細胞融合以及細胞轉化工程技術等方面。低滲處理的目的是使水分通過細胞膜向細胞內滲入，導致轉化的淋巴細胞，染色體進一步分散而利于分析。同時，低滲處理還可使紅細胞質膜破裂，經后血影浮于上清中被去除，后續(xù)的固定過程主要針對淋巴細胞，改善了淋巴細胞的固定質量及標本質量。1材料1.1 材料 人的外周血淋巴細胞1.2 藥品 1.2.1 RPMI1640培養(yǎng)基6，含有20種氨基酸，維生素，生物素，碳水化合物，無機物。1.2.2 肝素，作為抗凝劑使用，主要起抗凝血作用。1.2.3 秋水仙素，作為有絲分裂的阻止劑，它能改變細胞質的粘度，抑制細胞分裂時紡錘體形成，使細胞分裂停留在中期。 1.2.4 植物凝血素（PHA），是淋巴細胞有絲分裂刺激劑，激活細胞分裂 。1.2.5 雙抗：青霉素、鏈霉素為廣譜抗生素，殺菌。1.2.6 0.9%生理鹽水，維持人的外周血淋巴細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。1.2.7 固定液，甲醇：冰醋酸=3：1使血清蛋白、核蛋白凝固。1.2.8 姬姆薩染液，Giemsa染色液使染色體染色。1.2.9 0.1mol/L 磷酸緩沖液(pH7.47.6)，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。1.2.10 低滲液：0.075mol/L KCl或蒸餾水。使細胞脹大，染色體鋪展，輪廓清晰，染色增強。1.2.11 3.5NaHCO3溶液，調節(jié)pH值。1.2.12 小牛血清，促進細胞繁殖和維持pH值。1.3 藥品的配制RPMI“1640”培養(yǎng)基：稱取“1640”粉末1.05克，用100ml的蒸餾水溶解，加入NaHCO3 0.11克，吹CO2氣體校正pH至7.2。肝素：稱取肝素鈉8毫克，用2ml的生理鹽水溶解，此溶液的濃度為500單位ml。秋水仙素：稱取秋水仙素1毫克，用25ml生理鹽水溶解，此溶液的濃度為40微克/毫升。取0.1mL的該溶液加入5毫升的培養(yǎng)物中，其最終濃度為0.8微克/毫升。植物凝血素(PHA)：取3支加6ml蒸餾水溶解。青霉素（每瓶80萬單位）：以8ml生理鹽水稀釋，得10萬單位/ml；以160ml生理鹽水稀釋，則得5000單位/ml。取0.1ml加入5ml培養(yǎng)基中，則最終濃度為100單位ml。鏈霉素（每瓶100萬單位）：以1ml生理鹽水稀釋，得100萬單位/ml；以200ml生理鹽水稀釋，則得5000單位/ml。取0.1ml加入5ml培養(yǎng)基中，則最終濃度為100單位ml。0.9%生理鹽水：稱取氯化鈉2.7克，溶解于300ml的蒸餾水中。固定液：甲醇:冰醋=3:1配制。姬姆薩染液：0.5克姬姆薩粉末，加33ml純甘油，在研缽中研細，放在56水浴鍋中保溫90分鐘，再加入33ml甲醇，充分攪拌，用濾紙過濾，收集在棕色細口瓶中中保存，作為原液。用時以磷酸緩沖液110稀釋。0.1molL磷酸緩沖液： pH 7.47.6Na2HPO4 12H2O 28.8克KH2PO4（無水） 2.67克 溶解于1000ml雙蒸餾水中。 低滲液：0.075mol/LKCl或蒸餾水。3.5NaHCO3溶液：稱取NaHCO33.5克，溶解于100ml的蒸餾水中。1.4 器具 電子天平 移液管 2mL滅菌注射器 試管架 量筒 燒杯 試劑瓶 培養(yǎng)瓶 毛細吸管 采血針 恒溫培養(yǎng)箱（37） 離心機 離心管 酒精燈 顯微鏡 載玻片 2.方法2.1 培養(yǎng)液的分裝：超凈工作臺中，用移液管將下列溶液按要求裝入培養(yǎng)瓶內： 培養(yǎng)液（ RPMI-1640） 4mL小牛血清 1mLPHA 0.2mL肝素 0.05mL雙抗 濃度為100單位/mL用3.5NaHCO3（無菌）調pH至7.2。擰緊蓋子，置于0條件下保藏。 用前從冰箱中取出放在37恒溫鍋中溫育10min。 2.2 采血：用2mL滅菌注射器吸取肝素0.05mL濕潤管壁管壁，用酒精棉在一手指尖消毒，待酒精揮發(fā)后用消過毒的采血針取適量血，用毛細血管吸取并將血吹培養(yǎng)瓶中，充分搖勻后置370.5恒溫箱內培養(yǎng)。2.3 培養(yǎng)：置37恒溫箱內培養(yǎng)69h。用蒸餾水2.4 秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前2.5h，在培養(yǎng)液中加入秋水仙素0.1mL，最終濃度為0.8 g/mL。 2.5 收集細胞：將培養(yǎng)物轉入潔凈離心管中。2.6 載玻片的冰浴處理：于燒杯中用蒸餾水浸泡載玻片，放到冰箱中備用。2.7 低滲處理: 加入預溫37的5mL 蒸餾水, 用吸管輕輕吹打成細胞懸液, 37恒溫箱內處理 20min，使紅細胞破碎，白細胞膨脹。2.8 離心：1000r/min ，離心5min, 棄去上清液，收集白細胞。2.9 固定：固定液為甲醇:醋酸=3:1。每只離心管中加入固定液2mL,片刻后用滴管輕輕沖打成細胞懸液，在室溫中固定15min后,離心，吸棄上清液,留下白細胞。2.10 再固定: 加入固定液2 mL，用吸管輕輕打散，室溫中繼續(xù)固定15min。2.11 再離心：1000r/min離心5min, 棄去上清液，留下白細胞制片。2.12 制懸液：棄上清液后，視細胞數量多少加入適量固定液制成細胞懸液。向離心管中加入固定液0.5mL,用滴管輕輕沖打成細胞懸液。2.13 滴片：用吸管吸取細胞懸液自1m高滴在從冰箱中取出的一張干燥潔凈的載玻片上，輕輕吹散，在酒精燈上微微烤干。2.14 染色：用磷酸緩沖液（pH 7.4）稀釋過的姬姆薩染液(1：10）染色20min，倒去染液，用蒸 餾水輕輕沖洗。2.15 鏡檢：待稍干后，顯微鏡觀察。低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，再在油鏡下觀 察，選擇染色體清晰，分散度好的細胞進行核型分析。 3.實驗結果3.1結果：人體外周血淋巴細胞染色體（46,XY）示意圖 理論上應該觀察到的染色體圖: 人體外周血淋巴細胞染色體圖（，XY）實驗所得染色體圖: 人體外周血淋巴細胞染色體圖（，XY）3.2核型分析3.2.1計算：三個參數： 單個染色體長度1000染色體的相對長度 22條常染色體長度+1條X染色體長度短臂長度著絲粒指數 100 染色體全長長臂長度（q）臂比率 短臂長度（p） 3.3.2常規(guī)染色體核型分析 (1)染色體是遺傳物質的載體，存在于分裂間期細胞的細胞核內。每一個體細胞含有兩組染色體組，一組來自父方，一組來自母方，用2n表示。其中與性別直接有關的染色體，即性染色體，可以不成對。人類每個體細胞有46條染色體，22對常染色體和一對性染色體，男子是46，XY；女子是46，XX。 (2)染色體在復制以后，縱向并列的兩個染色體，往往通過著絲粒連在一起。著絲粒在染色體的位置是固定的。由于著絲粒位置的不同，可以把染色體分成相等或不等的兩臂，造成中間著絲粒，亞中間著絲粒，亞端部著絲粒和端部著絲粒等形態(tài)不同的染色體。此外，有的染色體還含有隨體和次級縊痕。所有這些染色體的特異性構成一個物種的染色體組型。染色體的核型反映了細胞中染色體數量和結構的特征。根據染色體的形態(tài)、大小、及著絲粒的位置，將人的外周血淋巴細胞的46條染色體分為A、B、C、D、E、F、G 7組共23種類型。每組染色統(tǒng)體形態(tài)大小不同，X染色體歸入C組，Y染色體歸入G組。7本實驗的人外周血淋巴細胞采于他人（男性）。根據各組染色體的特征予以分組：A組：（N0103）是最大的一組染色體，它們的著絲粒在中部或幾乎在中部；B組：（N0405）為兩對大的亞中著絲粒染色體，它們有明顯的長臂和短臂；C組：（N0612+X）為中等大小的亞中著絲粒染色體，它們大小相差不多，X染色體大小介于期間，一般難以區(qū)分；D組：（N01315）為中等大小的端著絲粒染色體，它們的一個重要形態(tài)特征是隨體，隨體是一對著色很深的小球，處于短臂的末斷，隨體與短臂之間的區(qū)域很少著色；E組：（N01618）為一對中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體和一對近端著絲粒染色體；F組：（N01920） 為兩對小的中著絲粒；G組：（N02122+Y）為最小的一組端著絲粒染色體，在N02122的短臂上可見隨體，Y常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深，可以識別。（3）下圖為人的外周血淋巴細胞染色體組型分析圖 ：男（46，XY） 人類的染色體組型分析圖 男（46，XY） 4.分析與討論4.1培養(yǎng)條件對實驗結果的影響： 培養(yǎng)液 培養(yǎng)時間 PHA pH 培養(yǎng)液： 一定范圍內培養(yǎng)價值愈高，轉化率相對也較高；過酸或過堿都會影響細胞生長，最適pH為7.2-7.4 。 培養(yǎng)時間: 在一定限度內，培養(yǎng)時間越長，轉化率越高。但如果用PHA激發(fā)，培養(yǎng)超過4-5天，轉化率反而降低，故通用時間為72小時。 PHA： 國內所用PHA一般為粗制品（英文縮寫為PHAM，含多糖的蛋白質成分；精制品PHAP，純蛋白質成分）。在正式實驗前，必須測定所選用產品的最適濃度，即將PHA稀釋成不同濃度，按正式實驗方法檢測同一樣本。PHA濃度太高時細胞有毒性，太低不足以刺激T細胞轉化，一般最適濃度為50-200g/ml。PHA添加很重要，如保存不善，效價低或數量不足，則作用差，但濃度過大，紅細胞凝塊，這些都會影響細胞生長。pH: 不適于細胞生長的環(huán)境 4.2染色體標本制備過程中有兩個重要環(huán)節(jié)，其原理是：(1)低滲處理：目的是使水分通過細胞膜向細胞內滲入，導致轉化的淋巴細胞，染色體進一步分散而利于分析。同時，低滲處理還可使紅細胞質膜破裂，經后血影浮于上清中被去除，后續(xù)的固定過程主要針對淋巴細胞，改善了淋巴細胞的固定質量及標本質量。(2)固定：目的在于盡快使細胞的結構固定于接近存活的狀態(tài)，以便作進一步處理，若不固定則可因細胞內蛋白質分解而導致結構變化。染色體研究中常用固定液為甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸滲透力強，固定迅速，但易使組織膨脹而甲醇則可使組織收縮，兩者混合使用能抵消各自的缺點，得到較好的固定效果。固定液純度要高，臨用時新鮮配制，應沿管壁慢慢加入后打勻，如果固定液加入太快，會使固定作用過強，染色體扭轉；固定液作用不足，染色體出現(xiàn)毛刷狀。4.3染色體標本質量不佳的原因。如果淋巴細胞轉化試驗表明培養(yǎng)物生長發(fā)育良好，但制成的標本質量不佳時，其原因可能為：（1）秋水仙素處理不當：一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定的關系，如果處理時間太短，則標本中的分裂細胞就少，相反，如果處理時間太長，則標本中的分裂細胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。（2）低滲處理不當：低滲處理細胞時間過長，細胞膜往往過早破裂，以致分裂細胞或染色體丟失；如果處理時間不足時，細胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進行染色體計數分析。（3）離心速度不合適：如果從培養(yǎng)瓶收集細胞后進行離心時的速度太低，細胞可能被丟失；如果細 胞被低滲后離心速度過高，往往使分裂細胞過早破裂，分散良好的分裂相丟失，以致制出的標本分裂相較少或大部分為剩余的分散不好的分裂相。（4）標本固定不充分：如固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質量不佳，此時染色體形態(tài)模糊、不分散，其周圍有細胞漿的藍色背景。（5）載玻片清洗不徹底：玻片有油跡，致使滴在載玻片上的細胞懸液不能均勻分散，且細胞隨液體流動而丟失。（6）載玻片冷凍不夠：合適的冰濕玻片，從冰水中拿出時，其表面有一層霜雪。如冷凍不夠則無此現(xiàn)象，此時細胞難以貼附在載玻片上。（7） 血樣不同實驗效果有異，據觀察采血后三周，染色體效果最佳。可能是血樣的差異以及觀察時間影響實驗結果。（8） PHA添加很重要，如保存不善，效價低或數量不足，則作用差，但濃度過大，紅細胞凝塊，這些都會影響細胞生長。（9） 在培養(yǎng)中成敗的關鍵，除了至為重要的PHA的效價外，培養(yǎng)的溫度和培養(yǎng)液的酸堿度也十分重要。人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)最適溫度為370.5。培養(yǎng)液的最適pH7.27.4。（10）培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕振蕩，使凝塊散開，繼續(xù)放回37恒溫箱內培養(yǎng)。（11）制片過程中，如發(fā)現(xiàn)細胞膨脹得不大，細胞膜沒有破裂，染色體聚集一團伸展不開，可將固定時間延長數小時或過夜。（12）無菌操作是培養(yǎng)成敗的關鍵，采血時要注意無菌操作，試劑配置要進行無菌過濾，所用培養(yǎng)器械要進行滅菌處理。（13）細胞太多或太少亦能影響分裂相的多少，及標本質量。4.4核型圖中染色體有的變粗，而有的很細小。造成這種結果的原因可能是秋水仙素處理不徹底，一部分染色體加倍，而一部分沒有。5. 實驗注意事項（1）載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。（2）人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)的最適溫度是36.537.5，培養(yǎng)液的最適pH是7.27.4。（3）培養(yǎng)過程中如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕振蕩，使凝塊散開，繼續(xù)在37恒溫箱內培養(yǎng)。 （4）制片過程中，如發(fā)現(xiàn)細胞膨脹的不大，細胞膜沒有破裂。染色體沒有凝集在一團伸展不開，可將固定時間延長數小時或過夜。同時正確的掌握制片技術。8（5）秋水仙素的處理，低滲和固定，可獲得大量的有絲分裂細胞。（6）