ELISA使用方法.ppt

免疫酶技術(shù) 基本原理 免疫標(biāo)記技術(shù) immunolabellingtechnique 是指用熒光素 放射性同位素 酶 發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑 標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng) 特點(diǎn) 高度靈敏 特異 快速 定性 定量 定位分類 免疫熒光技術(shù) 放射免疫技術(shù) 免疫酶技術(shù) 免疫電鏡技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測(cè)定 免疫酶技術(shù) 是利用酶標(biāo)記抗體或抗原 以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù) 實(shí)驗(yàn)一 ELISA方法檢測(cè)人血清中IgG 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) enzymelinkedimmunosor bentassay ELISA 是一類常用的免疫酶技術(shù) 是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面 使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行 常用的酶 辣根過氧化物酶底物為鄰苯二胺 常用的方法 間接法 雙抗體夾心法和抗原競爭法 雙抗體夾心法 用于檢測(cè)特異抗原 將已知抗體包被固相 加入待檢標(biāo)本 標(biāo)本中含有相應(yīng)抗原即與固相上的抗體結(jié)合 洗滌去除未結(jié)合成分 加入該抗原特異的酶標(biāo)記抗體 加底物顯色 目的 掌握ELISA技術(shù) 檢測(cè)血清中IgG含量材料 抗人IgG抗體 羊抗人IgG抗體 一抗 已知IgG含量的參考蛋白 作標(biāo)準(zhǔn)系列 待檢人血清辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體 二抗 包被液 PH9 60 05mol L碳酸鹽緩沖液洗滌液 PH7 40 01mol LPBS底物溶液 OPD H2O2終止液 2mol LH2S04酶標(biāo)反應(yīng)板 一排 人 操作步驟 包被 用一抗包被 已做 洗滌3次 將洗液加入每孔 3min后傾去 加樣 將已知含量的參考蛋白IgG倍比稀釋7孔 第8孔加待檢血清 第9孔加陰性血清第10孔作空白對(duì)照 100ul 孔 100ul稀釋液 待測(cè)血清 PBS T20 100ul標(biāo)準(zhǔn)品 100ul 100ul 孵育 37 40min 洗滌3次加酶標(biāo)記的抗人IgG抗體 即二抗 100ul 孔 孵育 37 40min 洗滌3次顯色 加底物溶液 100ul 孔 室溫避光15 30min 終止反應(yīng)檢測(cè) 490nm波長下檢測(cè) 結(jié)果觀察與分析 空白對(duì)照應(yīng)無色 陽性孔呈棕黃色 標(biāo)準(zhǔn)系列各孔呈明顯的顏色深淺梯度 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 注意事項(xiàng) 做倍比稀釋時(shí) 應(yīng)從高濃度到低濃度 顯色時(shí)一定避光 檢測(cè)時(shí)應(yīng)避免孔中有氣泡 實(shí)驗(yàn)二 APAAP法檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群 原理 用抗人T細(xì)胞CD的McAb與T細(xì)胞的反應(yīng) 用羊抗鼠IgG搭橋 其中一個(gè)Fab段連接抗T的McAb 另一個(gè)Fab段連接APAAP復(fù)合物 再通過復(fù)合物中的堿性磷酸酶催化底物顯色來判斷CD分子的存在 從而確定T細(xì)胞的各亞群 優(yōu)點(diǎn) 不經(jīng)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng) 避免了抗體和酶活性降低 省去酶標(biāo)記抗體需純化的繁瑣過程 標(biāo)本易于檢測(cè) 保持時(shí)間長 應(yīng)用 淋巴細(xì)胞分化抗原 活化抗原 MHC 類抗原表達(dá)的檢測(cè) APAAP法檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群示意圖 目的 T細(xì)胞亞群檢測(cè)材料APAAP試劑盒 含CD3 CD4 CD8McAb TBS緩沖液Mayer蘇木精復(fù)染液純丙酮鼠抗人T亞群單克隆抗體 一抗 羊抗鼠IgG 二抗 操作步驟 1 分離PBMC PBS調(diào)整PBMC濃度 已做 2 甩片 固定 干燥 標(biāo)記 已做 3 加一抗 鼠抗人 10ul 37 濕盒孵育 30min PBS洗3次 擦片4 加二抗 羊抗鼠 10ul 37 濕盒孵育 30min PBS洗3次 擦片5 APAAP復(fù)合物10ul 鼠抗AP 37 濕盒孵育 30min PBS洗3次 擦片6 堿性磷酸酶底物顯色 37 濕盒孵育 30min PBS洗3次 擦片7 Mayer蘇木精復(fù)染1min 自來水沖洗8 高倍鏡下觀察 結(jié)果觀察 陽性細(xì)胞 細(xì)胞膜上或胞漿著色為紅色陰性細(xì)胞 細(xì)胞膜上或胞漿著色為無色計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分率 100 200個(gè) 正常值 CD2 CD3陽性細(xì)胞 60 80 CD4陽性細(xì)胞