卵巢癌細胞凋亡的體外藥敏研究.doc

卵巢癌細胞凋亡的體外藥敏研究【關(guān)鍵詞】 卵巢癌細胞【摘要】 目的 以人卵巢癌細胞系HO-8910為對象，以人黑色素瘤細胞株A-375為陽性對照，以細胞抑制率、細胞凋亡為指標(biāo)，評價8種化療藥物在體外誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡效應(yīng)，為臨床卵巢癌患者個體性化療提供實驗依據(jù)。 方法 （1）應(yīng)用MTT法檢測8種化療藥物對卵巢癌細胞系HO-8910細胞和對照組不同時間、不同濃度化療藥物及其組合的細胞抑制率進行對比，篩選出抑制率最高的化療藥物并進行組合;（2）通過FCM法檢測其誘導(dǎo)細胞凋亡的效果，采用Annexin-V-FITC結(jié)合碘化丙啶（PI）染色和TdT介導(dǎo)X-dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）。 結(jié)果 （1）在MTT法定量檢測中，8種化療藥物作用48h對HO-8910細胞系生長抑制率與對照組相比具有不同程度的差異性，其中以4PPC（32g/ml）的CDDP與4PPC（0.12g/ml）的As 2 O 3 效果最顯著，此時HO-8910細胞系的細胞抑制率分別為80.43%和73.37%，與對照組比較，差異有顯著性（P=0.01）;4PPC（216g/ml）的紫杉醇、1/2PPC（80g/ml）的5-FU對HO-8910細胞系的生長抑制率分別為70.45%和88.95%，與對照組比較，差異無顯著性（P0.05）;4PPC（0.544g/ml）的奧沙利鉑、2PPC（26g/ml）的MTX、4PPC（0.12g/ml）的VCR對HO-8910細胞系的生長抑制率分別為69.52%、71.88%和68.63%，與對照組比較，差異無顯著性（P0.05）;BLM對HO-8910細胞系生長無抑制作用;（2）FCM法定量檢測CDDP+BLM+紫杉醇化療藥物組合作用2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h9個時間段對HO-8910細胞系的細胞凋亡率，與空白對照組比較具有不同程度的差異性，其中以作用48h的細胞凋亡率最高（75.70%），差異有顯著性（P=0.0136）。 結(jié)論 （1）卵巢癌細胞的化療敏感性與化療藥誘導(dǎo)的卵巢癌細胞凋亡密切相關(guān);（2）細胞抑制率、早期細胞凋亡、晚期細胞凋亡、細胞凋亡率可作為制定卵巢癌個體性治療方案的評價指數(shù)體系;（3）在細胞抑制率的基礎(chǔ)上優(yōu)選出相應(yīng)的抗癌藥物，再通過細胞凋亡率評價抗癌藥物的優(yōu)化組合方案，這一腫瘤個體性化療方案制定程序具有可行性，為卵巢癌者個體性化療方案的制定提供了一個有用的研究模式。 關(guān)鍵詞 卵巢癌 細胞凋亡 體外 藥敏實驗 MTT法 FCM法 Chemosensitivity of ovarian cancer cell lines apoptosis in vitro Liu Yi Department of Obstetrics and Gynecology，Zunyi Medical College，Zunyi563000. 【Abstract】 Objective To study the characteristics of the ovarian cancer cell lines HO-8910apoptosis which is induced by chemotherapy drugs and the relationship between the ovarian cancer chemosensitivity.Methods （1）By using MTT test methods gets the growth inhibition precence of ovarian cancer cell lines HO-8910，so we can pri-marily choose the best chemotherapy drugs and their corporations.They can be used as the foundation of the FCMtest methods.（2）Through the FCM test methods of binding the Annexin-V-FITC with PI and TUNEL kit，can test the ovarian cancer cellsearlier apoptosis percence and later ones of the different time and different dose of chemotherapy drugs and their corporations.Then can analyze and make the ovarian cancer cell lines HO-8910s apoptosis chart，so get the chemosensitivity lines to the cell lines uniquely.Results （1）In the MTT test methods，the ovarian cancer cell lines HO-8910has all levels different responses to the8chemotherapy drugs verus human blake tumor cell lines.（2）In the FCM test methods，the corporation of CDDP+Taxol+BLM has the best apoptosis，contrasting to the blank control has conspicous difference（P70%為敏感;50%70%為中度敏感;50%為耐藥 4 。 1.6.2 早期細胞凋亡 （1）FCM法結(jié)合FITC標(biāo)記的An-nexin-V聯(lián)合PI染色作為卵巢癌體外藥敏實驗的早期細胞凋亡檢測方法。原理:根據(jù)Ca 2+ 依賴的磷脂結(jié)合蛋白Annexin-V能高親和結(jié)合PS的原理 5 ，Annexin-V作為檢測細胞表面PS的敏感探針，用于細胞凋亡早期的檢測。由于壞死細胞的細胞膜喪失其完整性，亦可能出現(xiàn)PS外翻，故同時使用膜非通透性DNA染料PI則能從Annexin-V染色的細胞中將凋亡和壞死細胞區(qū)別開來，即:Annexin-V（+）/PI（-）為凋亡細胞;Annexin-V（+）/PI（+）為壞死細胞。（2）Annexin-V-FITC+PI染色步驟及FCM檢測:用冷FBS液（pH7.4）洗細胞2次，然后用1buffer重新懸浮細胞懸液使細胞密度為1106個/ml;吸取100l上步驟制備的單細胞懸液至5ml流式孵育管內(nèi)，每管加入Annexin-V-FITC5l與PI染液5l，輕輕振蕩細胞后在室溫避光孵育15min;1h內(nèi)向上步驟孵育后的管內(nèi)每管加入400l1buffer并進行流式上樣，采用Cell QUEST軟件采集分析。1.6.3 晚期細胞凋亡 （1）FCM法結(jié)合TUNEL的APO-DIRECT KIT作為卵巢癌體外藥敏實驗的晚期細胞凋亡檢測方法。原理:晚期細胞凋亡時核酸內(nèi)切酶激活，使DNA斷裂成50300kb的片段，最終降解成為180200bp的片段，此時將經(jīng)甲醛固定后的細胞加入外源性的TdT和X-dUTP孵育一定時間，通過TdT介導(dǎo)X-dUTP作為DNA斷裂處3-OH末端摻入的引物，并被X-dUTP所標(biāo)記，再通過FCM的熒光標(biāo)記FITC-dUTP，一步反應(yīng)后即可經(jīng)FCM檢測DNA碎片，并可將凋亡細胞與壞死細胞區(qū)分開來。（2）TUNEL的APO-DIRECT KIT操作步驟FCM檢測 細胞固定;上樣:FCM上樣采用Cell QUEST軟件進行采集分析。 1.6.4 細胞凋亡率（AP） AP=（凋亡細胞數(shù)/檢測細胞總數(shù)）100% 6 ，與對照組對比P0.05 2.3 抗癌藥物組合作用不同時間誘導(dǎo)HO-8910細胞早期凋亡效應(yīng) 在CDDP+BLM+紫杉醇化療藥物聯(lián)合作用2h、4h、6h、8h、10h的HO-8910細胞的凋亡率與對照組比較，F(xiàn)CM的散點圖見圖2，數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表2。從圖2左下區(qū)看，誘導(dǎo)早期凋亡的效應(yīng)依次為:B4h、B2h、B6h、B8h和B10h;由圖2與表2得到結(jié)果如下:實驗組的AP在CDDP+BLM+紫杉醇作用24h之間上升，在6h開始下降，810h之間迅速下降，而對照組的最高AP值在同等條件培養(yǎng)6h時，此后即迅速下降，故實驗組與對照組的AP變化有差異，以4h時差異有顯著性（P=0.0145）。 表2 CDDP+BLM+紫杉醇作用不同時間誘導(dǎo)HO-8910細胞早期凋亡效應(yīng) （略） 注: P=0.0145 2.4 抗癌藥物組合作用不同時間誘導(dǎo)HO-8910細胞晚期凋亡效應(yīng) HO-8910細胞在CDDP+BLM+紫杉醇作用1248h之間細胞晚期凋亡率直線上升，與對照組比較具有差異，以48h時差異有顯著性（P=0.0136），見圖3。 圖2 CDDP+BLM+紫杉醇作用不同時間誘導(dǎo)HO-8910細胞早期凋亡散點圖（略） 注:每幅圖的左上區(qū)代表完全壞死的細胞PI（+）;左下區(qū)代表活細胞Annexin-V（-）/PI（-）;右上區(qū)代表壞死細胞和凋亡細胞Annexin-V（+）/PI（+）;右下區(qū)代表早期凋亡細胞Annexin-V（+）/PI（-）。A為相應(yīng)時間的對照組，B2hB10h為CDDP+BLM+紫杉醇不同時間誘導(dǎo)HO-8910細胞早期凋亡的效應(yīng)圖3 CDDP+BLM+紫杉醇組合聯(lián)合作用不同時間誘導(dǎo)HO-8910細胞的晚期凋亡組方圖（略） 注:A代表相應(yīng)時間的對照組，M2代表晚期凋亡細胞百分率的熒光道值;B12hB24h為CDDP+BLM+紫杉醇不同時間誘導(dǎo)HO-8910細胞晚期凋亡的效應(yīng)，由圖3看，誘導(dǎo)晚期凋亡的效應(yīng)依次為B48h、B24h和B12h 3 討論 卵巢癌是目前婦科腫瘤中死亡率最高的疾病，化療是其治療的重要手段之一，但是由于臨床化療缺乏個體性，使得卵巢癌細胞對化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥性成為卵巢癌化療失敗的主要原因。卵巢癌的多藥耐藥性是化療藥誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡受阻抑的結(jié)果，因此進行卵巢癌細胞凋亡的體外藥敏研究成為卵巢癌患者個體性化療的希望。本課題以人卵巢癌細胞系為生物模式，選擇臨床常用的8種抗癌藥物，采用MTT法以及FCM法分別檢測細胞抑制率和細胞凋亡率，并以此作為人卵巢癌個體性化療方案的指標(biāo)體系和制定程序，旨在為卵巢癌患者個體性化療方案的制定提供一個有效的研究模式。 3.1 MTT法檢測結(jié)果的臨床意義 MTT法檢測結(jié)果顯示4PPC的As 2 O 3 對HO-8910細胞的增殖具有明顯的抑制作用，細胞抑制率為73.37%，與對照組比較，差異有顯著性。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，4PPC的紫杉醇的細胞抑制率雖然70%，HO-8910細胞對其敏感，但與對照組比較，差異無顯著性，并且低于4PPC的CDDP的抑制率，因此，本研究結(jié)果與臨床療效不吻合。這與卵巢癌細胞系對化療藥物存在選擇性密切相關(guān)。此外，紫杉醇價格昂貴，缺乏大量臨床樣本的回顧性研究，這也可作為今后研究的新方向。 3.2 FCM法檢測結(jié)果的臨床意義 近5年來，設(shè)法誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡已成為新的化療目標(biāo)，因此細胞凋亡程度成為評估療效的一項新指標(biāo)7 。FCM法檢測細胞凋亡具有敏感度高、特異性好的優(yōu)點，因此，通過FCM法檢測細胞凋亡成為卵巢癌體外藥敏研究的熱點。本課題與其他細胞凋亡的體外化療敏感性實驗設(shè)計相比，獨特之處在于，在細胞抑制率的基礎(chǔ)上優(yōu)選出相應(yīng)的抗癌藥物，再通過細胞凋亡率評價抗癌藥物的優(yōu)化組合方案。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化療藥物組合CDDP+紫杉醇+BLM誘導(dǎo)早期細胞凋亡的效應(yīng)依次為:4h、2h、6h、8h、10h。作用4h達最高AP值，為38.89%，與對照組比較差異有顯著性（P=0.0145）;誘導(dǎo)晚期細胞凋亡的效應(yīng)依次為:48h、24h、12h。作用48h達最高AP值（75.70%），與對照組比較，差異有顯著性（P=0.0136）（未見相關(guān)文獻報道）。該組合誘導(dǎo)HO-8910細胞系細胞凋亡的AP值呈Z型上升，其中晚期AP值直線上升，因此CD-DP+BLM+紫杉醇組合誘導(dǎo)早期細胞凋亡的時間為24h，此后即進入晚期凋亡，故CDDP+BLM+紫杉醇組合對HO-8910細胞系的作用以誘導(dǎo)細胞凋亡為主，并呈時間依賴性。與MTT法檢測的該藥物組合的細胞抑制率結(jié)合發(fā)現(xiàn)兩者具有統(tǒng)一性，即CDDP+BLM+紫杉醇組合的細胞抑制率、細胞凋亡率均在作用48h最高。因此以MTT法檢測的細胞抑制率為基礎(chǔ)，篩選出抗癌藥物組合，再通過FCM法檢測的細胞凋亡率作為評價該組合方案的制定程序具有可行性，為卵巢癌患者個體性化療方案的制定提供了一個有價值的研究模式。FCM法以流式細胞儀為檢測平臺，可同時進行多參數(shù)的定量檢測 8 ，由于流式細胞儀價格昂貴，技術(shù)指標(biāo)復(fù)雜，使得FCM法還沒有在臨床上廣泛開展。但其高特異性以及良好的敏感性將不斷擴大FCM的使用范圍。 4 結(jié)論 本研究采用相差顯微鏡觀察法、MTT法以及FCM檢測法，以人黑色素瘤細胞株作為對照組，對8種藥物及其組合作用后卵巢癌細胞系HO-8910進行體外藥敏研究。通過MTT法檢測的8種藥物及其組合作用后的細胞抑制率，篩選出的化療藥物組合進行FCM法檢測該組合誘導(dǎo)HO-8910細胞凋亡的AP。結(jié)果揭示:（1）卵巢癌細胞的化療敏感性與化療藥誘導(dǎo)的卵巢癌細胞凋亡密切相關(guān);（2）細胞抑制率、早期細胞凋亡、晚期細胞凋亡、細胞凋亡率可作為制定卵巢癌個體性治療方案的評價指數(shù)體系;（3）在細胞抑制率的基礎(chǔ)上優(yōu)選出相應(yīng)的抗癌藥物，再通過細胞凋亡率評價抗癌藥物的優(yōu)化組合方案，這一腫瘤個體性化療方案制定程序具有可行性，為其他腫瘤患者個體化療方案的制定提供了一個有效的研究模式。 參考文獻 1 Hannun YA.Apoptosis and dilemma of cancer chemotherapy.Blood，1997，89:1845-1856. 2 Herr I，