PCR使用說明引物設(shè)計(jì)技巧.doc

自從1985 年Karny Mullis 發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以來，PCR 技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用最多、最廣泛的手段之一1，而引物設(shè)計(jì)是PCR 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR 引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR 引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。一般來說，專門進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)的專業(yè)軟件功能更為強(qiáng)大，但使用起來卻不太容易。本文將就引物設(shè)計(jì)原則及軟件使用問題進(jìn)行探討。 引物設(shè)計(jì)的原則 引物設(shè)計(jì)有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。 具體實(shí)現(xiàn)這3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產(chǎn)物長度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, 用G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC 含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實(shí)踐中的總結(jié)，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)： 1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)2。 2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端出現(xiàn)3 個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加2。 3. 引物3端的末位堿基對(duì)Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A34。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)PCR 影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物2。 4. 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大25。 5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm 值在72左右可使復(fù)性條件最佳。Tm 值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method) 67。 6. G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G 值較低（絕對(duì)值不超過9），而5端和中間G 值相對(duì)較高的引物。引物的3端的G 值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)6。 7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行8。 8. 對(duì)引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR 因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 引物的自動(dòng)搜索和評(píng)價(jià)分析 軟件的引物設(shè)計(jì)功能主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先是引物分析評(píng)價(jià)功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做到，其中以“Oligo 6”最優(yōu)秀；其次是引物的自動(dòng)搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同，因此自動(dòng)搜索的結(jié)果也不盡相同。據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，自動(dòng)搜索功能以“Premier Primer”為最強(qiáng)且方便使用，“Oligo 6”其次，其他軟件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都帶有引物自動(dòng)搜索功能，但搜索結(jié)果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。筆者認(rèn)為引物設(shè)計(jì)軟件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”軟件合并使用，以“Premier”進(jìn)行自動(dòng)搜索，“Oligo”進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，如此可快速設(shè)計(jì)出成功率很高的引物。 Primer Premier 5.0 的使用技巧簡介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì)( )、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”還具有同源性分析功能（ ），但并非其特長，在此略過。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡并引物，另外還有序列“朗讀”、DNA 與蛋白序列的互換（ ）、語音提示鍵盤輸入（ ）等等。 有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA 來設(shè)計(jì)引物，由于大多數(shù)氨基酸（20 種常見結(jié)構(gòu)氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時(shí)，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì)并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點(diǎn)有所變化，稱之為簡并引物。遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的?！癙remier”可以針對(duì)模板DNA 的來源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA 和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）、無脊椎動(dòng)物線粒體（Invertebrate Mitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（Plant Mitochondrion）、原生動(dòng)物線粒體（Protozoan Mitochondrion）、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）、脊椎動(dòng)物線粒體（Vertebrate Mitochondrion）和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步驟及技巧 “Premier”軟件啟動(dòng)界面如下：(轉(zhuǎn)載的時(shí)候就沒有圖) 其主要功能在主界面上一目了然（按鈕功能如上述）。限制性酶切點(diǎn)分析及基元查找功能比較簡單，點(diǎn)擊該功能按鈕后，選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按確定即可。常見的限制性內(nèi)切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制性內(nèi)切酶或基元。 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，點(diǎn)擊按鈕，界面如下： 進(jìn)一步點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)“search criteria”窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目的（Seach For）有三種選項(xiàng)，PCR 引物（PCR Primers），測(cè)序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時(shí)查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對(duì)查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區(qū)域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數(shù)選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。如果沒有特殊要求，建議使用默認(rèn)設(shè)置。然后按，隨之出現(xiàn)的Search Progress 窗口中顯示Search Completed 時(shí)，再按，這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對(duì)顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對(duì)方式，并按優(yōu)劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)（如下圖）。 點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，如第1#引物，并把上述窗口挪開或退出，顯示“Peimer Premier”主窗口，如圖所示： 該圖分三部分，最上面是圖示PCR 模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin），二聚體（Dimer），錯(cuò)誤引發(fā)情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由變成，點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應(yīng)用。 在需要對(duì)引物進(jìn)行修飾編輯時(shí)，如在5端加入酶切位點(diǎn)，可點(diǎn)擊，然后修改引物序列。若要回到搜索結(jié)果中，則點(diǎn)擊按鈕。如果要設(shè)計(jì)簡并引物，只需根據(jù)源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī)則，反推至DNA 序列即可。對(duì)簡并引物的分析不需像一般引物那樣嚴(yán)格。總之，“Premier”有優(yōu)秀的引物自動(dòng)搜索功能，同時(shí)可進(jìn)行部分指標(biāo)的分析，而且容易 使用，是一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的軟件。 Oligo 6.22 使用技巧簡介 1. 功能 在專門的引物設(shè)計(jì)軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0 的初始界面是兩個(gè)圖：Tm 圖和G 圖；Oligo 6.22 的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了個(gè)Frq 圖?！癘ligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。 2. 使用（以O(shè)ligo 6.22 為例） Oligo 6.22 的啟動(dòng)界面如下： 圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為Tm、G 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，為鄰近6至7 個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili 方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo5.0，只是顯示更清楚了。 經(jīng)過Windows/Tili 項(xiàng)后的顯示如圖： 在設(shè)計(jì)時(shí)，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺得合適，可點(diǎn)擊Tm 圖塊上左下角的Upper 按鈕，選好上游引物，此時(shí)該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。G 值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的G 值在5端和中間值比較高，而在3端相對(duì)低（如圖：） Tm 值曲線以選取72附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq 曲線為“Oligo 6”新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3端Frq 值相對(duì)較低的片段。 當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)并根據(jù)評(píng)價(jià)對(duì)引物進(jìn)行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測(cè)（非克?。┬訮CR，對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來說，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5 為好。 當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR 引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低。這種PCR 需要通過靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC 含量，以45-55為宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC 含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果PCR 的模板不是基因組DNA，而是一個(gè)特定模板序列，那么最好還進(jìn)行False priming site 的檢測(cè)。這項(xiàng)檢查 可以看出引物在非目的位點(diǎn)引發(fā)PCR 反應(yīng)的可能性。如果引物在錯(cuò)配位點(diǎn)的引發(fā)效率比較高，就可能出假陽性的PCR 結(jié)果。一般在錯(cuò)配引發(fā)效率以不超過100 為好，但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450 以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130，那么這對(duì)引物也是可以接受的。當(dāng)我們結(jié)束以上四項(xiàng)檢測(cè)，按Alt+P 鍵彈出PCR 窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm 值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評(píng)價(jià)。 由于“Oligo”軟件的引物自動(dòng)搜索功能