高通量測序：第二代測序技術詳細介紹.docVIP

在過去幾年里，新一代DNA 測序技術平臺在那些大型測序實驗室中迅猛發(fā)展，各種新技術 猶如雨后春筍般涌現。之所以將它們稱之為新一代測序技術（next-generation sequencing）， 是相對于傳統(tǒng)Sanger 測序而言的。Sanger 測序法一直以來因可靠、準確，可以產生長的 讀長而被廣泛應用，但是它的致命缺陷是相當慢。十三年，一個人類基因組，這顯然不是理 想的速度，我們需要更高通量的測序平臺。此時，新一代測序技術應運而生，它們利用大量 并行處理的能力讀取多個短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的圖畫。 Sanger 測序大家都比較了解，是先將基因組DNA 片斷 化，然后克隆到質粒載體上，再轉化大腸桿菌。對于每個測序反應，挑出單克隆，并純化質 粒DNA。每個循環(huán)測序反應產生以ddNTP 終止的，熒光標記的產物梯度，在測序儀的96 或384 毛細管中進行高分辨率的電泳分離。當不同分子量的熒光標記片斷通過檢測器時， 四通道發(fā)射光譜就構成了測序軌跡。 在新一代測序技術中，片斷化的基因組DNA 兩側連上接頭，隨后運用不同的步驟來產生幾 百萬個空間固定的PCR 克隆陣列（polony）。每個克隆由單個文庫片段的多個拷貝組成。之后進行引物雜交和酶延伸反應。由于所有的克隆都是系在同一平面上，這些反應就能夠大 規(guī)模平行進行。同樣地，每個延伸所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行，來獲取測序 數據。酶拷問和成像的持續(xù)反復構成了相鄰的測序閱讀片段。 Solexa 高通量測序原理 -采用大規(guī)模并行合成測序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端終結技術（Reversible Terminator Chemistry）-可減少因二級結構造成的一段區(qū)域的缺失。-具有高精確度、高通量、高靈敏度和低成本等突出優(yōu)勢-可以同時完成傳統(tǒng)基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學（基因表達及調控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究-將接頭連接到片段上，經 PCR 擴增后制成 Library 。-隨后在含有接頭（單鏈引物）的芯片（ flow cell ）上將已加入接頭的 DNA 片段變成單鏈后通過與單鏈引物互補配對綁定在芯片上，另一端和附近的另外一個引物互補也被固定，形成“橋”-經30倫擴增反應，形成單克隆DNA簇-邊合成邊測序（Sequencing By Synthesis）的原理，加入改造過的DNA 聚合酶和帶有4 種熒光標記的dNTP。 這些dNTP是“可逆終止子”，其3羥基末端帶有可化學切割的基團，使得每個循環(huán)只能摻入單個堿基。此時，用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團化學切割，恢復3端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結果，就可以得知每個模板DNA 片段的序列。目前的配對末端讀長可達到250 bp，更長的讀長也能實現，但錯誤率會增高。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標記的不完全切割。Roche 454 測序技術“一個片段 = 一個磁珠 = 一條讀長（One fragment =One bead = One read）”1）樣品輸入并片段化：GS FLX 系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產物、BAC、cDNA、小分子RNA 等等。大的樣品例如基因組DNA 或者BAC 等被打斷成300800 bp 的片段；對于小分子的非編碼RNA 或者PCR 擴增產物，這一步則不需要。短的PCR 產物則可以直接跳到步驟3)。2）文庫制備：借助一系列標準的分子生物學技術，將A 和B 接頭（3和5端具有特異性）連接到DNA 片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴增和測序步驟。具有A、B 接頭的單鏈DNA 片段組成了樣品文庫。3）一個DNA 片段一個磁珠：單鏈DNA 文庫被固定在特別設計的DNA 捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA 片段。磁珠結合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應器。4）乳液PCR 擴增：每個獨特的片段在自己的微反應器里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。對于每一個片段而言，擴增后產生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增的片段仍然結合在磁珠上。5）一個磁珠一條讀長：攜帶DNA 的捕獲磁珠隨后放入PTP 板中進行后繼的測序。PTP 孔的直徑（29um）只能容納一個磁珠（20um）。然后將PTP 板放置在GS FLX 中，測序 開始。放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G 的順序依次循環(huán)進入PTP 板，每次只進入一個堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP 硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經過一個合成反應和一個化學發(fā)光反應，最終將螢光素氧化 成氧化螢光素，同時釋放出光信號。此反應釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD 捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應，就 可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。 6）數據分析：GS FLX 系統(tǒng)在10 小時的運行當中可獲得100 多萬個讀長，讀取超過4-6 億個堿基信息。GS FLX 系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學工具對測序數據進行分析，適用 于不同的應用：達400 MB 的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。 GS FLX 系統(tǒng)的準確率在99%以上。其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入， 如AAA 或GGG。由于沒有終止元件來阻止單個循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長度就需要從 信號強度中推斷出來。這個過程就可能產生誤差。因此，454 測序平臺的主要錯誤類型是插 入-缺失，而不是替換。 ABI SOLID 測序技術a. 文庫制備 SOLiD 系統(tǒng)能支持兩種測序模板：片段文庫(fragment library)或配對末端文庫(mate-paired library)。使用哪一種文庫取決于你的應用及需要的信息。片段文庫就是將基因組DNA 打斷， 兩頭加上接頭，制成文庫。如果你想要做轉錄組測序、RNA 定量、miRNA 探索、重測序、 3, 5-RACE、甲基化分析、ChIP 測序等，就可以用它。如果你的應用是全基因組測序、SNP 分析、結構重排/拷貝數，則需要用配對末端文庫。配對末端文庫是將基因組DNA 打斷后， 與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用EcoP15 酶切，使中間接頭兩端各有27bp 的堿基，再加 上兩端的接頭，形成文庫。 b. 乳液PCR/微珠富集 在微反應器中加入測序模板、PCR 反應元件、微珠和引物，進行乳液PCR（Emulsion PCR）。 PCR 完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經 過3修飾，可以與玻片共價結合?？吹竭@里，是不是有一種似曾相識的感覺呢？那就對了， 此步驟與454 的GS FLX 基本相同。不過SOLiD 系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1 um。 乳液PCR 最大的特點是可以形成數目龐大的獨立反應空間以進行DNA 擴增。其關鍵技術 是“注水到油”，基本過程是在PCR 反應前，將包含PCR 所有反應成分的水溶液注入到高速 旋轉的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構成了獨 立的PCR 反應空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA 模板和一個P1 磁珠，由于水 相中的P2 引物和磁珠表面的P1 引物所介導的PCR 反應，這個DNA 模板的拷貝數量呈指 數級增加，PCR 反應結束后，P1 磁珠表面就固定有拷貝數目巨大的同來源DNA 模板擴增 產物。 c. 微珠沉積 3修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1 個、4 個或8 個測序區(qū)域。SOLiD 系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一 系統(tǒng)中輕松實現更高的通量。 d. 連接測序 這一步可就是SOLiD 的獨門秘笈了。它的獨特之處在于沒有采用慣常的聚合酶，而用了連 接酶。SOLiD 連接反應的底物是8 堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應中，這些探針按照 堿基互補規(guī)則與單鏈DNA 模板鏈配對。探針的5末端分別標記了CY5、Texas Red、CY3、 6-FAM 這4 種顏色的熒光染料。探針3端15 位為隨機堿基，可以是ATCG四種堿基中 的任何一種堿基，其中第1、2 位構成的堿基對是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16 種堿基對和4 種探針顏色的對應關系，而35 位的“n”表示隨機堿基，68 位的“z”指的是可以和任何堿基配對的特殊堿基。 單向SOLiD 測序包括五輪測序反應，每輪測序反應含有多次連接反應。第一輪測序的第一 次連接反應由連接引物“n”介導，由于每個磁珠只含有均質單鏈DNA 模板，所以這次連接反 應摻入一種8 堿基熒光探針，SOLiD 測序儀記錄下探針第1、2 位編碼區(qū)顏色信息，隨后的 化學處理斷裂探針3端第5、6 位堿基間的化學鍵，并除去68 位堿基及5末端熒光基團， 暴露探針第5 位堿基5磷酸，為下一次連接反應作準備。因為第一次連接反應使合成鏈多 了5 個堿基，所以第二次連接反應得到模板上第6、7 位堿基序列的顏色信息，而第三次連 接反應得到的是第11、12 位堿基序列的顏色信息 幾個循環(huán)之后，引物重置，開始第二輪的測序。由于第二輪連接引物n-1 比第一輪錯開一位， 所以第二輪得到以0，1 位起始的若干堿基對的顏色信息。五輪測序反應反應后，按照第0、 1 位，第1、2 位. 的順序把對應于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0，1，2，3” 組成的SOLiD 原始顏色序列。 e. 數據分析SOLiD 測序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD 原始序列。理論上來說，按照“雙堿基 編碼矩陣”，只要知道所測DNA 序列中任何一個位置的堿基類型，就可以將SOLiD 原始顏 色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡并特性（一種顏 色對應4 種堿基對），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個錯誤 顏色編碼就會引起“連鎖解碼錯誤”，改變錯誤顏色編碼之后的所有堿基。 和其它所有測序儀一樣，測序錯誤在所難免，關鍵是對測序錯誤的評價和后續(xù)處理。由于 SOLiD 系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術，在測序過程中對每個堿基判讀兩遍，從而減少原始數 據錯誤，提供內在的校對功能。這樣，雙保險確保了SOLiD 系統(tǒng)原始堿基數據的準確度大 于99.94%，而在15X 覆蓋率時的準確度可以達到99.999%，是目前新一代基因分析技術 中準確度最高的。 為避免“連鎖解碼錯誤”的發(fā)生，SOLiD 數據分析軟件不直接將SOLiD 原始顏色序列解碼成 堿基序列，而是依靠reference 序列進行后續(xù)數據分析。SOLiD 序列分析軟件首先根據“雙 堿基編碼矩陣”把reference 堿基序列轉換成顏色編碼序列，然后與SOLiD 原始顏色序列進 行比較，來獲得SOLiD 原始顏色序列在reference