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液相色譜基礎(chǔ) 2 色譜起源 俄國植物學(xué)家茨維特 Tswett 在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的 色譜法 Chromatography 因之得名 3 島津高效液相色譜儀LC 10Avp系列 4 高效液相色譜分析過程 高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 記錄系統(tǒng)等五大部分組成 分析前 選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相 開泵 沖洗柱子 待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后 用微量注射器把樣品注入進(jìn)樣口 流動(dòng)相把試樣帶入色譜柱進(jìn)行分離 分離后的組分依次流入檢測器的流通池 最后和洗脫液一起排入流出物收集器 當(dāng)有樣品組分流過流通池時(shí) 檢測器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號(hào) 經(jīng)過放大 用記錄器記錄下來就得到色譜圖 色譜圖是定性 定量和評價(jià)柱效高低的依據(jù) 5 色譜分離過程 6 高效液相色譜原理 色譜法 利用樣品組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)流動(dòng)相 攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的液體固定相 靜止不動(dòng)的一相 化學(xué)鍵合型固定相 7 高效液相色譜法的特點(diǎn) 高效液相色譜法法 HighperformanceLiquidChromatography HPLC 與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻 小顆粒具有高柱效 但會(huì)引起高阻力 需用高壓輸送流動(dòng)相 故又稱高壓液相色譜法 HighPressureLiquidChromatography HPLC HPLC有以下特點(diǎn) 高壓 壓力可達(dá)15 30MPa 高速 流速為0 001 10 000ml min 高效 在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種 高靈敏度 紫外檢測器靈敏度可達(dá)0 01ng 熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0 1pg 8 高效液相色譜法的分類 按分離機(jī)制不同分為液固色譜法鍵合相液相色譜法正相色譜法反相色譜法離子交換色譜法離子對色譜法體積排阻色譜法 9 液相維護(hù)流程圖 色譜柱 10 流動(dòng)相 流動(dòng)相選擇注意事項(xiàng) 純度 采用 HPLC 級溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配 11 溶劑前處理 過濾 0 45um或更小孔徑濾膜目的 除去溶劑中的微小顆粒 避免堵塞色譜柱 尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液 脫氣目的 除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響 1 柱流量不準(zhǔn)2 檢測器基線波動(dòng)脫氣注意點(diǎn) 1 每天脫氣 無在線脫氣器時(shí) 2 混合溶劑脫氣時(shí)間不能過長 12 工作原理 在線脫氣機(jī) 13 何時(shí)需要使用在線脫氣機(jī) 14 輸液泵 送液方式 恒流控制恒壓控制VP系列 LC 10ADvp泵和LC 10ATvp泵Prominence LC 20AD LC 20AT LC 20AB泵D泵 并聯(lián)微體積往復(fù)式泵T泵 串聯(lián)式往復(fù)泵B泵 并聯(lián)微體積往復(fù)式泵 2組 15 等度洗脫和梯度洗脫 等度洗脫 梯度洗脫 16 梯度洗脫 梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例 從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度 極性 pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化 達(dá)到提高分離效果 縮短分析時(shí)間的目的 優(yōu)點(diǎn) 可提高分離度 縮短分析時(shí)間 降低最小檢測量和提高分離精度注意事項(xiàng) 溶劑的純度要高 否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差 17 高壓梯度泵系統(tǒng) 18 四元低壓梯度泵系統(tǒng) 19 進(jìn)樣器 自動(dòng)進(jìn)樣器SIL 10HTSIL 10ASIL 20A C手動(dòng)進(jìn)樣器Rheodyne7725 7725i原理 六通閥 注入方式 1 全量注入2 部分注入 20 手動(dòng)進(jìn)樣器使用須知 全量進(jìn)樣 進(jìn)樣體積至少為定量環(huán)的3倍以上 半量進(jìn)樣 進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50 一定要使用合規(guī)格的進(jìn)樣器 規(guī)格為外徑0 028英寸 長2英寸的平頭針 一定不能使用尖針 它會(huì)嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈 21 裝填狀態(tài) 樣品注入 六通閥 22 柱溫箱 柱溫控制的優(yōu)點(diǎn) 分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性 23 低價(jià)格 小體積可安裝手動(dòng)進(jìn)樣器溫度范圍室溫 15 C 80 C室溫傳感器保證分析在可靠的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行可單獨(dú)進(jìn)行操作 容量大 可容納2個(gè)切換閥 手動(dòng)進(jìn)樣器混合室 VP副控制器CDD L ECD檢測池溫度范圍室溫 10 C 80 C Avp 室溫 10 C 80 C ACvp 室溫傳感器保證分析在可靠的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行可單獨(dú)進(jìn)行操作 CTO 10ASvp 半導(dǎo)體模塊加熱式 CTO 10A C vp 空氣循環(huán)式 CTO 10A系列 24 色譜柱 反相色譜柱 C18 C8 氰基 氨基 苯基 正相色譜柱 硅膠 氰基 氨基 離子交換色譜柱 SCX SAX 凝膠色譜柱 凝膠 手性色譜柱 牛血清蛋白 AGP 環(huán)糊精等 25 檢測器 SPD 10Avp 190 600nm 紫外檢測器SPD 10AVvp 190 900nm 紫外檢測器SPD M10Avp 190 800nm 二極管陣列檢測器RF 10AXL熒光檢測器RID 10A示差折光檢測器CDD 10Avp電導(dǎo)檢測器L ECD 6A電化學(xué)檢測器ELSD蒸發(fā)光散射檢測器 26 紫外可見光檢測器 Ein Eout A eCl log Eout Ein 比爾定律 檢測池 C 濃度 l 優(yōu)點(diǎn) 1 靈敏度高2 對溫度和流速不敏感3 可用于梯度洗脫缺點(diǎn) 僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì) 原理 27 島津VP系列紫外檢測器功能 設(shè)定時(shí)間程序 切換檢測波長等 雙波長檢測比例色譜 初步判斷峰的純度停泵掃描 確定組分最大吸收波長 28 時(shí)間程序 29 雙波長檢測 水溶維生素的雙波長檢測 30 比例色譜 31 停機(jī)掃描 32 二極管陣列檢測器 色譜圖 光譜圖 吸光度 波長 時(shí)間 33 熒光檢測器 優(yōu)點(diǎn) 1 靈敏度極高 是最靈敏的檢測器之一2 選擇性好3 對溫度和流速不敏感 可用于梯度洗脫缺點(diǎn) 僅適用于測定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可檢測物質(zhì) 多環(huán)芳烴 霉菌毒素 酪氨酸 色氨酸 卟啉 兒茶酚氨等 具有對稱共軛體系 34 示差折光檢測器 原理 連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣中各組分濃度 優(yōu)點(diǎn) 通用型檢測器缺點(diǎn) 1 對溫度變化敏感2 對溶劑組成變化敏感 不能用于梯度檢測3 屬于中等靈敏度的檢測器 35 電導(dǎo)檢測器 原理 根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化來測定電離物質(zhì)含量 優(yōu)點(diǎn) 對流動(dòng)相流速和壓力的改變不敏感 可用于梯度洗脫缺點(diǎn) 對溫度變化敏感 每升高1度 電導(dǎo)率增加2 2 5 廣泛應(yīng)用于離子色譜 主要用于檢測水溶性無機(jī)和有機(jī)離子 36 電化學(xué)檢測器 原理 測量電活性分子在工作電極表面氧化或還原反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生電流變化的檢測優(yōu)點(diǎn) 1 靈敏度高2 選擇性好 只檢測電活性物質(zhì)缺點(diǎn) 1 不適用于梯度洗脫2 對溫度 壓力變化敏感 37 蒸發(fā)光散射檢測器 原理 柱流出物霧化流動(dòng)相蒸發(fā)溶質(zhì)粒子散射光強(qiáng)度檢測 優(yōu)點(diǎn) 1 適用于沒有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待測物2 可以應(yīng)用有強(qiáng)紫外吸收的試劑 如氯仿 丙酮等3 適用于梯度洗脫4 通用型檢測器 只要待測物揮發(fā)性低于溶劑 即可適用5 對環(huán)境影響不靈敏 室溫下即可操作6 沒有溶劑前緣峰 適用于保留時(shí)間短的物質(zhì)的檢測缺點(diǎn) 1 如果流動(dòng)相不能揮發(fā) 如含有鈉鹽 鉀鹽等 不適用2