綠原酸含量測定.doc

綠原酸提取與測定綠原酸（chlorogenic acid）是一種從雙子葉植物（如忍冬葉、咖啡豆、向日葵）的葉和果實分離得到的酚類,也是許多中草藥（如杜仲、金銀花、茵陳等）及中藥復(fù)方制劑抗菌消炎、清熱解毒的主要活性成分，目前已成為中草藥制劑質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一。綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物。它是一種由咖啡酸(caffeic acid)與奎尼酸(雞納酸,quinic acid,即1-羥基六氫沒食子酸)縮合而成的縮酚酸,異名咖啡鞣酸,化學(xué)名3-O-咖啡?？崴?3-O-caffeoylquinic acid),分子式為C16H18O9,分子量:345.30，半水合物為針狀晶體，110時變?yōu)闊o水化合物，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常溫下呈淡黃色固體。綠原酸在植物中分布廣泛,從高等雙子葉植物到蕨類植物均有報道，但含量較高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬屬(Lonicera)、菊科蒿屬(Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金銀花、向日葵、咖啡、可可樹。植物的不同品種、發(fā)育階段、同一植株的不同部位、存放時間、生長環(huán)境等均能影響植物中綠原酸的含量。以杜仲為例：葉中綠原酸的含量高于皮中含量數(shù)倍之多；用不同干燥方法對綠原酸含量的影響研究中,用陰干、曬干、直接烘干所測綠原酸含量分別是2.21%、2.17%和2.24%;鮮葉綠色含綠原酸3.52%,放置1年后,葉色棕綠,綠原酸含量為2.47%。由于綠原酸是極性較強的有機酸，易溶于醇、水，難溶于氯仿、乙醚,因此綠原酸的提取方法較多，有醇（甲醇、乙醇）溶法、水提醇沉、醇提鉛沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱層析法等。下面介紹幾種提取方法。醇溶法：先用氯仿進行連續(xù)提取至流出液呈無色;再改用95%工業(yè)乙醇提取,提盡綠原酸;將所得乙醇提取液減壓濃縮成浸膏,與干凈細沙拌合后,用熱水提取數(shù)次,使綠原酸轉(zhuǎn)溶于水中,棄去殘渣;所得水溶液用乙醚萃取,進一步除去脂溶性雜質(zhì);向脫脂后的水溶液中加入飽和無機鹽溶液,至沉淀完全,并稍有過量為止。此時,水中的綠原酸與金屬離子結(jié)合生成不溶性鹽;用離心分離法分離出沉淀并除去沉淀中的金屬離子后,將所得濾液用有機溶劑萃取數(shù)次,回收溶劑,得綠原酸粗品,經(jīng)分步結(jié)晶和重結(jié)晶等方法精制,即得綠原酸純品,得率約為0.5%。水提醇沉法：采用水為溶劑,加熱煮沸提取,但相應(yīng)地增加其他水溶性成分如蛋白質(zhì)、多糖、鞣質(zhì)等雜質(zhì),可用傳統(tǒng)的醇沉法除去。醇沉過程中伴隨吸附和包夾,致使綠原酸有不同程度的損失。提取水提液中綠原酸時,分次醇沉比一次醇沉所得產(chǎn)品純度高;當(dāng)乙醇濃度最終為90%時,一次醇沉的損失率比分次醇沉較大。水提石灰乳沉淀法：在待測物水溶液中,加石灰乳使綠原酸生成鈣鹽沉淀,用稀酸分解,提取物中綠原酸得率較低,可能因為綠原酸是酯類,被強堿水解所致。雖然許多研究者對綠原酸含量的測定方法進行了研究或評述,在分析、測定過程中不乏采用層析方法,但各種方法均有其不完善之處，難以分離出全部綠原酸并得到純品（不包括綠原酸異構(gòu)體）。同樣，綠原酸的含量測定方法有許多種。由于許多物質(zhì)同綠原酸分子結(jié)構(gòu)相似,同存于一種藥材或制劑中。因此在進行含量測定時常難以分離。常用分析方法有紫外分光光度法(UV)、高效液相色譜(HPLC)法等。這些方法要么難以完全分離待測物質(zhì)，要么易受干擾，或者分析時間長、效率低?，F(xiàn)在在中藥成分分析中開始采用一種新技術(shù)即高效毛細管電泳(HPCE) 技術(shù)。它具有高分離效率、分析時間短、進樣量少、低檢測限和重現(xiàn)性好等特點。但由于在中藥材的成分分析中才剛應(yīng)用，效果如何還有待評價。下面介紹一種檢測方法。1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品80mg，用95%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移到250ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混勻。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml到250ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混勻，此為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在330nm處測定吸光度，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相應(yīng)的回歸方程。2 . 樣品中綠原酸含量的測定（1）提取液的制備 準(zhǔn)確稱取中草藥提取物樣品各1.0835g，置于250ml錐形瓶中，量取約50ml95%的乙醇溶解樣品，并置于85的恒溫水浴箱中，回流4h。放置、冷卻至室溫，過濾，然后加95%的乙醇將提取液定容于250ml容量瓶，待用。（2）含量測定 準(zhǔn)確吸取樣品提取液5ml于25ml容量瓶中，加95%的乙醇稀釋到刻度，得到待測樣品液。以95%的乙醇作空白，在330nm處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品液濃度。3 . 回收率的測定準(zhǔn)確稱取中草藥提取物樣品0.20g，分