（植物學(xué)專業(yè)論文）acds轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用.pdf

博士學(xué)位論文 ac s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 摘要 通過構(gòu)建三個雙元載體的質(zhì)粒p d s e p d s g 和p a c 和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t d n a 轉(zhuǎn)基因 發(fā)展了一個帶有基因捕獲器和增強(qiáng)子捕獲器的a c d s 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)作為插 入序列標(biāo)簽來研究水稻基因組 主要研究結(jié)果如下 1 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t d n a 轉(zhuǎn)基因 共獲得1 1 8 8 株獨(dú)立可育的轉(zhuǎn)基因水稻植 株 其中來自只本睛的轉(zhuǎn)基因水稻為5 2 6 株包括n a c 轉(zhuǎn)p a e 5 1 株 n e 轉(zhuǎn) p d s e 3 6 1 株 n o 轉(zhuǎn)p d s g 1 1 4 株 來自中花一1 1 號的轉(zhuǎn)基因水稻為6 6 2 株 包括c a c 轉(zhuǎn)p a c 1 7 6 株 c e 轉(zhuǎn)p d s e 3 2 0 株 c g 轉(zhuǎn)p d s g 1 6 6 株 潮霉素 抗性試驗(yàn)表明t d 1 q a 在水稻染色體中平均插入位點(diǎn)數(shù)為1 3 個 通過 s o u t h e r n 雜交分析 t d n a 在水稻基因組中的平均拷貝數(shù)為1 8 個 2 t d n a 插入到水稻基因區(qū)的g c 含量分布與插入到基因組d n a 的分布基 本一致 通過對1 2 6 個t d n a 插入位點(diǎn)兩側(cè)5 0 0 b p 水稻序列g(shù) c 含量分析 表明插入位點(diǎn)處水稻基因組d n a 平均g c 含量為4 2 5 8 3 的t d n a 插 入子落在水稻g c 含量為3 0 5 0 的基因組區(qū)域 有5 0 個t d n a 4 0 插入 到水稻的基因區(qū) 3 t d n a 在水稻基因組d n a 的插入 既有準(zhǔn)確的插入 又有不準(zhǔn)確的插入 在1 8 2 個t d n a 與水稻的結(jié)合序列析中 只有6 9 個序歹t j 3 8 中沒有 f i l l e r d n a 的存在 而存在f i l i e r d n a 的序列有1 1 3 個 占總數(shù)的6 2 長 度從l b p 到數(shù)百b p 不等 通過對6 1 個大于5 0 b p 的f i l l e r d n a 分析 發(fā)現(xiàn)來 自t d n a 內(nèi)部的d n a 序列是f i l l e r d n a 的主要來源 總共有4 9 個占總數(shù) 的8 0 有8 個 1 3 是來自于t d n a 以外的雙元載體主干序列 另有4 個 7 與水稻序列和載體序列都沒有同源性 在1 5 8 個右邊界旁鄰序列中有7 7 個保持了特征序列t g a 而左邊界序列的變化比較大 沒有發(fā)現(xiàn)在某一特定 核苷酸斷裂的現(xiàn)象 在t d n a 左邊界與水稻基因組d n a 直接相聯(lián)的序列中 發(fā)現(xiàn)有1 8 個堿基的同源序列存在 另外還發(fā)現(xiàn)有1 6 例t d n ar b l b 的直接串聯(lián) 4 d s 元件附近的基因組d n a 結(jié)構(gòu)對跳躍頻率有影響 p c r 分析表明 來自1 1 個d s 親本總共2 0 個f 2 群體其d s 跳躍頻率變化范圍為o 4 0 而親本眈 元件拷貝數(shù)對d s 的跳躍頻率影響不大 s o u t h e m 雜交結(jié)果表明 d s 在f 2 群體中的重新插入頻率和獨(dú)立插入頻率都保持在7 0 以上 有d s 插入但沒 有a c 元件而穩(wěn)定插入的f 2 植株頻率變化范圍在1 4 3 3 之問 5 d s 在水稻基因組d n a 中有插入到基因區(qū)的傾向 在2 9 個d s 插入位點(diǎn)旁鄰 v f 博士擘位論文 ac 9 s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻申的應(yīng)用 序列的分析中 有1 7 個 5 9 插入到了基因區(qū) 其中有6 個在啟動子區(qū)域 7 個在外顯子區(qū)域 有4 個在內(nèi)含子區(qū)域 另外還有1 0 個序列位于非基因區(qū) 域 瓜插入位點(diǎn)的兩側(cè)會形成8 b p 水稻堿基的正向重復(fù) 6 在d s 獨(dú)立插入的f 2 水稻植株的葉 根 化和種予中 增強(qiáng)子捕獲器的g u s 活性的檢出率為2 8 基因捕獲器的g u s 活性檢出率為2 2 關(guān)鍵詞 水稻 t d n a f i l i e r d n a a c d s 轉(zhuǎn)座子 基因捕獲器 增強(qiáng)子 捕獲器 v i i 博士學(xué)位論文 ac d s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 a b s t r a c t b yc o n s t r u c t i n gt h r e eb i n a r yv e c t o r s p d s e p d s ga n dp a c a n dt d n a t r a n s f o r m a t i o nm e d i a t e db y a g r o b a c t e r i u m w ed e v e l o p e da l l a c d ss y s t e mh a r b o r i n g g e n et r a pa n de n h a n c e rt r a pf o rg e n et a g g i n gi nr i c e t h ef o l l o w i n gr e s u l t sa r e o b t a i n e d 1 t h r o u g ha g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt d n at r a n s f o r m a t i o n 118 8i n d e p e n d e n t f e r t i l et r a n s g e n i cr i c el i n e sw e r ep r o d u c e d i nj a p o n i c an i p p o n b a r e 5 2 6l i n e s w e r eo b t a i n e di n c l u d i n g51n a cl i n e st r a n s f r o m e dw i t hp a c 3 6 1n el i n e s t r a n s f r o m e dw i t hp d s ea n d1 1 4n gl i n e st r a n s f r o m e dw i t hp d s g i n j a p o n i c a z h o n g h u a 11 6 6 2l i n e sw e r eo b t a i n e di n c l u d i n gt 7 6c a c l i n e st r a n s f o r m e dw i t h p a c 3 2 0c el i n e st r a n s f o r m e dw i t hp d s ea n d16 6c gl i n e st r a n s f o r m e d v i m p d s gh y g r o m y c i nr e s i s t a n c et e s t sr e v e a l e dt h a tt r a n s g e n i cp l a n t sc o n t a i na n a v e r a g eo f1 3l o c io f t d n a i n s e r t s s o u t h e r nb l o ta n a l y s i so f t r a n s g e n i cp l a n t s i n d i c a t e dt h a tt h e yc o n t a i na v e r a g e1 8t d n ac o p i e si nr i c eg e n o m e 2 t h ed i s t i l b u t i o no fg cc o n t e n to fr i c eg e n er e g i o ni n s e r t e db yt d n aw a sv e r y s i m i l a rw i t ht h a to ff l e eg e n o m ed n a t h r o u g hg cc o n t e n ta n a l y s i so f5 0 0 b p r i c eg e n o m i cd n a f l a n k i n gi n s e r t i o ns i t e i n1 2 6l i n e s w ef o u n dt h a tt h ea v e r a g e g cc o n t e n to ft h ei n s e r t i o ns i t ew a s4 2 5 a n d8 3 o ft h et d n ai n s e r t i o nl i n e s l o c a t ei nag e n o m i cd o m a i nr a n g i n gf r o m3 0 t o5 0 i nt e r m so fg cc o n t e n t f i f t y 4 0 o u to ft h et o t a l12 6t d n ai n s e r t i o nl i n e sw e r ei nt h eg e n er e g i o no f r i c e 3 b o t hp r e c i s ei n s e r t i o na n di m p r e c i s ei n s e r t i o ne x i s t e dw h e nt d n ai n t e g r a t e d i n t or i c eg e n o m i cd n a a m o n gt o t a l18 2t d n a r i c ed n a j u n c t i o n s o n l y6 9 3 8 w e r ef o u n dw i t hn of i l i e r d n a w h e r e a st h er e m a i n i n g1 13 6 2 c o n t a i n e df i l l e r d n af r o ml b pt os e v e r a lh u n d r e db a s ep a i r s b ya n a l y s i so f 6 1 f i l l e r d n al a r g e rt h a n5 0 b p w ef o u n dt h a t4 9 8 0 呦w e r ef r o mt h es e q u e n c e w i t h i nt d n a e i g h t 1 3 o ft h e mw e r ef r o mb a c k b o n es e q u e n c eo fb i n a r y v e c t o ro u to ft d n a i na d d i t i o n 4 7 h a dn os i m i l a r i t yw i t hr i c eo rv e c t o r s e q u e n c e s t h r e es i g n a t u r en u c l e o t i d e st g ao ff i g h tb o r d e rr e p e a tw e r ek e p ti n 7 7o u to f15 8t d n ai n s e r t i o n s n os p e c i f i cn u c l e o t i d ew h e r et h et d n al e f t b o r d e rb r o k e nw a sf o u n dw h e nt d n ai n t e g r a t e di n t o r i c eg e n o m i cd n a m i c r o h o m o l o g o u sf r a g m e n t sf r o mlt o8 b pw e r eo b s e r v e di nt h es e q u e n c e sn e x t v 博士學(xué)位論文 a a d s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 t ot h el e f tb o r d e ro ft d n ai n s e r t i o n s s i x t e e nd i r e c tl i g a t i o no ft d n a r i g h t b o r d e rt ol e f tb o r d e rw e r eo b s e r v e di no u re x p e r i m e n t s 4 t h es t r u c t u r eo fg e n o m i cd n aa ti n s e r t i o ns i t ea f f e c t e dd st r a n s p o s i t i o n f r e q u e n c yg r e a t l y d se x c i s i o nf r e q u e n c yv a r i e df r o m0 t o4 0 i n2 0f 2 p o p u l a t i o n sd e r i v e df r o m l1d i f f e r e n td sp a r e n t sw i t hp c ra n a l y s i s i tw a s f o u n dt h a td sc o p yn u m b e rh a dl i t t l ei n f l u e n c eo nd st r a n s p o s i t i o nf r e q u e n c y s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a tm o r et h a n7 0 o f d se l e m e n tr e i n s e a e di n t o r i c eg e n o m i cd n aa n dm o s to ft h e m 7 0 w e r ei n d e p e n d e n ti nf 2p o p u l a t i o n 1 4 3 3 o f d sr e i n s e r t i o nf 2p l a n t sw e r es t a b l ew i t h o u t a ce l e m e n t 5 d si si n c l i n e dt oi n t e g r a t ei n t og e n er e g i o no fr i c eg e n o m i cd n a s e v e n t e e no u t o ft o t a l2 9 5 9 f l a n k i n gs e q u e n c e so fd se l e m e n t sw e r ei d e n t i f i e dt ob ew i t h i n g e n er e g i o no fr i c eg e n o m i cd n a i n c l u d i n g6i np r o m o t e r 4i ne x o na n d7i n i n t r o n a n o t h e r1 0f l a n k i n gs e q u e n c e so f d se l e m e n t sw e r ep r o v e dt ob ew i t h i n i n t e r g e n i cr e g i o n s 8 b pd u p l i c a t i o no fr i c eg e n o m i cd n aa p p e a r e da ti n s e r t i o n s i t eo f d se l e m e n t 6 a m o n gt h ef 2p l a n t sw i t hi n d e p e n d e n td si n s e r t i o n s a p p r o x m a t e l y2 8 o f e n h a n c e rt r a pa n d2 2 o fg e n et r a pi n s e r t sd i s p l a y e dg u s a c t i v i t yi nl e a v e r o o t s f l o w e r sa n ds e e d s k e yw o r d s r i c e o r y z as a t i v al t d n a f i l l e r d n a a c d s t r a n s p o s o n g e n et r a p e n h a n c e rt r a p x 博士學(xué)位論文 ac b s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 致謝 本研究是在導(dǎo)師吳平教授悉心指導(dǎo)下完成的 研究傾注著導(dǎo)師無數(shù)的心血 在此謹(jǐn)向?qū)煴硎咀钫\摯的謝意 導(dǎo)師開闊的眼界 廣博的知識 敏銳的思維 嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的治學(xué)態(tài)度 對事業(yè)和人生信念的執(zhí)著追求 百折不撓永不停息的奮斗 精神時刻激勵著我 催我奮進(jìn) 將使我受益終生 在攻讀博士學(xué)位論文期間 承蒙傅承興老師 蔣德安老師 朱誠老師 易可 可老師 吳運(yùn)榮老師 姜華武博士 李靖老師 陳漢民老師 劉非燕老師的多方 幫助和指導(dǎo) 感謝中國水稻研究所的孫宗修老師 傅亞萍老師在轉(zhuǎn)基因技術(shù)上的 幫助和提供p d s b a r l 3 0 0 p u b i t s 載體 感謝農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)研究所的毛碧增 老師提供p c a m b i a l 3 0 0 載體 感謝傅向東博士提供p a h c 2 5 質(zhì)粒 感謝課題組 成員張帆 陳雙燕 汪明怡 周沽 汪少敏 徐敏 段瑞君同學(xué)的大力協(xié)助 感 謝侯興亮 劉洪家 佃蔚敏 吳忠長 毛傳藻 鄭炳松 楊玲 王首鋒 杜黎明 張麝龍 朱世華 黃幗 齊曉朋 王芳 樊葉楊等同學(xué)在平時學(xué)習(xí)和工作中給我 的幫助 感謝所有關(guān)心幫助過我的同學(xué)和朋友 在此我要特別感謝我的妻子葉紈芝對我的理解與支持 感謝我的父親 母親 岳父 岳母 哥哥 姐姐的關(guān)心與愛護(hù) 是他們使我能夠全身心地投入到學(xué)習(xí)和 研究當(dāng)中 會維正 2 0 0 3 年5 月于杭州華家池 v 博士學(xué)位論文 a c n s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 縮寫 a b r c a c d s a d a d h a l s a s b a c b p c o d a d n a e n i e s t g f p g u s h p t h y g l a a h i p c r l u c n a a n a m n o s n p t l i o s e x p p a c p e g p p t t a l l p c r t d n a t e t i t i r x g l u c y a c 縮略詞表 a b b r e v i a t i o n 英文 t h e a r a b i d o p s i sb i o l o g i c a lr c s o u r c ec e n t e r a c t i v a t o r d i s s o c i a t i o n a r b i t r a r yd e g e n e r a t ep r i m e r a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e a c e t o l a c t a t es y n t h a s e a c e t o s y r i n g o n e b a c t e d a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s b a s ep a i r c y t o s i n e d e a m i n a s e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e n h a n c e r ll n h i b i t o r e x p r e s s e ds e q u e n c et a g g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 8 一g l u c u r o n i d a s e h y g r o m y c i np h o s p h o t m n s f e r a s e h y g r o m y c i n i n d o l e a c e t a m i d eh y d r o l a s e l n v e r s ep c r l u c i f e r a s e n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d n a p h t h a l e n ea c e t a m i d e n o p a l i n es y n t h a s e n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e m s e e x p a n s i n p l d e r i v e da r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s p o l y e t h y l e n eg l y c o l p h o s p h i n o t h r i c i n t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r t r a n s f e r r e dd n a t r a n s p o s o ne l e m e n t t u m o 卜i n d u c i n g t e r m i n a li n v e r t e dr e p e a t 5 b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y l 1 3 dg l u c u r o n i d e y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s v 中文 擬南芥生物資源中心 激活子 分離子 隨機(jī)簡并引物 乙醇脫氫酶 乙酰乳酸合成酶 乙酰丁香酮 細(xì)菌人一l 染色體 堿基對 胞嘧啶脫胺酶 脫氧核糖核酸 增強(qiáng)子 抑制子 表達(dá)序列標(biāo)簽 綠色熒光蛋向 1 3 d 葡糖醛酸糖苷酶 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素 吲哚乙酰胺水解酶 反向p c r 熒光索酶 祭乙酸 荼乙胺 胭脂堿合成酶 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 水稻膨脹素 p 1 人l 染色體 聚乙二醇 草j 膦 熱不對稱交錯p c r 轉(zhuǎn)移d n a 轉(zhuǎn)座子元件 腫瘤誘導(dǎo) t i 質(zhì)粒 末端倒轉(zhuǎn)重復(fù) 5 溴 4 一氯 3 吲哚1 3 d 葡糖醛酸 酵母人i 染色體 博士學(xué)位論文 a c d s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 第一章文獻(xiàn)綜述 1t d n a 作為插入序列標(biāo)簽的研究進(jìn)展 1 1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t d n a 遺傳轉(zhuǎn)化 t d n a 作為轉(zhuǎn)基因載體用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化始于2 0 世紀(jì)八十年代 農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的t d n a 轉(zhuǎn)基因首先成功于雙子葉植物 隨著技術(shù)的進(jìn)步與突破 特別是 在單子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得突破成熟之后 利用t d n a 作為載體在單子葉植 物中的遺傳轉(zhuǎn)化也成為一種常規(guī)技術(shù) 因?yàn)檫@種方法簡便 成本低 穩(wěn)定性好而 受到廣泛的青睞 目前t d n a 用作外源目的基因?qū)胫参锏妮d體 已經(jīng)成為植 物遺傳育種 品種改良的一種有效先進(jìn)的工具 因?yàn)閠 d n a 在轉(zhuǎn)基因植物基因組中比較隨機(jī)的分靠 所以無論是在雙予葉 還是單子葉植物中都已經(jīng)被用作研究植物本身基因功能一種很好的插入序列標(biāo) 簽 大大加快了植物基因功能的研究 1 1 1t d n a 的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用 s m i t h 年l t o w n s e n d 發(fā)現(xiàn)植物冠嬰瘤病 c r o w ng a l ld i s e a s e 是農(nóng)桿菌引發(fā)的 之 后對農(nóng)桿菌的研究就廣泛的丌展起來了 冠嬰瘤病曾在法國 東歐和澳大利亞的 葡萄樹 核果樹和堅果樹上有大面積的發(fā)生 造成很大的危害 w h i t e 年u b r a u n 發(fā)現(xiàn)冠嬰瘤組織能在 f 常細(xì)胞不能生長的無激素培養(yǎng)基上無限制生長并且不需 要細(xì)菌的存在 l i n k 和e g g e r s 發(fā)現(xiàn)冠嬰瘤組織能產(chǎn)生生長素 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素在 冠嬰瘤組織中大量存在 b r a u n 提出 腫瘤誘導(dǎo)因子 t u m o r i n d u c i n gp r i n c i p l e 假說 盡管這一假說對這一因子的本質(zhì)不清楚 但推測染色體外存在一種遺傳物 質(zhì)d n a 能使處于靜止?fàn)顟B(tài)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉至鸦钴S的細(xì)胞 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn) s c h i l p e r o o r t 等發(fā)現(xiàn)無菌培養(yǎng)的冠嬰瘤含有細(xì)菌 來源的d n a 盡管在當(dāng)時這一結(jié)論是有爭議的 但至l j 7 0 年代 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)用高 溫培養(yǎng)的方法可以使農(nóng)桿菌失去致瘤能力 并分離鑒定出一種與致瘤能力完全相 關(guān)的t i 質(zhì)粒 t u m o r i n d u c i n gp l a s m i d v a nl a r e b e k e 等1 9 7 4 v a nl a r e b e k e 等1 9 7 5 z a e n e n 等1 9 7 4 這使得研究的范圍縮小到t i 質(zhì)粒上 最終通過s o u t h e r n 雜交的方 式確定了轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的只是t i 質(zhì)粒的一部分即t d n a t r a n s f e r r e dd n a c h i l t o n 等1 9 7 7 c h i l t o n 等1 9 7 8 d e p i c k e r 等1 9 7 8 以上內(nèi)容摘自z u p a n 等 2 0 0 0 的綜述 博士學(xué)位論文 ac s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) t d n a 兩端左右邊界為2 5 b p 的j 下向重復(fù)序列 即邊界序列 b o r d e rs e q u e n c e 分別稱之為左邊界o e f fb o r d e r l b 年u 右邊界 r i g h tb o r d e r r b 邊晃序列為保守序列 5 t g a c a c g a t a l a t t g g c g g g t a a a c 3 在t d n a 右邊界外還有一個2 4 b p 的超級驅(qū)動序列 o v e r d r i v es e q u e n c e t a a c t c g c t g t g t a t g t t t g t t t g 對t d n a 的轉(zhuǎn)移起增強(qiáng)子的作用 見王關(guān) 林1 9 9 8 p 1 4 0 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t d n a 轉(zhuǎn)基因成功報道于1 9 8 3 年 m u r a i 等將種子貯藏蛋 白基因成功轉(zhuǎn)到向同葵和煙草并得到表達(dá) 之后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t d n a 轉(zhuǎn)基因 在雙子葉植物中就成為了一種常規(guī)方法 1 1 2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t d n a 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在單子葉植物中的研究進(jìn)展 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t d n a 轉(zhuǎn)基因在單子葉植物上取得突破之前 主要采用直接 轉(zhuǎn)化法 直接轉(zhuǎn)化法就是通過處理的裸露d n a 直接導(dǎo)入植物細(xì)胞 實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn) 化的一種技術(shù) 按技術(shù)原理來分 轉(zhuǎn)基因技術(shù)通?？煞譃槲锢矸ê突瘜W(xué)法兩種 化學(xué)法又可分為聚乙二醇 p e g 介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法 脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法 物理 法又可分為電激法 e l e c t r o p o r a t i o n 介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法 超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法 顯 微注射 m i c r o i n j e c t i o n 介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法 激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法 基因槍轟擊 m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e m 基因轉(zhuǎn)化法 另外還有萌發(fā)種子電泳法 花粉管通 道法 種子浸泡法等 其中z h a n g 和w u 1 9 8 8 首先報道了采用p e g 介導(dǎo)法得到第一例轉(zhuǎn)基因水稻 植株 t o r i y a m a 等 1 9 8 8 和z h a n g 等 1 9 9 8 炳個研究小組分別報道了水稻原生質(zhì) 體電激法得到的轉(zhuǎn)基因水稻植株 但是兩者都需要原生質(zhì)體的培養(yǎng) 原生質(zhì)體的 培養(yǎng)本身就是一個復(fù)雜而且困難的方法 而且原生質(zhì)體的再生頻率也不高 因此 這兩種方法在應(yīng)用上都受到一定的限制 基因槍法由于對轉(zhuǎn)化受體的要求不高 而且轉(zhuǎn)化的效率商 兇此方法一經(jīng)出現(xiàn) 就受到廣泛的應(yīng)j j 并先后剛這一方法 在大豆 w a n g 等1 9 9 8 玉米 g o r d o n k a m m 等1 9 9 0 水稻 c h r i s t o u 等1 9 9 1 朱 冰等1 9 9 6 小麥 v a s i l 等1 9 9 2 黑麥 s o m e r s 等1 9 9 2 等農(nóng)作物上獲得了轉(zhuǎn)基因 植株 農(nóng)桿菌介導(dǎo)t d n a 在單子葉植物中的轉(zhuǎn)基因在2 0 世紀(jì)9 0 年代取得突破 c h a n 等 1 9 9 2 1 9 9 3 用水稻幼胚為材料獲得一些轉(zhuǎn)基因水稻植株 并對一株水稻 進(jìn)行了遺傳分析 s o u t h e r n 雜交證明轉(zhuǎn)基因t d n a 能夠遺傳到后代中 h i e i 等 1 9 9 4 在水稻中的轉(zhuǎn)基因工作則以無可辯駁的證據(jù)表明農(nóng)桿菌不但可以轉(zhuǎn)化單 子葉植物而且還可以和雙子葉植物一樣有效 他們采用水稻成熟胚的盾片愈傷組 織 用乙酰丁香酮 a c e t o s y r i n g o n e a s 誘導(dǎo)農(nóng)桿菌 l b a 4 4 0 4 e h a l 0 1 f l 盛染愈傷 2 博士學(xué)位論文 ac n s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 組織 使轉(zhuǎn)化頻率大大提高 并獲得了大量的轉(zhuǎn)基因水稻植株 他們對眾多轉(zhuǎn)基 因水稻植物進(jìn)行了詳細(xì)的遺傳分析 還有就是獲得了充分的分子證據(jù) 包括 s o u t h e r n 雜交和t d n a 邊界序列信息的獲得 之后 d o n g 等 1 9 9 6 在爪哇稻中 轉(zhuǎn)化成功 a l d e m i t a 等 1 9 9 6 轉(zhuǎn)化秈稻也獲得了成功 r a s h i d 等 1 9 9 6 在秈稻中 轉(zhuǎn)化取得了同粳稻中一樣高的轉(zhuǎn)化效率 這些工作表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t d n a 轉(zhuǎn) 基因在單子葉植物中已經(jīng)完全的確立起來了 1 2t d n a 在植物基因組d n a 中整合的機(jī)制 t d n a 整合到植物基因組中具體機(jī)制至今不清 t d n a 在植物中的插入被 認(rèn)為是隨機(jī)的 它可以插入到任何一條植物染色體 但是插入位點(diǎn)通常具有以下 特點(diǎn) t d n a 優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點(diǎn) t d n a 偏愛插入到a t 豐富區(qū) 植物d n a 的靶位點(diǎn)與t d n a 有小的同源性 m i c r o h o m o l o g y b r u n a u d 等2 0 0 2 m a y e r h o f e r 等1 9 9 1 t i n l a n d1 9 9 6 s z a b a d o s 等2 0 0 2 目前 主要有 以下幾種關(guān)于t d n a 整合到植物基因組d n a 中的模型 1 2 1 雙鏈斷裂修復(fù)模型 雙鏈斷裂修復(fù)模型首先是植物靶d n a 產(chǎn)生雙鏈斷裂 解旋的靶d n a 與雙 鏈t d n a 退火 單鏈部分被3 一5 外切酶或修復(fù)系統(tǒng)中單鏈特異的核酸內(nèi)切酶 去除 然后進(jìn)行修復(fù)連接 并由此導(dǎo)致了d n a 的整合和缺失 靶d n a 和t d n a 缺失程度由靶d n a 與t d n a 退火時形成的短的d n a 互補(bǔ)順序的位置所決定 m a y e r h o f e r 等1 9 9 1 1 2 2 單鏈缺口修復(fù)模型 單鏈缺口修復(fù)模型是在靶d n a 上形成一個缺刻 然后由于部分解旋或 5 一3 外切酶消化形成缺口 單鏈t d n a 靠近缺口 出于兩鏈存在短的d n a 互 補(bǔ)順序 于是退火形成異質(zhì)雙鏈 未配對的3 和5 單鏈部分被除去 t d n a 末 端與靶d n a 連接 在靶d n a 鏈的互補(bǔ)鏈產(chǎn)生缺刻 以游離的3 d n a 末端為引 物修復(fù)合成第二條t d n a 鏈 m a y e r h o f e r 等1 9 9 1 1 2 3t d n a 串聯(lián)重復(fù)的形成 t d n a 整合到植物基因組中不單單以單個t d n a 的形式 在很多情況下是 以兩個或兩個以上的t d n a 串聯(lián)形式整合到基因組d n a 中的 串聯(lián)的形式有 r b r b r b l b 及l(fā) b l b 等種類 b u c k 等 1 9 9 9 認(rèn)為這種t d n a 的串聯(lián)是在 t d n a 整合到植物基因組d n a 之前形成的 他們的理由是因?yàn)樵诖?lián)的t d n a 博士學(xué)位論文 ac d s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 交接處沒有發(fā)現(xiàn)有植物基因組d n a 的存在 更為復(fù)雜的是多個t d n a 的串聯(lián)插入 k r i z k o v a 和h r o u d a 1 9 9 8 發(fā)現(xiàn)在兩 個相對完整t d n a 串聯(lián)重復(fù)的交接還有t d n a 的成份存在 他們認(rèn)為這種整合 方式可能是t d n a 整合時發(fā)生的 首先由一條t d n a 與植物染色體d n a 通過 幾個互補(bǔ)堿叢配剝結(jié)合 然后另外防條t d n a 鏈通過幾個堿基的互補(bǔ)配對分別 與第一條t d n a 的3 和5 端結(jié)合 游離出的t d n a 單鏈分別與染色體d n a 3 端和5 端結(jié)合 通過對游離的t o d n a 降解及以t d n a 為模板的d n a 合成而使 多個t d n a 整合到植物基因組中 1 3t d n a 作為插入序列標(biāo)簽在植物功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用 1 3 1t d n a 在雙予葉植物功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用 t d n a 作為插入序列標(biāo)簽在雙子葉植物中的應(yīng)用主要以在擬南芥中為例 擬南芥植株小 種子小而多 一株植株能產(chǎn)生大約1 0 0 0 0 粒種子 生長周期短 基因組小而成為雙子葉植物的模式植物 刪a 插入突變體在擬南芥中早在2 0 世紀(jì)9 0 年代初就受到關(guān)注 并7 r 始 建立大規(guī)模的插入突變體庫 f e l d m a n n l 9 9 1 f o r t s t h o e f e l 等1 9 9 2 k o n c z 等1 9 9 2 為了全世界科研人員研究的方便 早在1 9 9 1 年9 月在美國俄亥俄州立人學(xué)就建 立了擬南生物資源中心a b r c t h ea r a b i d o p s i sb i o l o g i c a lr e s o u r c ec e n t e r 以收 集 保存 分發(fā)各種突變體 現(xiàn)在a b r c 已經(jīng)建立了一個龐大的擬南芥插入突 變體庫 包括很大一部分來源于t d n a 插入突變體 并且還在以每年數(shù)萬的數(shù) 量在增長 通過擬南芥的網(wǎng)站h t t p w w w a r a b i d o p s i s o r g 可獲得擬南芥t d n a 插入突變體 在擬南芥中 已經(jīng)有大量的基因功能以t d n a 為插入序列標(biāo)簽得 到研究 1 3 2t d n a 在單子葉植物功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用 t d n a 作為插入序列標(biāo)簽在單子葉植物功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用比雙子 葉植物中的研究要遲得多 水稻作為單子葉植物是禾本科的模式植物 其大規(guī)模 的插入突變體庫見于2 0 0 0 年j e o n 和j e o n g 等在2 0 0 3 年的報道 在我國也有多 家單位正在丌展建立大規(guī)模的插入突變體庫 朱j f 歌等2 0 0 1 但是至今沒有 報道利用t d n a 作為插入序列標(biāo)簽在水稻中克隆新的基因 不過相信在廣大科 研工作者的努力下 必定能很好的利用t d n a 這一工具來研究水稻的基因功能 博士學(xué)位論文 a c d s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 2a c d s 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)作為插入序列標(biāo)簽的研究進(jìn)展 2 1a c d s 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的研究歷史 轉(zhuǎn)座子元件t e t r a n s p o s o ne l e m e n t 首先是由b a r b a r am e c l i m o c k 在2 0 世紀(jì) 三 四十年代研究玉米籽粒顏色變化時發(fā)現(xiàn)的 但一直沒有受到人們的重視 直 到六 七十年代在大腸桿菌g a l 和l a c 操縱子發(fā)現(xiàn)了可以轉(zhuǎn)移的插入序y l j i n s e r t i o n s e q u e n c e m c c l i n t o c k 的轉(zhuǎn)座子理論才被人們所重新認(rèn)識和接受 轉(zhuǎn)座子在d n a 結(jié)構(gòu)上具有一些共同的特點(diǎn) 一 在轉(zhuǎn)座子的兩端 存在術(shù) 端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列 t e r m i n a li n v e r t e dr e p e a t t i r 它們是轉(zhuǎn)座發(fā)生所必需的結(jié)構(gòu) 而且至關(guān)重要 二 轉(zhuǎn)座子編碼轉(zhuǎn)座酶 t r a n s p o s a s e 其功能是促進(jìn)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座 發(fā)生 三 受體d n a 上很短的一段靶序列 由于轉(zhuǎn)座子的插入 會在轉(zhuǎn)座子的 兩側(cè)形成正向重復(fù)序列 靶序列的正向重復(fù)序列長短由轉(zhuǎn)座子決定 每一類轉(zhuǎn)座 子造成的正向序列重復(fù)其堿基數(shù)目是確定的 玉米中的a c d s 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng) a c t i v a t o r d i s s o c i a t i o n 是研究的比較多的一個系 統(tǒng) 其中a c 是自主性 a u t o n o m o u s 成分 d s 是非自主性 n o n a u t o n o m o u s 成分 爿c 全長4 5 6 5 b p 具有l(wèi) l b p 的木端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列t c a g g g t g a a a 自主 性爿c 元件還編碼一個的轉(zhuǎn)座酶基因 a ct r a n s p o s a s e 具有完整結(jié)構(gòu)的爿c 元件能 夠發(fā)生自主性轉(zhuǎn)座 d s 在結(jié)構(gòu)上缺乏編碼完整轉(zhuǎn)座酶基因的d n a 序列 但是保 留了j e 它血i 未端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列發(fā)生轉(zhuǎn)座作用所必須的結(jié)構(gòu) 岡此d s 不能發(fā)小門 主性的轉(zhuǎn)座 但是在a c 提供轉(zhuǎn)座酶的情況下州樣能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座 a c d s 轉(zhuǎn)座 f 在玉米 擬南芥和水稻基因組中插入位點(diǎn)處能形成8 b p 的正向重復(fù)序列 當(dāng)彳c 或肪從插入位點(diǎn)割離 e x c i s i o n 割離的發(fā)生有可能是精確地發(fā)生在轉(zhuǎn)座子術(shù)端倒 轉(zhuǎn)重復(fù)序列兩側(cè) 也有可能是不精確的割離 通常會使原來的8 b p 重復(fù)序列的一 側(cè)或兩側(cè)缺少幾個堿基 這樣果會留下a c d s 曾經(jīng)在此插入過的足跡 f o o t p r i n t 在玉米中 還存在有其它的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)如e n l 系統(tǒng) e n h a n c e r i n h i b i t o r p e t e r s o n1 9 5 3 叉稱為s p r r d d s p m 系統(tǒng) s u p p r e s s o r m u t a t o r m c c l i n t o c k1 9 5 4 自主性e r d s p m 元件長8 3 k b 編碼兩個基因t n p a 和t n p d 它們是轉(zhuǎn)座所必需 的 非自主性i d s p m 元件通常是有缺陷的e n s p m 元件 無法自身進(jìn)行轉(zhuǎn)座 這 一轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的t i r 為1 3 b p 插入靶位點(diǎn)形成3 b p 的正向重復(fù)序列 與a c d s 一樣 不精確的割離會留下足跡 p e r e i r a 等1 9 8 5 利用a c d s 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)克隆的第一個基因是玉米的b r o n z e 基因 a c d s 作為 外源轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也已經(jīng)成功的應(yīng)用在矮牽牛 擬南芥 番茄 煙草等植物基因的 克隆中 a a r t s 等1 9 9 3 c h u c k 等1 9 9 3 j o n e s 等1 9 9 4 w h i t h a m 等1 9 9 4 特 博士學(xué)位論文 a c d s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 別是在擬南芥中許多具有重要功能的基因都是以a c d s 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)作為序列標(biāo) 簽進(jìn)行克隆的 2 2a c i d s 轉(zhuǎn)座了霸i 突變體庫構(gòu)矬 1 1 的成川 a c d s 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在突變體構(gòu)建中的應(yīng)用形式可以有多種多樣 按a c 與d s 是否構(gòu)建在一起 能否自主性發(fā)生轉(zhuǎn)座 一般分成二元系統(tǒng)與一元系統(tǒng) 下面就 以這兩種系統(tǒng)來說明a c d s 在突變體庫構(gòu)建中的應(yīng)用 2 2 1 二元系統(tǒng) 二元系統(tǒng)是將a c 與d s 分開構(gòu)建到雙元載體t d n a 中 自主性的a c 元件 可以通過基因工程技術(shù)將轉(zhuǎn)座發(fā)生所必須的5 和3 末端切除 因此不會發(fā)生轉(zhuǎn) 座 而只提供完整的轉(zhuǎn)座酶基因 d s 元件含有轉(zhuǎn)座發(fā)生所必須的t i r 結(jié)構(gòu) 而 不含有轉(zhuǎn)座酶基因 d s 元件的內(nèi)部則可以做各種修飾 如加報告基因 抗生素 基因 除草劑基因等 在制作突變體庫的時候 首先是獲得a c t d n a 和d s t d n a 的轉(zhuǎn)基因親本 植株 然后通過雜交的方式產(chǎn)生大量的f 1 種子 f l 自交產(chǎn)生f 2 在f 2 代中對跳 躍的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行選擇 出于a c 轉(zhuǎn)座酶的存在 d s 就不會穩(wěn)定 為了獲得穩(wěn)定的 d s 插入子 可以通過遺傳分離的方法選擇不帶a c 的d s 插入植株 二元系統(tǒng)另一個優(yōu)點(diǎn)是可以在雜交自i 選擇a c 與c b 起始植株的拷貝數(shù) 并 且通過雜交獲得大量的轉(zhuǎn)座頻率穩(wěn)定的同一f 1 種子 這樣通過少數(shù)幾個起始轉(zhuǎn) 基因植株就可以獲得大量的 b 插入突變體 s u n d a r e s a n 等1 9 9 5 i z a w a 等n 9 9 7 首先利用二元系統(tǒng)來創(chuàng)建水稻突變體 n a k a g a w a 2 0 0 0 等對雙元系統(tǒng)在水稻 中的跳躍規(guī)律作了比較仔細(xì)的分析 2 2 2 一元系統(tǒng) 一元系統(tǒng)是將a c 轉(zhuǎn)座酶基因與d s 轉(zhuǎn)座子元件構(gòu)建在同一個載體中 無須 通過如二元系統(tǒng)雜交的步驟 方便之處就是可以在轉(zhuǎn)基因植物t l 代中可以分離 篩選到d s 跳躍的植株 一元系統(tǒng)又可以分為a c 自主轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與a c d s t d n a 系統(tǒng) a c d s t d n a 系統(tǒng)是將a c 轉(zhuǎn)座酶基因置于d s 轉(zhuǎn)座元件的外部 當(dāng)d s 跳到另一位置時 可以 獲得與a c 轉(zhuǎn)座酶分離而穩(wěn)定的d s 插入子 這一點(diǎn)與二元系統(tǒng)相類似 a c 自主轉(zhuǎn)座系統(tǒng)是利用4 c 元件的自主轉(zhuǎn)座特性 含有完整的轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn) 座酶基因 轉(zhuǎn)座酶基因置于轉(zhuǎn)座子的內(nèi)部 它的特點(diǎn)是在后代可以進(jìn)行連續(xù)的 跳躍而不能得到穩(wěn)定的突變體 e n o k i 等 1 9 9 9 利用自主性轉(zhuǎn)座子爿c 在水稻 6 博士學(xué)位論文 ac d s 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在水稻中的應(yīng)用 中做了詳細(xì)的分析 他們認(rèn)為爿c 自主轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以應(yīng)用于水稻功能基因組學(xué)的 研究當(dāng)中 2 3a c d s 轉(zhuǎn)座子割離 插入的檢測方法 a c d s 轉(zhuǎn)座子在植物基因組發(fā)生的跳躍 既可以發(fā)生在體細(xì)胞中 這樣的跳 躍稱之為體細(xì)胞跳躍 s o m a t i