凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量.doc

凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解凝膠層析（Gel Chromatography）的原理及其應(yīng)用。2. 通過測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的訓(xùn)練，初步掌握凝膠層析技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理凝膠層析又稱凝膠排阻層析（Gel Exclusion Chromatography），凝膠過濾（Gel Filtration），滲透層析（Gel Permeation Chromatography）或分子篩層析（Molecular Sieve Chromatography）等。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個(gè)組分的液相色譜方法。凝膠層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽、去熱源等各種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)過程之中。測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量也是它的重要應(yīng)用之一。凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且呈多孔的不溶性珠狀的顆粒物質(zhì)。用凝膠來分離物質(zhì)，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質(zhì)分子（近似于球形）具有不同的排阻效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。即它是根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。對于某種型號(hào)的凝膠，一些大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而完全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴(kuò)散，滲透進(jìn)入凝膠內(nèi)部的篩孔，而后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進(jìn)入凝膠內(nèi)部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之間，只能進(jìn)入一部分凝膠較大的孔隙，即被部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達(dá)到分離的目的。對于任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱中被排阻的范圍均在0100%之間，其被排阻的程度可以用有效分配系數(shù)Kav（分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示，Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（V0）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)：Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0）。在限定的層析條件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是隨著分離物分子質(zhì)量的變化而改變。分子質(zhì)量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小則Ve值大，Kav值大。有效分配系數(shù)Kav是判斷分離效果的一個(gè)重要的參數(shù)，同時(shí)也是測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的一個(gè)依據(jù)。在相同層析條件下，被分離物質(zhì)Kav值差異越大，分離效果越好。反之，分離效果差或根本不能分開。在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中，我們可以實(shí)測出Vt、V0及Ve的值，從而計(jì)算出Kav的大小。對于某一特定型號(hào)的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，Kav和lgMr成線性關(guān)系： Kav = -blg Mr + C 其中b，C 為常數(shù)。同樣可以得 Ve = -b lg Mr + C, 其中、為常數(shù)?？梢酝ㄟ^在一凝膠柱中分離多種已知分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)后，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用同一凝膠柱測出其他未知蛋白的分子質(zhì)量。三、實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)試劑（一） 器材1. 玻璃層析柱。2. HL-1型恒流泵。3. BSE-100型自動(dòng)部分收集器。4. 8823B紫外檢測儀。5. SPECORD-200紫外分光光度計(jì)。6. TYPE3057 Portable Recorder記錄儀。7. 100ml試劑瓶。8. 50ml、100ml量筒各一個(gè)。9. 50ml、100ml、250ml、500ml燒杯各一個(gè)。10. 10ml刻度試管。11. 膠頭滴管。12. 玻璃棒。（二）試劑1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白（1） 牛血清白蛋白：Mr=67 000（上海生化所）（2） 雞卵清清蛋白： Mr =45 000（美國SIGMA公司）（3） 胰凝乳蛋白酶原A：Mr =24 000（4） 溶菌酶： Mr =14 3002. 未知蛋白樣品（由實(shí)驗(yàn)室制備）3. 洗脫液0.025mol/L KCL-0.1 mol/L HAC4. 藍(lán)色葡聚糖-2000四、實(shí)驗(yàn)操作和具體過程（一） 凝膠的溶脹稱取7g Sephadex G-75 于250 ml燒杯中加入洗脫液100ml，置于室溫溶脹23天，反復(fù)傾瀉去掉細(xì)顆粒，然后減壓抽氣去處凝膠孔隙中的空氣，沸水浴中煮沸23小時(shí)（可去處顆粒內(nèi)部的空氣以及滅菌）。（二） 裝柱1. 取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺(tái)上。2. 凝膠柱總體積（Vt）的測定：在距離柱上端5cm處作一個(gè)記號(hào)，關(guān)閉柱出水口，加入去離子水，打開出水口，液面降至柱記號(hào)處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接受柱中去離子水（水面降至層析柱玻璃篩板），讀出的體積即為柱床總體積Vt。也可以最后走完未知蛋白后再測定Vt。3. 在柱中加入洗脫液（約1/3柱床高度），將凝膠濃漿緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1cm2cm高度后打開出水口，流速一般用56ml/10min。膠面上升到柱記號(hào)處則裝柱完畢，注意裝柱過程中凝膠不能分層。然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，待凝膠完全沉降，則接上恒流泵，用12倍柱床體積的洗脫液平衡柱子，使柱床穩(wěn)定。（三） V0和未知蛋白Ve的測定按實(shí)驗(yàn)要求安裝和連接好各種儀器。把記錄儀的記錄時(shí)間調(diào)節(jié)到2cm/h，調(diào)節(jié)恒流泵的速度為56ml/10min，紫外檢測儀置于0.5A檔。檢查無誤后再開始下一步操作。吸去柱上端的洗脫液（切不可攪亂膠面，可覆蓋一張濾紙或尼龍網(wǎng)）。打開出水口，使殘余液體降至與膠面相切（但不要干膠），關(guān)閉出水口。用細(xì)滴管吸取0.5ml（5mg/ml）藍(lán)色葡聚糖-2000和未知蛋白（8mg/ml）的混合液，小心地繞柱壁一圈（距離膠面2mm）緩慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打開出水口（開始收集?。芤簼B入膠床后，關(guān)閉出水口，用少許洗脫液加入柱中，滲入膠床后，柱上端再用洗脫液充滿后用56ml/10min的速度開始洗脫，自動(dòng)收集器收集時(shí)間為5min每管。最后作出洗脫曲線。收集并量出從加樣開始至洗脫液中藍(lán)色葡聚糖濃度最高點(diǎn)的洗脫液體積即為V0。繼續(xù)收集洗脫液，直至未知蛋白洗出，以洗脫液作空白參比，紫外分光光度計(jì)280nm處比色，測出最大吸收峰。注意：藍(lán)色葡聚糖和未知蛋白洗下來之后，還要用洗脫液（12倍床體積）繼續(xù)平衡一段時(shí)間，以備下步實(shí)驗(yàn)使用。（四） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1. 用洗脫液配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液供全班使用，溶液中三種蛋白的濃度各為：牛血清清蛋白（5mg/ml）、雞卵清清蛋白（8mg/ml）、胰凝乳蛋白酶原（5mg/ml）、溶菌酶蛋白（5mg/ml）。2. 在裝樣前應(yīng)該測定此時(shí)的柱床體積，因?yàn)樵擉w積可能和上次不同，如果有變化則應(yīng)在之后的計(jì)算中進(jìn)行修正。3. 按（三）的操作方法加入上述標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0.5ml，以56ml/10min的速度洗脫并收集洗脫液。注意控制每管的流速為1.51.8ml/3min/管。此時(shí)把紫外檢測儀置于0.2A檔。4. 用紫外分光光度計(jì)逐管測定A280，并確定各種蛋白的洗脫峰最高點(diǎn)，然后量出各種蛋白的洗脫體積Ve。5. 以A280為縱坐標(biāo)，Ve為橫坐標(biāo)畫出標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫曲線。6. 以Kav為縱坐標(biāo)，LogMr為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。7. 以Ve為縱坐標(biāo)，LogMr為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。8. 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知蛋白的LogMr，其反對數(shù)便是待測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。9. 在實(shí)驗(yàn)完畢后，必需將凝膠回收處理，以備下次使用，嚴(yán)禁將凝膠丟棄或倒入水池中。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論（一）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原始數(shù)據(jù)（1） 恒流泵設(shè)定流速：5.4ml/10min (測定藍(lán)色葡聚糖+未知蛋白) 5.8ml/10min (測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白)（2） 自動(dòng)部分收集器設(shè)定：3.2ml/5min55s/管 (測定藍(lán)色葡聚糖+未知蛋白) 3.2ml/5min30s/管(測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白)（3） 層析柱內(nèi)凝膠總體積Vt（即柱床體積）：Vt=99ml (測定藍(lán)色葡聚糖+未知蛋白) Vt=98.4ml (測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白)（4） 洗脫液A280吸光度測定數(shù)據(jù)：具體數(shù)據(jù)請見下表（表1和表2） 表1 藍(lán)色葡聚糖+未知蛋白A280吸光度測定數(shù)據(jù)（藍(lán)色消失后測得各管吸光值如下）管號(hào)0（對照） a b c d e fA280 0管號(hào) g h iJ(最藍(lán)) 1 2 3A280 0.022管號(hào) 4 56（最大） 7 8 9 10A280 0.042 0.101 0.153 0.146 0.096 0.053 0.023表2標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)A280吸光度測定數(shù)據(jù)牛血清清蛋白、雞卵清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原 管號(hào)1234567A2800.000-0.001-0.0010.0000.002-0.001-0.001管號(hào)891011121314A280-0.001-0.0020.0690.4200.2520.1430.137管號(hào)15161718192021A2800.1390.1500.1860.2350.2640.2930.346管號(hào)22232425262728A2800.4010.4070.3480.2410.1440.0750.032管號(hào)29303132333435A2800.0130.0070.0050.0080.0060.0050.002（5） 凝膠層析洗脫體積數(shù)據(jù)記錄：洗脫體積請見下表（表3和表4）表3 藍(lán)色葡聚糖+未知蛋白洗脫體積數(shù)據(jù)藍(lán)色葡聚糖+未知蛋白洗脫峰最高峰值所在管號(hào)洗脫體積第一洗脫峰J35.2ml第二洗脫峰659.7ml 表4標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)洗脫體積數(shù)據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（牛血清清蛋白、雞卵清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原） 洗脫峰最高峰值所在管號(hào)洗脫體積第一洗脫峰 11 35.5ml第二洗脫峰 23 70.0ml 第三洗脫峰 32 97.4ml1.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理（1） 凝膠層析柱柱床體積Vt：測藍(lán)色葡聚糖+未知蛋白時(shí)：Vt=99ml測標(biāo)準(zhǔn)蛋白時(shí)： Vt=98.4ml（2） 利用表1中的數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫曲線。以收集管數(shù)（由于每管收集的體積為3.2ml，所以管數(shù)X3.2ml即為洗脫體積）為橫軸，以280nm的吸光度值為縱軸，做出連續(xù)的平滑曲線，如下圖1所示。 圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白洗脫曲線從此圖中可以看到三個(gè)吸收峰分別在第11管、第23管和第32管左右出現(xiàn)，由于三種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量依次減小，而分子量大的蛋白會(huì)先洗脫出來，所以其中第一個(gè)峰為牛血清白蛋白（Mr=67,000）的吸收峰，第二個(gè)峰為雞卵清清蛋白（Mr =45,000）的吸收峰，第三個(gè)峰為胰凝乳糖蛋白酶原A（ Mr =24,000)的吸收峰。未知蛋白的洗脫體積Ve也通過量筒測出。各蛋白有效分配系數(shù)Kav和洗脫體積的計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)有效分配系數(shù)的計(jì)算公式，其中凝膠柱的總體積在兩次測量時(shí)是可能是不同的，所以在計(jì)算未知蛋白的有效分配系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的有效分配系數(shù)時(shí)，應(yīng)分別采用不同的凝膠柱床的總體積Vt=99ml和Vt=98.4ml，不過由于在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中我們兩次進(jìn)行凝膠層析的柱床體積相差很?。w積差不到0.6ml），所以可以認(rèn)為柱床體積是穩(wěn)定的。而外水體積（即藍(lán)色葡聚糖的洗脫體積）Vo35.2ml。 數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果見下表5。蛋白質(zhì)種類分子量Mr洗脫體積 Ve（ml）有效分配系數(shù) Kav分子量對數(shù) LgMr牛血清蛋白67,000 35.50.0047468354.826074803雞卵清蛋白45,000 70.00.5506329114.653212514胰凝乳糖蛋白酶原A24,000 97.40.9841772154.380211242未知蛋白 59.70.384012539表5原始數(shù)據(jù)計(jì)算匯總表 由于在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，Kav與lgMw成線性關(guān)系：，其中b,c為常數(shù)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量的lg值即lg(Mr)為橫坐標(biāo)，以有效分配系數(shù)為縱坐標(biāo)，對Kav和lgMr做線性擬合，結(jié)果見下圖3：圖3 有效分配系數(shù)Kav與蛋白質(zhì)分子量的lgMw值線性擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合方程為Kav=-2.1418lgMw+10.408，相關(guān)性系數(shù)的平方R2=0.9624，線性程度很好。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)曲線可以由未知蛋白的有效分配系數(shù)Kav計(jì)算未知蛋白的分子量。根據(jù)同樣的原理洗脫體積Ve也是和lgMw成線性關(guān)系的，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量的lg值即lg(Mw)為橫坐標(biāo)，以洗脫體積Ve為縱坐標(biāo)，對Ve和lgMw做線性擬合，結(jié)果見下圖4：圖4 洗脫體積Ve與蛋白質(zhì)分子量的lgMw值線性擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合方程為Ve=-135.36lgMw+692.99，相關(guān)性系數(shù)的平方R2=0.9624，線性程度很好。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)曲線可以由未知蛋白的洗脫體積Ve計(jì)算未知蛋白的分子量。2.未知蛋白分子質(zhì)量的計(jì)算未知蛋白質(zhì)的有效分配系數(shù)為Kav=0.384012539, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線形擬合公式可以計(jì)算出未知蛋白的lgMr=4.680169699, 所以未知蛋白的分子量的值為Mr=47,882。未知蛋白質(zhì)的有效分配系數(shù)為Ve=59.7ml, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線形擬合公式可以計(jì)算出未知蛋白的lgMr=4.678560875, 所以未知蛋白的分子量的值為Mr=47,704。以上結(jié)果匯總為下表6蛋白質(zhì)種類分子量Mr洗脫體積 Ve（ml）有效分配系數(shù) Kav分子量對數(shù) LgMr牛血清蛋白67,000 35.50.0047468354.826074803雞卵清蛋白45,000 70.00.5506329114.653212514胰凝乳糖蛋白酶原A24,000 97.40.9841772154.380211242未知蛋 白Kav47,882 59.70.3840125394.680169699Ve47,704 59.70.3840125394.678560875 表6最終計(jì)算結(jié)果匯總表3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論 (1) 對未知蛋白質(zhì)分子量計(jì)算結(jié)果的討論。根據(jù)有效分配系數(shù)Kav計(jì)算得到的未知蛋白質(zhì)分子量為Mr=47,882，根據(jù)洗脫體積Ve計(jì)算得Mr=47,704。二種方法所得到的數(shù)據(jù)基本一致，兩者相差178，相對差值約為0.4%，在實(shí)驗(yàn)過程所允許的范圍之內(nèi)。但是，理論上講兩種計(jì)算方法的結(jié)果應(yīng)該是一致，造成誤差的原因可能是第一次層析藍(lán)色葡聚糖和未知蛋白之后，凝膠洗脫不充分，并且第二次層析標(biāo)準(zhǔn)蛋白這個(gè)過程中凝膠柱床Vt很可能發(fā)生變化。而且由于同樣的原因，外水體積Vo也會(huì)發(fā)生變化。因此，兩次層析實(shí)驗(yàn)過程中凝膠的物理性質(zhì)即相關(guān)物理參數(shù)并不完全一致，導(dǎo)致由分配系數(shù)Kav和由洗脫體積Ve分別計(jì)算的Mr不一致。不過，由于總體上凝膠的各種性質(zhì)并沒發(fā)生明顯的變化，所以最終所測得的未知蛋白分子質(zhì)量相差很小。（2）關(guān)于加樣后加洗脫液引起的實(shí)驗(yàn)誤差的分析加樣操作過程產(chǎn)生的方法誤差：因?yàn)榧尤霕悠泛蠹撮_始收集，而我們最后計(jì)算洗脫峰位置是根據(jù)收集的管數(shù)乘以每管計(jì)算得到的設(shè)定收液體積。所以在樣品滲入膠床后停止收集液體再加入少許洗脫液潤洗管壁的時(shí)間內(nèi)我們沒有收集液體，但自動(dòng)收集器仍在記時(shí)，所以該管液體量應(yīng)該少于設(shè)定的每管收液體積。在數(shù)據(jù)處理過程中，我們對該管仍按設(shè)定的每管3.2ml計(jì)算。所以該時(shí)間段直接產(chǎn)生測量誤差。其大小主要取決于操作者的熟練程度。所以我們在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該盡量縮短該時(shí)間。（3）實(shí)驗(yàn)中可能造成結(jié)果誤差的原因分析。第一，在實(shí)驗(yàn)相關(guān)參數(shù)測定中的系統(tǒng)誤差和偶然誤差。由于在測量柱床體積Vt，外水體積Vo，洗脫體積Ve時(shí)使用了量筒等測量工具，所以由于這些工具所帶來的系統(tǒng)誤差是很難完全避免的。同時(shí)，由于本次實(shí)驗(yàn)中每次層析實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了一次，所以人為測量中的偶然誤差也是很可能出現(xiàn)的。所以，如果能夠多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并將每次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果取平均值，應(yīng)該能夠在一定程度上使得最終測定的未知蛋白質(zhì)分子量更加準(zhǔn)確。第二，由于兩次進(jìn)行凝膠層析時(shí)所設(shè)定的恒流泵流速不同，因此可能導(dǎo)致在兩次層析過程中分離效果不同，從而導(dǎo)致最終結(jié)果的誤差。第一次層析過程中由于兩個(gè)洗脫峰的間距較大，所以使用了2.75ml/5min/管的速度；而第二次前兩個(gè)洗脫峰的間距很小，為使得兩個(gè)洗脫峰能夠充分分離，所以使用了1.6ml/3min/管的速度。因此，洗脫速度的不同可能導(dǎo)致兩次實(shí)驗(yàn)的層析效果有一定的差別。由于這個(gè)差別，將用測定