NP對SBR系統(tǒng)中典型微生物菌群的影響.doc

NP對SBR系統(tǒng)中典型微生物菌群的影響摘 要壬基酚(Nonlphenol, NP) 是一種對生物有機(jī)體具有毒害作用的內(nèi)分泌干擾物( endocrine disrupting chemicals, EDCs)，主要用于生產(chǎn)表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚(NPmEO)。環(huán)境中的壬基酚主要來源于污水處理廠系統(tǒng)中NPmEO的不完全降解后的出水中，并且大量野生動物與實(shí)驗(yàn)動物研究證明了壬基酚具有雌激素效應(yīng)和其他的生物毒性, 其對生物體產(chǎn)生的不良作用包括影響內(nèi)分泌、影響生殖和發(fā)育、影響免疫及促癌作用等。壬基酚被認(rèn)為是有代表性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物, 為聯(lián)合國環(huán)境保護(hù)署制訂的27 種優(yōu)先控制的持久性有毒污染物之一。盡管一些研究對壬基酚在污水處理系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化進(jìn)行了探討，但是通過工業(yè)廢水和生活污水排放進(jìn)入污水處理系統(tǒng)中的壬基酚是否會對污水處理系統(tǒng)中的微生物種群及污泥活性產(chǎn)生影響尚不明確。因此本論文通過投加不同濃度梯度的壬基酚到經(jīng)人工配置生活污水馴化的活性污泥中，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行分析，探索壬基酚對活性污泥可培養(yǎng)微生物的影響關(guān)鍵詞：壬基酚；活性污泥；SBR；菌群；酶活性； Effect of NP on typical microorganisms in the SBR systemAbstractNonylphenol (NP) is an endocrine disrupting chemicals(EDCs) with the toxic effect for a biological organism, and in actual production, nonylphenol mainly uses for the production of surfactant nonylphenol ethoxylate (NPmEO). In the environment, nonylphenol mainly produced from incomplete degradation of NPmEO in the sewage treatment plant Nonylphenol system. And according to studies on a large number of wild and laboratory animals, the results show that nonylphenol has estrogenic effects and other toxicity, the adverse effects on organisms of which include impacts of endocrine, reproduction and development, immune and cancer promoting. Nonylphenol is considered as a representative of environmental endocrine disruptors and it was listed as one of the 27 priority persistent toxic pollutants by Environmental Protection Department for the United Nations. Although the migration and transformation of nonylphenol in sewage treatment systems has been discussed in some studies, it is still unclear whether nonylphenol has effects on microbial population and sludge activity which is discharged into the sewage treatment system through industrial wastewater and domestic sewage. Therefore, in this thesis, we made shake flask experiments through adding different concentrations of nonylphenol to manually configured activated sludge acclimated by domestic sewage to explore the culture of activated sludge microorganisms and the effects of typical enzyme activity such as dehydrogenase, phosphatase and urease caused by nonylphenol.Key words: nonylphenol; activated sludge; SBR; bacteria; enzyme activity; 目 錄1緒論11.1壬基酚的來源11.2 NP的結(jié)構(gòu)性質(zhì)11.2.1 NP的結(jié)構(gòu)11.2.2 NP的性質(zhì)11.3 NP在環(huán)境中的分布21.4 NP在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化31.4.1 NP在污水和給水處理廠的遷移轉(zhuǎn)化31.4.2 NP在地表水體中的遷移轉(zhuǎn)化41.4.3 NP 在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化41.4.4 NP 在地下水中的遷移轉(zhuǎn)化41.4.5 NP 在大氣中的遷移轉(zhuǎn)化41.5 NP的危害41.5.1對高等生物的影響51.5.2壬基酚對微生物的影響61.6研究目的及意義62 壬基酚對活性污泥可培養(yǎng)微生物的影響62.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器62.1.1 材料62.1.2 儀器72.2 實(shí)驗(yàn)方法 72.3 統(tǒng)計分析方法82.4 結(jié)果與討論82.4.1 壬基酚對好氧可培養(yǎng)細(xì)菌的影響82.4.2 壬基酚對好氧可培養(yǎng)真菌的影響92.4.3 壬基酚對好氧可培養(yǎng)放線菌的影響102.5 本章小結(jié)113 壬基酚對活性污泥活性的影響113.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器113.1.1 實(shí)驗(yàn)材料113.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器113.2 實(shí)驗(yàn)方法123.2.1 脫氫酶活性測定123.2.2 磷酸酶測定123.2.3 脲酶測定123.3 統(tǒng)計分析方法133.4 結(jié)果與討論133.4.1 壬基酚對活性污泥中脫氫酶的影響133.4.2 壬基酚對活性污泥中堿性磷酸酶的影響143.4.3 壬基酚活性污泥中尿酶的影響163.4.4 壬基酚對污泥酶活性的影響評價173.5 本章小結(jié)174 結(jié)論和建議174.1 結(jié)論174.2 建議18參考文獻(xiàn)19致謝211 緒論1.1 壬基酚的來源壬基酚(Nonlphenol, NP) 是一種對生物有機(jī)體具有毒害作用的內(nèi)分泌干擾物( endocrine disrupting chemicals, EDCs) 。它主要是由不同的壬基異構(gòu)體與苯酚經(jīng)烷化后, 在苯環(huán)C-4上發(fā)生取代而形成的。壬基酚在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活中得到了廣泛的應(yīng)用, 不同壬基支鏈結(jié)構(gòu)的NP技術(shù)級壬基酚( technical grade nonylphenol, tNP) 主要用于生產(chǎn)表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚(NPmEO) 、以及抗氧劑、紡織印染助劑、潤滑油添加劑、農(nóng)藥乳化劑、樹脂改性劑、樹脂及橡膠穩(wěn)定劑等領(lǐng)域。環(huán)境中的NP主要有兩個來源，其中一部分來源于壬基酚生產(chǎn)企業(yè)排放的三廢物質(zhì)；另一個主要來源為污水處理系統(tǒng)中壬基酚聚氧乙烯醚（NPmEO）的不完全降解后的出水中1 ，當(dāng)NPmEO進(jìn)入城市生活污水中逐級降解,最終生成各種NP同分異構(gòu)體。壬基酚聚氧乙烯醚(NPmEO)的分解途徑由下圖所示：圖1 壬基酚聚氧乙烯醚(NPmEO)的分解途徑1.2 NP的結(jié)構(gòu)性質(zhì)1.2.1 NP的結(jié)構(gòu)NP是由苯酚環(huán)和壬烷基構(gòu)成, 并主要以壬基對位取代形式存在。目前有許多研究是針對于某種或某幾種特定的NP同分異構(gòu)體進(jìn)行的。至今, 已經(jīng)鑒定出的tNP 的同分異構(gòu)體大于22種 , Guenther K17等依據(jù)國際理論和美國化學(xué)聯(lián)合會( IUPAC) 的分類標(biāo)準(zhǔn)列舉出了11 種NP的理論結(jié)構(gòu), 并估計將有5080種NP同分異構(gòu)體存在于環(huán)境中，圖2是幾種常見的NP同分異構(gòu)體化合物。不同結(jié)構(gòu)的NP具有不同的降解性能, 以及對生物機(jī)體的內(nèi)分泌干擾作用也不相同2 。tNP的生物降解與直鏈NP相比要困難, 因?yàn)閠NP中85%的同分異構(gòu)體的烷基鏈上位上都含有叔C14 , 使其分支程度較高, 且支鏈較大, 分子體積變大。因此, 這種的復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)一方面增強(qiáng)了-C的支鏈供電性, 從而使對位的ph-O和O-H的活性減弱, 另一方面阻礙了分子進(jìn)入細(xì)胞膜與酶的活性中心結(jié)合, 最終影響它的生物轉(zhuǎn)化性質(zhì)18 , 這也是導(dǎo)致壬基酚異構(gòu)體降解差異的主要原因。圖2NP典型同分異構(gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)式1.2.2 NP的性質(zhì)NP的外觀在常溫下為無色或淡黃色粘稠液體,略帶苯酚氣味,不溶于水, 溶于丙酮、四氯化碳、乙醇和氯仿, 其主要的物化性質(zhì)如下：熔點(diǎn)：-10沸點(diǎn)：293-297比重：d204 0.950蒸汽壓：3.210-3 Pa (2.410-5 mmHg) LogKow：3.014.48g) (25) 1.9 kPa (14 mmHg) (200) 享利常數(shù)：1.15510 -5 410 -5atm m3 /mol土壤吸附系數(shù)：Koc = 60,000 (HSDB, 2001)溶解性：水6.35 mg/L (25)由NP的主要物理化學(xué)性質(zhì)可以看出它屬于憎水性、不易揮發(fā)性物質(zhì)， 有較強(qiáng)的吸附性能；因此, 當(dāng)NP進(jìn)入環(huán)境時, 主要存在于水和土壤及沉積物中22 。1.3 NP在環(huán)境中的分布 環(huán)境中的壬基酚主要來自于非離子表面活性劑NPmEO，后者主要通過污水處理系統(tǒng)進(jìn)入環(huán)境。在污水處理系統(tǒng)中經(jīng)生物處理等一系列工藝過程后，最終排入周圍水體。NPmEO的降解產(chǎn)物是以復(fù)雜混合物的形式存在的，其中水溶性較低的NP及其低分子聚合物通常結(jié)合在有機(jī)顆粒和淤泥中。NPmEO的生產(chǎn)量高，而且已經(jīng)作為清洗劑、乳化劑、濕潤劑和分散劑等被廣泛使用了大約40年，因此NP在環(huán)境中的分布廣泛。NP往往在污水排放口附近污染較為廣泛，在加拿大的污水處理系統(tǒng)中，污水經(jīng)過一級、二級和三級處理后，NP的濃度范圍分別為O.O262.1，0.124.79和0.023.2gL。美國Kalamazoo河的污水處理廠排出水中的NP濃度2.6gL。在加拿大的淡水系統(tǒng)中，NP的濃度范圍為0.024.25gL，平均濃度為0.2OgL，最高濃度是在工業(yè)和生活污水排放口附近檢測到的。我國的長江、黃河、重慶嘉陵江、太湖、海河等水環(huán)境均檢出NP的存在；胡建英等對嘉陵江和長江重慶段河流和以這兩條河為水源的5個自來水廠水樣中的NP進(jìn)行了檢測，2001年4月河流水樣中NP的濃度范圍為0.021.12gL，7月份為1.556.85gL；自來水廠所采集的水樣中4月份NP濃度范圍為0.010.06gL，7月份為0.102.73gL。 由于NP的脂溶性強(qiáng)，易在底泥和生物組織中蓄積。美國五大湖(the Great Lakes)和圣勞倫斯河(StLawrence)的底泥中NP的濃度范圍為O.O272.2gL。英國河流底泥中報道的濃度與此相似，在污染程度較高的地區(qū)中的濃度范圍為00313lgL。在加拿大污水處理廠的淤泥中，NP的濃度在0.741260g/L之間。 目前關(guān)于NP在生物體中的濃度數(shù)據(jù)還比較缺乏，有一些研究表明這些化合物呈現(xiàn)低到中等程度的生物累積效應(yīng)。據(jù)報道，NP在魚中的生物累積因子(BCFs)在0.91250之間。將鯉魚(common carp)暴露于lOg/L的NP中2832天后，BCF為550，將黑頭呆魚(fathead minnows)暴露14和28天后，BCF分別為586和741。在生產(chǎn)表面活性劑的工廠排出污水中網(wǎng)箱養(yǎng)殖的貽貝對NPEO 和NP的生物累積因子分別為60，100，170，340。美國密歇根州不同水體的魚組織中，NP的濃度范圍在3.329.1ng/g之間。從瑞士Glatt河中采集的四種魚的混合樣品中檢測到NP，NPEO 和NPEOs的濃度分別高達(dá)1.6，7.0和3.0mg/kg。金芬等在北京排污河天津段野生鯽魚體內(nèi)檢測到NPEOs的殘留濃度為40680ng/g，NP的濃度在301510ng/g，其BCF值分別為898和94。1.4 NP在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化NP在構(gòu)筑物及環(huán)境介質(zhì)中具有不同的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。1.4.1 NP在污水和給水處理廠的遷移轉(zhuǎn)化大量研究調(diào)查了NP在污水處理設(shè)施中的遷移轉(zhuǎn)化行規(guī)律，結(jié)果表明，壬基酚在污水處理廠的去除主要通過活性污泥的吸附和微生物的降解?；钚晕勰鄬P的吸附作用與其有機(jī)質(zhì)含量的高低密切相關(guān)；NP在污水處理工藝中的生物降解作用會受到溫度、溶解氧含量等環(huán)境因素以及污泥齡等工藝參數(shù)的影響。NP在一些河流、湖泊以及飲用水水源地都有不同水平的污染，其在給水處理工藝中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律與給水工藝的類型有關(guān)。傳統(tǒng)的混凝、沉淀、消毒給水工藝對壬基酚的去除有限，而在傳統(tǒng)工藝后端設(shè)有臭氧氧化及活性炭吸附的給水處理工藝去除NP的效率能夠達(dá)到95%以上。1.4.2 NP在地表水體中的遷移轉(zhuǎn)化NP在河流、湖泊、水庫等水體中的污染水平既與人類生產(chǎn)生活活動密切相關(guān)，又隨季節(jié)變化而有所不同，通常夏季氣溫較高，微生物活性增強(qiáng)，導(dǎo)致壬基酚聚氧乙烯醚的生物轉(zhuǎn)化速率升高，中間產(chǎn)物NP的積累速率相應(yīng)增大。此外，NP在水體中的濃度還與流速、沉淀速率及水體中顆粒物的粒徑大小有關(guān)。NP進(jìn)入水體后，極易吸附于沉積物中，從而限制了其擴(kuò)散到水溶液中，阻抑了微生物的降解，因此底泥中的NP濃度往往比水體中的NP高。而NP在底泥中的吸附過程主要取決與NP與親水性礦物成及憎水性有機(jī)質(zhì)的相互作用，壬基酚在環(huán)境介質(zhì)中不僅會發(fā)生吸附、擴(kuò)散等物理化學(xué)過程，同時還會經(jīng)過一系列的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。在淺層地表水體中，壬基酚會發(fā)生光解。在底泥和土壤中，一些受到壬基酚污染地方的土著的微生物能夠降解轉(zhuǎn)化NP。1.4.3 NP在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化 NP在土壤中的污染與城市污泥的農(nóng)用、垃圾填埋及工業(yè)泄露有關(guān)。一些列研究結(jié)果表明，施用城市污泥農(nóng)田中的NP往往高于未施用的農(nóng)田。NP進(jìn)入土壤后，其濃度往往受到吸附、生物降解及揮發(fā)等物理化學(xué)過程的影響。土壤pH、腐殖質(zhì)含量對NP的吸附影響明顯，在較低pH下，高腐殖質(zhì)含量的土壤中，吸附作用更強(qiáng)。NP在土壤顆粒上的吸附作用阻礙了其在土壤中擴(kuò)散、遷移及其生物有效性。NP在土壤中的揮發(fā)性相對較弱，有研究結(jié)果顯示，含NP（1克壬基酚/克土壤）土壤，經(jīng)過40天的揮發(fā)，濃度只降低了0.22%。1.4.4 NP在地下水中的遷移轉(zhuǎn)化 由于城市污水、垃圾滲濾液的排放，造成了地下水NP不同水平的污染。NP由地表排放進(jìn)入地下，經(jīng)歷一系列的物理化學(xué)過程，包括遷移、擴(kuò)散、吸附和生物降解等物理、化學(xué)和生物過程。地表水與地下水的循環(huán)交換需要滲透過河床、盆地，然后再進(jìn)入潛水層。地下水在潛水層中遷移流動相對緩慢，而且營養(yǎng)和氧氣有限，微生物活性低，NP降解速率低，相對穩(wěn)定。因此進(jìn)入地下水NP的濃度取決于地表水與地下水在河床盆地的滲透交換過程，在滲透交換過程中，吸附和生物降解對NP的濃度起著決定性的影響，而吸附和生物降解過程又受到溫度、溶解氧及滲透層組成等因素的影響。1.4.5 NP在大氣中的遷移轉(zhuǎn)化大氣中NP的污染也是人類生產(chǎn)生活活動的結(jié)果，NP進(jìn)入大氣，通過遷移擴(kuò)散及干濕沉降回到陸地或地表水體。一個地區(qū)大氣中NP濃度水平與該地區(qū)地表水體中的NP的濃度水平有關(guān)，且隨季節(jié)性變化而變化，這是因?yàn)榇髿庵械腘P受水氣交換速率影響，通常夏季氣溫高，水氣交換通量大，大氣中NP濃度水平相應(yīng)增高。1.5 NP的危害 壬基酚廣泛用于塑料、橡膠等行業(yè)生產(chǎn)中，可從各種烷基酚產(chǎn)品如某些食品袋中釋放出來,造成污染。壬基酚能在脂肪組織中蓄積, 并通過食物鏈的循環(huán)進(jìn)入人體產(chǎn)生危害23，因此其對高等生物的影響引起了人們的廣泛關(guān)注。NP 對生物體產(chǎn)生的危害主要在以下幾個方面:影響內(nèi)分泌系統(tǒng)、影響生殖和發(fā)育、促癌作用、影響免疫等。1.5.1 對高等生物的影響1.5.1.1 對生殖發(fā)育系統(tǒng)的影響 報道顯示，NP 可導(dǎo)致許多實(shí)驗(yàn)動物和野生動物繁殖能力下降。NP 經(jīng)口進(jìn)入嚙齒類動物時可引起明顯的睪丸損害, 成年雄性大鼠暴露于100mg/kg 1d NP 時，曲細(xì)精管直徑縮小；暴露于250mg/kgd NP 時，附睪重量降低;暴露于400mg/kgd NP 時，睪丸重量降低、精子數(shù)減少。暴露劑量大于100 mg/kgd NP時,雄鼠附睪腔液中-糖苷濃度增高,表明附睪上皮分泌功能增強(qiáng),這樣就會破壞分泌和重吸收的平衡,使附睪腔中精子細(xì)胞發(fā)育成熟所依賴的生化環(huán)境改變,最終影響精子產(chǎn)生24 。睪丸功能的惡化可能與睪丸細(xì)胞凋亡有關(guān)。Hughes 等25 認(rèn)為支持細(xì)胞( sertolicell) 是NP 的靶細(xì)胞,支持細(xì)胞含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2 + 2ATPase ,低濃度NP 即可抑制大鼠睪丸Ca2 + 2ATPase ,干擾其Ca2 + 內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊2004年第31卷第3期135 損害細(xì)胞生存力,這與Ca2 + 依賴的細(xì)胞凋亡機(jī)制一致。如有研究發(fā)現(xiàn)NP 引起日本青魚精母細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞凋亡多于空白對照組25 。NP 可導(dǎo)致雄魚雌性化。卵黃蛋白原(VTG) 是一種魚類產(chǎn)生的肝源性脂蛋白,經(jīng)雌激素和類雌激素物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生,一般雄魚體內(nèi)只有少量。NP 可明顯增加雄魚體內(nèi)VTG。NP 結(jié)合雌激素受體( ER) 后直接激活依賴雌激素的報告基因estrgen-dependentreporter gene) ,促使VTG 基因轉(zhuǎn)錄。將雄性日本青魚置于含20gL - 1NP 的水中4 天,蛋白印記法檢測肝組織勻漿顯示VTG含量高于空白對照組26 。NP 暴露劑量與雄性日本青魚肝內(nèi)VTG mRNA、血漿VTG水平呈劑量2反應(yīng)關(guān)系。停止暴露后,肝內(nèi)VTG mRNA迅速消失,而血漿中VTG 的清除則需幾個月。成熟雄性日本青魚暴露于含011gL - 1 NP 的水中即可誘導(dǎo)出雌性特有蛋白質(zhì)(female-specific protein ,Fsp) 的表達(dá),暴露劑量達(dá)100gL - 1 時可出現(xiàn)異常性腺以及雌魚特有的臀鰭27 。1.5.1.2 對神經(jīng)系統(tǒng)的影響 煙堿受體( nAChRs) 為遞質(zhì)乙酰膽堿門控的離子通道型受體,神經(jīng)元nAChRs 與肌肉中的nAChRs 雖屬同一家族,但它們的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性卻有很大差異。NP 可干擾細(xì)胞跨膜的信號傳遞,其作用可能的靶位點(diǎn)是人類神經(jīng)元nAChRs ,能有效抑制神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿誘發(fā)的離子流通過受體,阻止信息傳遞給神經(jīng)細(xì)胞。利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)重組人類煙堿受體,受體重組亞單位不論是34 還是42 ,通過受體的離子流均能被NP 有效抑制34 。nAChRs 在學(xué)習(xí)和記憶等人類認(rèn)知行為中有重要作用并參與帕金森病的發(fā)病。值得注意的是,帕金森病的病136 國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊2004年第31卷第3期因至今還不完全清楚,NP 能促使12甲基242苯基吡啶(MPP+ ) 誘導(dǎo)的羥基自由基在成年大鼠紋狀體內(nèi)大量增加,而MPP+ 誘導(dǎo)自由基生成是公認(rèn)的帕金森病的可能致病機(jī)制之一35 。NP 導(dǎo)致的神經(jīng)行為改變的唯一證據(jù)是大鼠食鹽攝入增加。從母體暴露到出生后71 天, 雌性和雄性大鼠暴露于劑量為2mgkg- 1d - 1NP ,與空白對照組相比,暴露組食鹽和水的攝入量增加36 。1.5.1.3 對免疫系統(tǒng)的影響機(jī)體的免疫應(yīng)答分為非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答,特異性免疫應(yīng)答由細(xì)胞免疫和體液免疫組成,T 細(xì)胞執(zhí)行特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,并在體液免疫中也發(fā)揮一定作用,B 細(xì)胞是體液免疫的主要參與者。NP 可作用于小鼠T 細(xì)胞和B 細(xì)胞上的2ER ,模擬E2 的作用,阻礙淋巴細(xì)胞的有絲分裂,即減少兩者的克隆擴(kuò)增,使兩者生成效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量減少,影響機(jī)體執(zhí)行正常特異性免疫應(yīng)答功能37 。另外,NP 能有效抑制小鼠1 型輔助性T 細(xì)胞(Th1) 產(chǎn)生2干擾素( INF2) ,還能抑制2 型輔助性T 細(xì)胞(Th2) 產(chǎn)生白細(xì)胞介素24 ( IL24) 。Th1 能通過產(chǎn)生IL22 和INF2參與細(xì)胞免疫,Th2 能通過產(chǎn)生IL25、IL24 及其它白細(xì)胞介素參與體液免疫。由于NP 可通過抑制上述細(xì)胞因子的產(chǎn)生間接抑制特異性免疫應(yīng)答活性,因而被認(rèn)為具有一定的免疫毒性38 。1.5.2 壬基酚對微生物的影響壬基酚對高等生物的影響研究很多，而對對微生物生態(tài)的影響研究相對較少。目前有研究表明，壬基酚污染水平在3.86.610-6M的土壤，短期內(nèi)對土壤中的真菌影響不明顯，而長期作用下，對土壤中的一些絲狀真菌和真菌孢子產(chǎn)生刺激誘導(dǎo)作用39。而Athanasios S等人研究了4-n-NP對活性污泥中微生物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-n-NP對污泥微生物的影響與污泥齡的長短有關(guān)，且隨著污泥齡的增加，而其毒性效應(yīng)相應(yīng)減弱，而其4-n-NP對自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌的抑制作用明顯大于異氧微生物的作用40。1.6 研究目的及意義據(jù)調(diào)查目前全世界每年仍約有50 萬噸的NP進(jìn)入水體或土壤。根據(jù)目前發(fā)展的趨勢, 在尚沒有其他替代品的情況下, NPmEO及NP在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活中仍繼續(xù)被廣泛應(yīng)用，而環(huán)境中的NPmEO通過污水處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為有毒、生物難降解及易生物積累的壬基酚。而通過工業(yè)廢水和生活污水排放進(jìn)入污水處理系統(tǒng)中的NP是否對污水處理系統(tǒng)中的微生物種群及污泥活性產(chǎn)生的影響尚不明確，盡管有少量的研究表明4-n-NP對活性污泥中自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌有明顯的抑制作用，但是環(huán)境中的NP主要是技術(shù)級的tNP，而非單一的4-n-NP。而可培養(yǎng)微生物的數(shù)量及污泥胞內(nèi)酶和胞外酶的活性對污泥活性及污水處理系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要影響。因此本論文旨在研究技術(shù)級tNP對污水處理系統(tǒng)中的可培養(yǎng)微生物及污泥的脫氫酶、磷酸酶和尿酶等典型酶活性的影響。通過本研究，有助于進(jìn)一步理解技術(shù)級壬基酚的對污水處理系統(tǒng)的影響，為NP的生態(tài)毒性風(fēng)險評價提供很好的理論依據(jù)。2 壬基酚對活性污泥可培養(yǎng)微生物的影響2.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器2.1.1 材料生活污水：配方見下表2-142，其COD在500mg/L左右。表2-1組分濃度（mg/L）組分濃度（mg/L）葡萄糖400硫酸鎂26谷氨酸100氯化鈣3.5磷酸氫二鉀138碳酸氫鈉80磷酸二氫鉀69七水硫酸亞鐵0.75氯化銨65七水硫酸鋅0.75酵母粉9七水硫酸錳0.75活性污泥：取自望塘污水處理廠氧化溝的回流污泥，污泥取回后，放入SBR反應(yīng)器，加入生活污水馴化3天（運(yùn)行周期12h）。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)細(xì)菌。在1L蒸餾水中溶于牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，并且把PH值調(diào)到7.2到7.5之間。 150度高溫滅菌后使用。 馬鈴薯培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)真菌。馬鈴薯200g煮成液體后用紗布過濾，添加蔗糖20g，瓊脂15-20g，并且加蒸餾水到1L。150度高溫滅菌后使用。 高氏1號培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)放線菌。在1L蒸餾水中溶于可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g，七水硫酸鎂0.5g，三水磷酸氫二鉀0.5，七水硫酸鐵0.01，氯化鈉0.5g，瓊脂15-20g，并且把PH值調(diào)到7.4到7.6之間。150度高溫滅菌后使用。 培養(yǎng)皿、試管、三角瓶。2.1.2 儀器表2-2主要實(shí)驗(yàn)儀器儀器名稱儀器型號生產(chǎn)廠家電熱恒溫振蕩水槽YIHENG上海恒科技術(shù)有限公司生物培養(yǎng)箱MJX-160B-Z上海博迅事業(yè)有限公司pH計HACH Sension1美國哈希HACH立式壓力蒸汽滅菌器RSYZ-210上海申安醫(yī)療機(jī)械廠2.2 實(shí)驗(yàn)方法在6個1L三角瓶中分別加入預(yù)先計算量的NP壬基酚乙醚溶液，待乙醚揮發(fā)后，加入200mL人工配置的生活污水，然后在漩渦振蕩器上振蕩5min，再在超聲波下振蕩1h，使NP完全分散。然后加入400mL的生活污水馴化的回流污泥，使其中壬基酚初始濃度分別為0mg/L、0.2 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、20 mg/L、50 mg/L，恒溫下培養(yǎng)42天。每7天取樣，梯度稀釋后接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基中，30下，在細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)3、5、7天后統(tǒng)計細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量，每一個樣做3個平行。2.3 統(tǒng)計分析方法通過計算阻抑度來表示壬基酚對微生物菌落數(shù)量的影響，阻抑度計算公式如下： 上式中Acs為某一時間對照樣的菌落數(shù)量，Ais為不同NP濃度下，某一時間活性污泥樣的菌落數(shù)量。為了進(jìn)一步分析壬基酚對微生物菌落的影響，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行了兩因素方差分析。2.4 結(jié)果與討論2.4.1 壬基酚對好氧可培養(yǎng)細(xì)菌的影響在42天的培養(yǎng)過程中，每周從6種不同濃度壬基酚污泥樣中取樣測定細(xì)菌數(shù)量，并計算某一取樣時間下的阻抑度，其計算結(jié)果如下圖2.1.圖2.1 壬基酚對可培養(yǎng)好氧細(xì)菌的阻抑度（%） 由上圖可以看出在某一時間內(nèi)，壬基酚濃度高的水樣，其阻抑度相對較高。當(dāng)培養(yǎng)時間在14天時阻抑度達(dá)到最大，之后隨著時間的變化逐步下降，在第35天，不同NP濃度的污泥樣的阻抑度開始出現(xiàn)負(fù)值，而且濃度越高，負(fù)阻抑度越大，由此可以看出，后期活性污泥樣中可能出現(xiàn)一些細(xì)菌開始利用NP為碳源。但總體上看，不同NP濃度對活性污泥樣的阻抑度均不高，阻抑度最高值也才在5%到6%之間，所以從圖不能直接判斷壬基酚對可培養(yǎng)好氧細(xì)菌是否有顯著影響。因此，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行兩因素方差分析，進(jìn)一步探討了壬基酚對細(xì)菌的影響。兩因素方差分析結(jié)果如下表2-3：表2-3 壬基酚及培養(yǎng)時間對可培養(yǎng)好氧細(xì)菌的阻抑度的兩因素方差分析誤差來源df離差平方和均方FF0.05P培養(yǎng)時間5104.4320.8913.182.602.48E-60.05誤差2539.6211.64總差35156.00 上表中F0.05為壬基酚在95%的可能性對菌落產(chǎn)生影響的參數(shù)值。當(dāng)F值小于F0.05值時表明壬基酚沒有影響。由上表可以看出濃度因子的F值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于F0.05值，由此可以看出，NP濃度在50mg/L以下，對活性污泥中可培養(yǎng)細(xì)菌無顯著影響。2.4.2 壬基酚對好氧可培養(yǎng)真菌的影響在42天的培養(yǎng)過程中，每周從6種不同濃度壬基酚污泥樣中取樣測定真菌數(shù)量，并計算某一取樣時間下的阻抑度，其計算結(jié)果如下圖2.2.圖2.2 壬基酚對可培養(yǎng)好氧真菌的阻抑度（%）由上圖可以看出在某一時間內(nèi)，壬基酚對污泥中好氧真菌的阻抑影響隨著濃度高的升高而增大；且NP對污泥真菌的阻抑影響隨著時間的延長，出現(xiàn)先增加后降低，總體阻抑度在中期21天時出現(xiàn)最大值，在后期有個別濃度水樣存在負(fù)值。但總體阻抑度不高，最大值只達(dá)到2.2%，由此看出壬基酚對真菌的影響較小。為了進(jìn)一步分析壬基酚對真菌的影響，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行兩因素方差分析，兩因素方差分析結(jié)果如下表2-4。表2-4 壬基酚及培養(yǎng)時間對可培養(yǎng)好氧真菌的阻抑度的兩因素方差分析誤差來源df離差平方和均方FF0.05P培養(yǎng)時間513.912.786.452.605.59256E-40.05誤差2510.780.43總差3529.08 從上表可以看出濃度因子的F值小于F0.05值，由此可以看出，NP濃度在50mg/L以下，對活性污泥中可培養(yǎng)真菌無顯著影響。2.4.3 壬基酚對好氧可培養(yǎng)放線菌的影響在42天的培養(yǎng)過程中，每周從6種不同濃度壬基酚污泥樣中取樣測定放線菌數(shù)量，并計算某一取樣時間下的阻抑度，其計算結(jié)果如下圖2.3.圖2.3 壬基酚對可培養(yǎng)好氧放線菌的阻抑度（%）由上圖可以看出在同一時間內(nèi)壬基酚濃度越高，阻抑度越高，并且不同NP濃度之間的阻抑度有明顯的差異。在不同NP濃度下，當(dāng)培養(yǎng)時間在14天時，阻抑度達(dá)到最高值，之后隨著時間的變化逐步下降。NP濃度在50mg/L時，阻抑度最高值達(dá)到將近10%，由此可以看出壬基酚對可培養(yǎng)好氧放線菌有一定的影響。為了進(jìn)一步分析壬基酚對放線菌的影響，使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行了兩因素方差分析。兩因素方差分析結(jié)果如下表2-5。表2-5 壬基酚及培養(yǎng)時間對可培養(yǎng)好氧放線菌的阻抑度的兩因素方差分析誤差來源df離差平方和均方FF0.05P培養(yǎng)時間544.058.816.672.604.52565E-40.05NP 濃度5125.0525.0118.922.608.82801E-80.05誤差2533.051.32總差35202.15 由上表看出壬基酚濃度因子的F值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于F0.05值，兩因素方法分析結(jié)果表明，壬基酚對可培養(yǎng)好氧放線菌有顯著的影響。2.5本章小結(jié) 經(jīng)過42天培養(yǎng)，考察了不同濃度的壬基酚對活性污泥可培養(yǎng)微生物的影響，結(jié)果表明，NP對細(xì)菌、真菌及放線菌的影響隨著時間的變化與變化，且隨著NP濃度的增加，阻抑影響愈大，且阻抑度最大值分別出現(xiàn)在第14天、21天、14天。50mg/L時最大阻抑度分別為5.6%、2.2%及9.8%。通過兩因素方差分析可以看出，NP在50mg/L以下，對污泥中的細(xì)菌、真菌的影響不顯著，而對放線菌具有顯著性的影響。3 壬基酚對活性污泥活性的影響3.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 壬基酚生活污水溶液同第二章。 活性污泥，取自望塘污水處理廠氧化溝的回流污泥，并在實(shí)驗(yàn)室SBR反應(yīng)器內(nèi)利用人工合成生活污水馴化培養(yǎng)3天。三羥甲基甲烷，鹽酸，氯化三苯基四氮唑，亞硫酸鈉，氯化鈉，甲苯，氯化銨，氫氧化氨，鐵氰化鉀液，4-氨基氨替比林，硫酸苯二鈉，檸檬酸，氫氧化鉀，1M氫氧化鈉，次氯酸鈉，尿素，硫酸銨，所有試劑均為分析純。3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器表3-1 實(shí)驗(yàn)儀器儀器名稱儀器型號生產(chǎn)廠家恒溫鍋YIHENG上海恒可技術(shù)有限公司離心機(jī)GL-20BFULGOR生化培養(yǎng)箱MJX-160B-Z上海博迅事業(yè)有限公司分光光度計UV-1200JENCO3.2 實(shí)驗(yàn)方法在6個1L三角瓶中分別加入預(yù)先計算量的NP壬基酚乙醚溶液，待乙醚揮發(fā)后，加入200mL人工配置的生活污水，然后在漩渦振蕩器上振蕩5min，再在超聲波下振蕩1h，使NP完全分散。然后加入400mL的生活污水馴化的回流污泥，使其中壬基酚初始濃度分別為0mg/L、0.2 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、20 mg/L、50 mg/L，恒溫下培養(yǎng)42天。每7天取樣，測定脫氫酶、磷酸酶及尿酶，每一個樣做2個平行。3.2.1 脫氫酶活性測定 采用了TTC比色法。氯化三苯基四氮唑（TTC）在氧化狀態(tài)接受脫氫酶活化的氫而被還原時具體有穩(wěn)定顏色，通過比色方法，測定反應(yīng)后的顏色深度和反應(yīng)速度來推測脫氫酶的活性。具體實(shí)驗(yàn)方法如下： 在10mL水樣離心后棄去上清液，用生理鹽水補(bǔ)足，充分搖勻后洗滌再離心，反復(fù)三次后，取活性污泥懸浮液。在2ml樣品中加Tris-HCL緩沖液1.5mL, ,亞硫酸鈉溶液0.5mL, 氯化三苯基四氮唑（TTC）1mL（對照樣加0.5mLTTC和0.5mL生活污水），搖勻后放置在用蓋子遮光37度水浴鍋內(nèi)，計時。反應(yīng)時間已顯色情況而定。樣品呈棕紅色后，加入3滴濃硫酸，終止反應(yīng)。再加入甲苯萃取后，在4000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘。取上清液在485nm波長下用分光光度計比色。每個樣品做2個平行，并且用同樣方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.2.2 磷酸酶測定 采用了磷酸本二鈉比色法。堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中作用于磷酸苯二鈉，使之水解生成酚和磷酸。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化形成玫紅色醌類化合物，其顏色深淺與磷酸酶活性成正比。具體實(shí)驗(yàn)方法如下： 取5mL活性污泥水樣，置于50mL三角瓶中，加2mL甲苯，20mL0.5%磷酸苯二鈉，充分搖勻后放置37度恒溫箱中。培養(yǎng)24小時后，取濾液2mL置于50mL容量瓶中分別加入20mL蒸餾水，0.25mL氯化銨-氫氧化氨緩沖液，0.5mL鐵氰化鉀液, 0.5mL 4-氨基氨替比林液，充分搖勻后定容到50mL。在15分鐘內(nèi)在510nm波長下用分光光度計比色。每個樣在設(shè)置3次重復(fù)的同時，又設(shè)置了1個無基質(zhì)對照。另外，對總試驗(yàn)設(shè)置無土壤對照，并且用同樣方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.2.3 脲酶測定 采用了苯酚-次氯酸鈉比色法（靛酚比色法）。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：取5mL活性污泥水樣，置于50mL三角瓶中，加2mL甲苯處理15min后，加入10mL 10%尿素液和20mL pH6.7的檸檬酸鹽緩沖液。搖勻后將容量瓶放入37恒溫箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，將懸液用致密濾紙過濾，吸取2m濾液注入50 mL容量瓶中分別加入20mL蒸餾水，再加入4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。放置2分鐘后，定容，1小時內(nèi)在分光光度計上于波長578nm處比色。每個樣在設(shè)置3次重復(fù)的同時，又設(shè)置了1個無基質(zhì)對照。另外，對總試驗(yàn)設(shè)置無土壤對照，并且用同樣方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。土壤脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg數(shù)表示。3.3 統(tǒng)計分析方法 通過計算阻抑度來表示壬基酚對活性污泥中三種酶活性的影響。阻抑度計算公式如下： 上式中Acs為某一時間對照樣的酶活性，Ais為不同NP濃度下，某一時間活性污泥樣的酶活性。為了進(jìn)一步分析壬基酚對酶活性的影響，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行了兩因素方差分析。3.4 結(jié)果與討論3.4.1 壬基酚對活性污泥中脫氫酶的影響圖 3.1 NP對脫氫酶活性的影響圖3.2 NP對脫氫酶活性的劑量-效應(yīng)關(guān)系圖 由上圖可以看出，在同一時間內(nèi)活性污泥水樣的壬基酚濃度越高，酶活性越低。不同NP濃度下，脫氫酶活性隨時間的變化逐步下降，第35天之后，不同NP濃度污泥樣的脫氫酶活性下降到一定值后，彼此之間無明顯差別。由此可以看出NP對污泥脫氫酶活性的在28天以內(nèi)具有明顯的抑制影響。為了進(jìn)一步分析NP對污泥脫氫酶活性的影響，擬合出NP對脫氫酶活性阻抑的劑量-效應(yīng)模型如下圖3.2，擬合方程如下表3-2。time (days)Fitting curve equationsR2P7y=5.65logX-23.020.979827.93759E-414y=6.43logX-26.200.94370.0037321y=6.13logX-20.960.95790.002428y=5.05logX-17.460.963120.0019735y=1.79logX-2.570.760210.0022142y=1.91logX-6.340.735740.00456 表3.2 壬基酚對污泥脫氫酶活性的劑量-效應(yīng)的擬合曲線方程由上圖3.2與表3.2可以看出活性污泥水樣中的壬基酚濃度與阻抑度成正相關(guān)，在同一時間內(nèi)壬基酚濃度高越高，阻抑度越高。阻抑度在前期隨著時間的變化而增高，第14天時阻抑效應(yīng)達(dá)到最顯著，第35天以后阻抑效應(yīng)不明顯；而第28天之前，模型Y=aLogX+b對NP的劑量-效應(yīng)擬合效果較好，第35天和42天時擬合效果較差，可能是后期活性污泥中的營養(yǎng)物缺乏，微生物數(shù)量減少，一部分微生物對NP具有耐性造成的。3.4.2 壬基酚對活性污泥中堿性磷酸酶的影響圖 3.3 NP對磷酸酶的活性的影響 由上圖可以看出在某一時間內(nèi)，活性污泥水樣的壬基酚濃度越高，酶活性越低。不同NP濃度活性污泥的磷酸酶活性隨著時間的變化而變化，在21天之前，隨著時間延長，磷酸酶活性逐漸降低，而且NP濃度越高，酶活性越低，第21天時酶活性達(dá)到最低；從第28天開始，酶活性開始上升，第35天時出現(xiàn)一個峰值，之后又開始下降。為了進(jìn)一步分析NP對污泥磷酸酶活性的影響，采用模型Y=aLogX+b擬合NP對磷酸酶活性阻抑的劑量-效應(yīng)，擬合曲線圖及擬合方程分別見圖3.4及表3-3。圖3.4 NP對磷酸酶活性的劑量-效應(yīng)關(guān)系圖表3.3壬基酚對污泥磷酸酶活性的劑量-效應(yīng)的擬合曲線方程time (days)Fitting curve equationsR2P7y=7.27logX-16.710.99062.49E-0414y=6.92logX-9.570.96270.00221y=6.80logX-14.270.97590.0010428y=5.91logX-8.430.95720.0024635y=5.88logX-10.360.85030.0030842y=3.77logX-10.810.80130.02559 從上圖3.4與表3.3可以看出壬基酚對活性污泥中磷酸酶的阻抑度與NP的濃度成正相關(guān)，在某一時間內(nèi)壬基酚濃度高越高，阻抑度越高。阻抑度在第7天時出現(xiàn)最大值，且隨著時間的變化，阻抑度逐漸減小，這有可能是到了后期活性污泥中的營養(yǎng)不足，微生物開始分解自己細(xì)胞中的磷的化合物使得磷酸酶活性上升；總體上，在