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YourText 第六章糖類藥物 1 2 Text1 Text3 Text4 Txt5 Text6 植物 動物 微生物 海藻 多糖的分類 按照其來源不同來分 3 多糖在細胞內(nèi)的存在方式 游離型結(jié)合型 糖蛋白 如人參多糖 黃芪多糖等脂多糖 如胎盤脂多糖 細菌脂多糖等 4 多糖類藥物的藥理活性 抗氧化 調(diào)節(jié)血糖血脂 抗輻射損傷 抗?jié)?調(diào)節(jié)免疫功能 抗病毒 抗突變 抗衰老 抗腫瘤 抗凝血 5 國內(nèi)已經(jīng)上市的部分多糖藥物 6 粘多糖的特點 7 粘多糖的連接方式 8 甲殼素 軟骨素 4 硫酸軟骨素 6 硫酸軟骨素 硫酸乙酰肝素 硫酸角質(zhì)素 透明質(zhì)酸 硫酸皮膚素 幾種粘多糖的重復單位 9 四級結(jié)構(gòu) 三級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu) 空間結(jié)構(gòu) 多糖的結(jié)構(gòu) 10 多糖的結(jié)構(gòu) 11 12 多糖的構(gòu)效關(guān)系 13 第一節(jié)糖類藥物制備的一般方法一 游離單糖及小分子寡糖易溶于冷水及溫乙醇 用水或在中性條件下以50 乙醇 也可以用82 乙醇 在70 78 下回流提取 溶劑用量一般為材料的20倍 需多次提取 植物材料磨碎經(jīng)乙醚或石油醚脫脂 拌加碳酸鈣 以50 乙醇溫浸 浸液合并 于40 45 減壓濃縮至適當體積 用中性醋酸鉛去雜蛋白及其他雜質(zhì) 鉛離子可通H2S除去 再濃縮至粘稠狀 以甲醇或乙醇溫浸 去不溶物如無機鹽或殘留蛋白質(zhì)等 14 醇液經(jīng)活性炭脫色 濃縮 冷卻 滴加乙醚 或置于硫酸干燥器中旋轉(zhuǎn) 析出結(jié)晶 單糖或小分子寡糖也可以在提取后 用吸附層析法或離子交換法進行純化 二 多糖的分離與純化多糖可來自動物 植物和微生物 植物體內(nèi)含有水解多糖衍生物的酶 必須抑制或破壞酶的作用后 才能制取天然存在形式的多糖 使多糖免受到內(nèi)原酶的作用 速凍冷藏是保存提取多糖材料的有效方法 15 昆布多糖 果聚糖 糖原易溶于水 殼多糖與纖維素溶于濃酸 直鏈淀粉易溶于稀堿 酸性粘多糖常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起 提取分離時 通常先用蛋白酶或濃堿 濃中性鹽解離蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合鍵后 用水提取 以乙醇或十六烷基三甲基溴化銨 CTAB 沉淀酸性多糖 最后用離子交換色譜法進一步純化 多糖的提取第一步脫脂 以便多糖釋放 方法是將材料粉碎 用甲醇或1 1乙醇乙醚混合液 加熱攪拌1 3小時 也可用石油醚脫脂 動物材料可用丙酮脫脂 脫水處理 16 第二步多糖的提取方法主要有以下幾種 1 難溶于冷水 熱水 可溶于稀堿液者這一類多糖主要是不溶性膠類 如木聚精 半乳聚糖等 用冷水浸潤材料后用0 5mol LNaOH提取 提取液用鹽酸中和 濃縮后 加乙醇沉淀得多糖 如在稀堿中仍不易溶出者 可加入硼砂 對甘露聚糖 半乳聚糖等能形成硼酸絡(luò)合物的多糖 此法可得相當純的物質(zhì) 2 易溶于溫水 難溶于冷水和乙醇者材料用冷水浸過 用熱水提取 必要時可加熱至80 90 攪拌提取 17 提取液用正丁醇與氯仿混合液除去雜蛋白 或用三氯乙酸除雜蛋白 離心除去雜蛋白后的清液 透析后用乙醇沉淀得多糖 3 粘多糖有些粘多糖可用水或鹽溶液直接提取 但因大部粘多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合于細胞中 因此需用酶解法或堿解法使糖 蛋白質(zhì)間的結(jié)合鍵斷裂 促使多糖釋放 一般組織中存在多種粘多糖 需要對粘多糖進行分離純化 18 1 堿解法多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖肽鍵對堿不穩(wěn)定 故可用堿解法使糖與蛋白質(zhì)分開 但若硫酸基與鄰羥基處于反式結(jié)構(gòu)或硫酸基在C 3或C 6 此時易發(fā)生脫硫作用 這類多糖不宜用堿解法提取 2 酶解法理想的工具酶是專一性低的 具有廣泛水解作用的蛋白酶 鑒于蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵 為除去長肽段 ?？膳c堿解法合用 常用的酶制劑有胰蛋白酶 木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶 19 二 多糖的純化 1 乙醇沉淀法乙醇沉淀法是制備粘多糖的最常用手段 乙醇的加人 改變了溶液的極性 導致糖溶解度下降 向溶液中加入一定濃度的鹽 如醋酸鈉 醋酸鉀 醋酸銨或氯化鈉有助于使粘多糖從溶液中析出 鹽的最終濃度5 即足夠 使用醋酸鹽的優(yōu)點是在乙醇中其溶解度更大 即使在乙醇過量時 也不會發(fā)生這類鹽的共沉淀 可以使用多次乙醇沉淀法脫鹽 也可以用超濾法或分子篩法 SephadexG 10或G 15 進行多糖脫鹽 20 沉淀物可用無水乙醇 丙酮 乙醚脫水 真空干燥即可得疏松粉末狀產(chǎn)品 2 分級沉淀法不同多糖在不同濃度的甲醇 乙醇或丙酮中的溶解度不同 因此可用不同濃度的有機溶劑分級沉淀分子大小不同的粘多糖 在Ca2 Zn2 等二價金屬離子的存在下 采用乙醇分級分離粘多糖可以獲得最佳效果 3 季胺鹽絡(luò)合法粘多糖與一些陽離子表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨 CTAB 和十六烷基氯化砒啶 CPC 等能形成季胺鹽絡(luò)合物 這些絡(luò)合物在 在離子強度大時 這種絡(luò)合物可以解離 溶解 釋放 21 使其溶解度發(fā)生明顯改變時的無機鹽濃度 臨界鹽濃度 這主要取決于聚陰離子的電荷密度 粘多糖的硫酸化程度影響其電荷密度 根據(jù)其臨界鹽濃度的差異可以將粘多糖分離 降低pH可抑制羧基的電離 有利于增強硫酸粘多糖的選擇性沉淀 季胺鹽的沉淀能力受其烷基鏈中的 CH 基數(shù)的影響 還可以用不同種季胺鹽的混合物作為酸性粘多糖的分離沉淀劑 應(yīng)用季胺鹽沉淀多糖是分級分離復雜粘多糖與從稀溶液中回收粘多糖的最有用方法之一 22 4 離子交換層析法粘多糖由于具有酸性基團如糖醛酸和各種硫酸基 在溶液中以聚陰離子形式存在 因而可用陰離子交換劑進行交換吸附 吸附時可以使用低鹽濃度樣液 洗脫時可以逐步提高鹽濃度如梯度洗脫或分步階梯洗脫 可以依次分離透明質(zhì)酸 硫酸乙酰肝素 硫酸軟骨素和硫酸皮膚素與硫酸角質(zhì)素和肝素 此外 區(qū)帶電泳法 超濾法及金屬絡(luò)合法等在多糖的分離純化中也常采用 23 24 第二節(jié)重要糖類藥物生產(chǎn)工藝一 D 甘露醇 D Mannitol 一 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)甘露醇又名己六醇甘露醇為白色針狀結(jié)晶 無臭 略有甜味 不潮解 易溶于水 溶于熱乙醇 微溶于低級醇類 低級胺類 吡啶 不溶于有機溶劑 25 二 生產(chǎn)工藝甘露醇在海藻 海帶中含量較高 以葡萄糖為原料 經(jīng)電解 脫鹽 精制即可制得也可以用發(fā)酵法生產(chǎn) 1 提取法 1 工藝路線 26 2 發(fā)酵法 1 工藝路線 2 工藝過程 菌種選育 種子培養(yǎng) 發(fā)酵混合柱脫鹽 目的 思路 方法 27 原料斜面培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽1kg瓊脂2 1 淀粉糖化液2 2 玉米粉2 2 玉米漿0 5 0 5 NaNO30 3 0 3 KH2PO40 1 0 1 MgSO40 05 0 05 KCl0 05 0 05 FeSO40 001 0 001 28 3 制劑取適量注射用水 按20 標示量 稱取結(jié)晶甘露醇 加熱90 攪拌溶解后 加入1 活性炭 加熱5min 過濾 再補足注射用水至標示量 檢測pH 4 5 6 5 和含量 合格后 經(jīng)G3垂熔漏斗澄清過濾 分裝于50ml 100ml 250ml安瓿瓶或輸液瓶中 以1Kg cm2蒸汽滅菌40min 即得甘露醇注射液 20 甘露醇注射液是飽和溶液 為防止在溫度過低時析出結(jié)晶 配制時需保溫45 左右趁熱過濾 5 07 甘露醇溶液為等滲溶液 含熱原的注射液可通過陽樹脂 H 型 與陰樹脂 OH 處理 制得pH合適又不含熱原的注射液 29 二 1 6 二磷酸果糖 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1 6 二磷酸果糖是果糖的1 6 二磷酸酯 其分子形式有游離酸FDPH4與鈉鹽如1 6 二磷酸果糖三鈉鹽 FDPNa3H 等 FDPNa3H為白色晶形粉末 有旋光 易溶于水 不溶于有機溶劑 4 時較穩(wěn)定 久置空氣中易吸潮結(jié)塊 轉(zhuǎn)為微黃色 30 二 生產(chǎn)工藝1 酶轉(zhuǎn)化工藝 1 工藝路線 31 取經(jīng)多代發(fā)酵應(yīng)用過的酵母渣 懸浮于適量蒸餾水中 反復凍融3次 加入底物 8 蔗糖 4 NaH2PO4 30mmol LMgCl2 pH6 5 于30 反應(yīng)6h 除雜蛋白煮沸5min 陰離子交換柱層析 轉(zhuǎn)酸FDPCa沉淀懸浮于水中 732樹脂轉(zhuǎn)酸 NaOH調(diào)pH5 3 5 8 除菌過濾后 凍干 32 2 固定化細胞制備工藝 1 工藝路線 菌體用等體積生理鹽水懸浮 預熱至40 用4倍量生理鹽水加熱溶解卡拉膠 兩者于45 混合攪拌10min 倒入成型器皿中 4 10 冷卻30min 加入等量0 3moI LKCl浸泡硬化4h 33 活化固定化細胞用含底物的表面活性劑 于35 浸泡活化固定化細胞12h 用0 3mol LKCl洗滌后浸泡于生理鹽水中備用 酶促轉(zhuǎn)化以活化固定化細胞充填柱反應(yīng)器 以上行法 通入30 底物溶液 內(nèi)含8 蔗糖 4 NaH2PO4 5mmol LATP 30mmoI LMgC12 收集反應(yīng)液 固定化的影響 1 構(gòu)象改變 立體屏蔽 微擾2 分配效應(yīng)和擴散限制效應(yīng)3 酶作用的活力加強 穩(wěn)定性提高 34 四 作用與用途FDP是葡萄糖代謝過程中的重要中間產(chǎn)物 是分子水平上的代謝調(diào)節(jié)劑 FDP具有促進細胞內(nèi)高能基團的重建 保持紅細胞的韌性及向組織釋放氧氣的能力 是糖代謝的重要促進劑 臨床驗證表明FDP是急性心肌梗塞 心功能不全 冠心病 心肌缺血發(fā)作 休克等癥的急救藥物 它有利于改善心力衰竭 肝腎功能衰竭等臨床危象 在各類外科手術(shù)中可以作為重要輔助治療藥物 對各類肝炎引起的深度黃疽 轉(zhuǎn)氨酶升高及低白蛋白血癥者也有較好的治療作用 35 三 肝素 一 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)肝素是天然抗凝劑 是一種含有硫酸基的酸性粘多糖 肝素分子量不均一 由低 中 高三類不同分子量組成 分子量從3000到37500 肝素及其鈉鹽為白色或灰白色粉末 無臭無味 有吸濕性 易溶于水 不溶于乙醇 丙酮 二氧六環(huán)等有機溶劑 其游離酸在乙醚中有一定溶解性 肝素分子中含有硫酸基與羧基 呈強酸性 為聚陰離子 能與陽離子反應(yīng)成鹽 硫酸化程度高的肝素具有較高的降脂和抗凝活性 小分子量肝素 分子量4000 5000 具有較低的抗凝活性和較高的抗血栓形成活性 36 肝素的結(jié)構(gòu) 含硫酸基的酸性粘多糖三硫酸雙糖與二硫酸雙糖以2 1比例在分子中連結(jié) 三硫酸雙糖中是L 艾杜糖醛酸 二硫酸雙糖中是D 葡萄糖醛酸 37 二 生產(chǎn)工藝肝素系廣泛分布于哺乳動物的肝 肺 心 脾 腎 胸腺 腸粘膜 肌肉和血液里 因此肝素可由豬腸粘膜 牛肺 豬肺提取 其生產(chǎn)工藝主要有鹽解 季胺鹽沉淀法 鹽解 離子交換法和酶解 離子交換法 肝素在組織內(nèi)和其他粘多糖一起與蛋白質(zhì)結(jié)合成復合物 因此肝素制備過程包括肝素蛋白質(zhì)復合物的提取 解離和肝素的分離純化兩個步驟 38 1 鹽解 離子交換生產(chǎn)工藝 1 工藝路線 繼續(xù)升溫至95 維持10min 95 乙醇沉淀過夜NaOH調(diào)PH11 按3 量加入H2O2 H2O2濃度30 濃度30 共48小時 去熱原 雜質(zhì) 39 2 酶解 離子交換生產(chǎn)工藝 1 工藝路線 2 工藝過程加入4 KMnO4 預熱至80 保溫2 5h 40 三 檢驗方法 四 作用與用途肝素是典型的抗凝血藥 能阻止血液的凝結(jié)過程 用于防止血栓的形成 41 四 硫酸軟骨素 一 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)硫酸軟骨素 CS 的藥用商品名為康得靈 是從動物軟骨中提取制備的酸性粘多糖 主要是硫酸軟骨素A C及各種硫酸軟骨素的混合物 硫酸軟骨素為白色粉末 無臭 無味 吸水性強 易溶于水而成粘度大的溶液 不溶于乙醇 丙酮和乙醚等有機溶劑中 其鹽對熱較穩(wěn)定 受熱80 亦不破壞 游離硫酸軟骨素水溶液 遇較高溫度或酸即不穩(wěn)定 主要是脫乙酰基或降解成單糖或分子量較小的多糖 42 43 二 生產(chǎn)工藝硫酸軟骨素廣泛存在于動物的軟骨 喉骨 鼻骨 豬含41 牛 馬鼻中膈和氣管 含36 39 中 在骨腱 韌帶 皮膚 角膜等組織中也有 魚類軟骨中含量也很高 如鯊魚骨中含50 60 在軟骨中 硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)結(jié)合成蛋白多糖 并與膠原蛋白結(jié)合在一起 其提取分離方法有稀堿 酶解法 濃堿水解法 稀堿 濃鹽法 酶解 樹脂法 44 1 稀堿 濃鹽法 1 工藝路線 2 工藝過程 乙醇濃度為60 沉淀60 65 真空干燥 45 2 稀堿 酶解法 1 工藝路線 2 工藝過程 酶解pH8 8 8 9 加人胰酶 于53 54 保溫水解6 7h 46 3 制劑按配方含2 硫酸軟骨素 0 85 NaCl 稱取標示量107 的硫酸軟骨素干粉 以純品計 撒入注射用水中 使其溶脹 攪拌溶解 再加入NaCl 調(diào)pH5 5 加熱煮沸 用布氏漏斗過濾 濾液加入0 3 0 5 活性炭 加熱至微沸 保持15min 用砂棒包扎濾紙乘熱過濾 濾液冷卻后 補加注射用水至全量 用3號垂熔漏斗過濾至瞪明 按每支2ml灌封 滅菌 即得硫酸軟骨素注射液 47 四 作用與用途硫酸軟骨素 尤其硫酸軟骨素A能增強脂肪酶的活性 使乳糜微粒中的甘油三酯分解 使血中乳糜微粒減少而澄清 還具有抗凝和抗血栓作用 可用于冠狀動脈硬化 血脂和膽固醇增高 心絞痛 心肌缺血和心肌梗塞等癥 硫酸軟骨素還用于防治鏈霉素所引起的聽覺障礙癥以及偏頭痛 神經(jīng)痛 老年肩痛 腰痛 關(guān)節(jié)炎與肝炎等 還用作皮膚化妝品等 48 一 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)透明質(zhì)酸是由 1 3 2 乙酰氨基 2 脫氧 D 葡萄糖 1 4 O D 葡萄糖醛酸的雙糖重復單位所組成的酸性多糖 分子量50 200萬 49 透明質(zhì)酸為白色 無定形固體 無臭無味 有吸濕性 溶于水 不溶于有機溶劑 有旋光 具有較高的粘度特性 下述因素會影響透明質(zhì)酸溶液的粘度 如pH值低于或高于pH7 0 或有透明質(zhì)酸酶存在時會引起分子中糖苷鍵的水解 許多還原性物質(zhì)如半胱氨酸 焦性沒食子酸 抗壞血酸 重金屬離子和紫外線 電離輻射等也能引起分子間的解聚而造成粘度下降 二 生產(chǎn)工藝制備透明質(zhì)酸的常用原料有公雞冠 眼球玻璃體 人臍帶 豬皮 兔皮等 50 1 工藝路