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吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 提 要 A e r o p y r u m p e r n i x K1 是 1 9 9 3 年從日本海岸火山口分離的一 種超嗜熱古細(xì)菌 它最適生長(zhǎng)溫度為 9 5 并能產(chǎn)生多種嗜熱酶 近年來(lái) 隨著嗜熱酶相繼得到開(kāi)發(fā) 使其在許多領(lǐng)域發(fā)揮了重要作 用 嗜熱酶不僅具有化學(xué)催化劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn) 而且穩(wěn)定性極好 可以克服中溫酶及低溫酶在應(yīng)用中常常出現(xiàn)的生物學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定 的現(xiàn)象 從而可用于催化很多高溫化學(xué)反應(yīng) 這將極大地促進(jìn)生物 技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 從而帶動(dòng)技術(shù)水平和生活質(zhì)量的提高 目前 超 嗜熱古細(xì)菌嗜熱酶的研究還處于初期階段 其中既具有磷脂酶 A2 活力又具有酯酶活力的嗜熱酶 A P E 2 3 2 5 的研究具有重要意義 磷脂酶 A2 p h o s p h o l i p a s e A2 E C 3 1 1 4 簡(jiǎn)稱(chēng) P L A2 具有 很多生物學(xué)功能 參與許多生理活動(dòng) 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)它還具有廣泛的 心血管藥理效應(yīng) 從而引起人們新的研究興趣 正是 P L A2這種相對(duì) 簡(jiǎn)單的化學(xué)結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的藥理生理功能之間的反差 使之成為研究 脂質(zhì)代謝 脂蛋白代謝 生物膜磷脂結(jié)構(gòu)以及脂 蛋白相互作用的 結(jié)構(gòu)和功能的重要工具酶 近年來(lái) 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā) 展 國(guó)外對(duì)酯酶基因的克隆研究很活躍 促進(jìn)了酯酶的生物特性及 相關(guān)功能的研究 而國(guó)內(nèi)這方面的研究則起步較晚 基于古細(xì)菌的進(jìn)化位置和嗜熱磷脂酶 A2和酯酶的重要作用 我 們開(kāi)展了對(duì)嗜熱酶 A P E 2 3 2 5 的性質(zhì) 結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究 第一章 前言 1 古細(xì)菌 1 9 7 7年 W o e s e等人根據(jù) 2 0 0多種細(xì)菌和真核生物的核糖體小 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 達(dá) 這樣就能在溫和的培養(yǎng)條件下得到大量的嗜熱酶 目前 一些 從嗜熱菌中獲得的基因已在大腸桿菌等中溫宿主中得到了成功地 表達(dá) 7 9 隨著 D N A 測(cè)序技術(shù)的提高 許多嗜熱菌的基因組已經(jīng)被解析 通過(guò)與中溫菌的已知基因序列對(duì)比 已推測(cè)得到許多酶蛋白基因序 列 但酶的特性還需要在基因表達(dá)后得到進(jìn)一步的表征 在古核菌 基因組中 還有大約 4 0 的未知功能基因 對(duì)這些基因所表征蛋白 的研究和開(kāi)發(fā) 將為工業(yè)過(guò)程提供新的豐富的酶資源 1 0 1 2 利用嗜熱酶作為生物催化劑有如下的優(yōu)點(diǎn) 1 備成本低 因?yàn)槭葻崦傅姆€(wěn)定性高 所以可以在室溫下分 離提純和包裝運(yùn)輸 并且能長(zhǎng)久地保持活性 2 加快了動(dòng)力學(xué)反應(yīng) 隨著反應(yīng)溫度的提高 分子運(yùn)動(dòng)速度 加快 酶催化能力加強(qiáng) 3 對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)低 因而減少了能量消耗 由于嗜熱酶有耐高溫的特性 所以生產(chǎn)中不需要復(fù)雜的冷卻裝置 一方面節(jié)省了開(kāi)支 另一方面也降低了冷卻過(guò)程對(duì)環(huán)境所造成的污 染 4 提高了產(chǎn)物的純度 在嗜熱酶催化反應(yīng)條件下 超過(guò) 7 0 很少有雜菌生存 從而減少了細(xì)菌代謝物對(duì)產(chǎn)物的污染 由于嗜熱酶的高溫反應(yīng)活性 以及對(duì)有機(jī)溶劑 去污劑和變性劑的 較強(qiáng)抗性 使它在食品 醫(yī)藥 制革 石油開(kāi)采及廢物處理等方面 都有廣泛的應(yīng)用潛力 3 酯酶簡(jiǎn)介 酯酶 E s t e r a s e s E C 3 1 1 1 是一類(lèi)廣泛分布于組織與器官 的絲氨酸水解酶類(lèi) 能水解許多含有羧酯鍵 硫酯鍵 酰胺鍵的內(nèi) 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 源性及外源性物質(zhì) 其主要功能是參與脂質(zhì)代謝 信號(hào)傳導(dǎo)及維持 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 脂酶 A2 一種是鈣離子不依賴(lài)性磷脂酶 A2 i P L A2 2 0 按照 i P L A2 的生化特性可將其分為三類(lèi) 溶酶體性或酸性 i P L A2 刷狀緣膜性 i P L A2 細(xì)胞內(nèi) i P L A2 1 5 2 1 2 5 i P L A2主要存在于腦 肺 心和肝組織 以及巨噬細(xì)胞中 只有少數(shù)幾種 i P L A2已被純化出來(lái) 但都還未完 成氨基酸序列分析 鈣離子依賴(lài)型磷脂酶 A2根據(jù)分子量和細(xì)胞分布 又分為兩類(lèi) 一類(lèi)是低分子量 1 0 1 4 k D a 的分泌型磷脂酶 A2 s P L A2 一類(lèi)是與結(jié)構(gòu)有關(guān)的高分子量 8 5 k D a 的細(xì)胞內(nèi)型磷脂 酶 A2 c P L A2 2 6 來(lái)自細(xì)胞液和血小板的 s P L A2涉及到炎癥反應(yīng)的 發(fā)病機(jī)制 最近研究表明 s P L A2在炎癥過(guò)程中有雙重作用 1 與磷脂酶有關(guān)的防護(hù) 消化功能 需要鈣離子 主要作用于原核細(xì) 胞 2 通過(guò)結(jié)合原生質(zhì)膜受體的細(xì)胞信號(hào)功能 主要作用于真核 細(xì)胞 2 7 2 8 而 c P L A2主要在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用 2 9 3 1 鈣離子依 賴(lài)型多數(shù)存在于胰腺和蜂毒液以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑液或一些細(xì) 胞株中 而且具有特異的酶催化活性 而 i P L A在組織中的含量極 低 酶活性也缺乏特異性 3 2 目前 國(guó)內(nèi) P L A2的研究絕大部分是蛇 P L A2的研究 而且這些 酶大多數(shù)屬于中溫酶 3 3 4 0 國(guó)外 蛇毒 P L A2的克隆與表達(dá) 晶體結(jié) 構(gòu)模擬等都已有詳細(xì)報(bào)道 蜂毒 P L A2的 D N A 重組及結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了初 步研究 4 1 4 5 隨著越來(lái)越多地 s P L A2類(lèi)型被發(fā)現(xiàn) 研究者已經(jīng)進(jìn)行 了 s P L A2的受體研究 以及不僅僅只限于催化功能研究 4 6 隨著克 隆和酶系性質(zhì)的研究 開(kāi)始對(duì) c P L A2進(jìn)行功能性研究 如 c P L A2選 擇性地從天然膜中釋放花生四烯酸 與激素偶聯(lián)等作用 對(duì) i P L A2 已進(jìn)行氨基酸序列分析和調(diào)控機(jī)制的研究 而嗜熱 P L A2 特別是古 細(xì)菌嗜熱 P L A2的研究還處于初始階段 到現(xiàn)在為止 只在 P y r o c o c c u s h o r i k o s h i i 中發(fā)現(xiàn)了嗜熱 P L A2的活力 4 7 但是由于其 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性 還沒(méi)有成功地構(gòu)建表達(dá)嗜熱 P L A2的工程菌 基 于古細(xì)菌的進(jìn)化位置和嗜熱 P L A2的重要作用 使研究人員對(duì)嗜熱 P L A2格外關(guān)注 5 嗜熱 P L A2的應(yīng)用前景 P L A2是一種水解天然脂類(lèi)的水解酶 它所產(chǎn)生的兩種產(chǎn)物都是 高強(qiáng)度的膜活性因子 他們相互作用于雙分子脂膜結(jié)構(gòu) 使紅血球 膜破裂 紅細(xì)胞溶解 析出血紅蛋白 產(chǎn)生溶血效應(yīng) 所以 P L A2 被稱(chēng)為間接溶血毒 而且 P L A2具有其他重要的生理意義 如作為神 經(jīng)毒素 肌肉毒素和心臟毒素 與炎癥有關(guān) 對(duì) M A P K 有絲分裂 原激活的蛋白激酶 的活化作用 抗微生物活性 在組織損傷時(shí)出 現(xiàn) 脫粒作用 與細(xì)胞有絲分裂有關(guān) 4 8 4 9 所以它在醫(yī)藥 化工 農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景 1 脫膠工序上的應(yīng)用 在油脂深加工中 一道重要的工序就是脫膠 脫膠工序的目的 是除去毛油中的膠體雜質(zhì) 提高油脂質(zhì)量 為后道加工工序打好基 礎(chǔ) 隨著物理精煉技術(shù)的推廣應(yīng)用 脫膠技術(shù)顯得尤其重要 可以 說(shuō) 脫膠效果的好壞直接影響蒸餾脫酸的產(chǎn)品質(zhì)量 膠質(zhì)中最主要 的是磷脂 其中又分為可水化磷脂和非水化磷脂 可水化磷脂是比 較容易除掉的 而非水化磷脂用直接水化法難以除去 新脫膠法都 是針對(duì)這一點(diǎn) 用各種方式解決這一難題 目前 我國(guó)所生產(chǎn)的高烹油或色拉油 其主要處理步驟為脫膠 脫酸 脫色和脫臭 當(dāng)采用傳統(tǒng)的方法生產(chǎn)食用油時(shí)如用堿煉的方 法脫酸 膠質(zhì)很容易形成穩(wěn)定的乳化泡狀物 結(jié)果造成不必要的浪 費(fèi) 在植物油中所存在的膠質(zhì)主要由磷脂組成 磷脂的含量和其他 組成由植物油的種類(lèi)和萃取條件所決定 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 第二章 A P E 2 3 2 5的工程菌構(gòu)建和表達(dá) 一 材料和方法 1 主要儀器 1 H Z Q X 振蕩培養(yǎng)箱 黑龍江省東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司 2 J 2 2 1 M 高速冷凍離心機(jī) 美國(guó) B a c k m a n 公司 3 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 1 4 4 2 M U L T I W A V E L E I V G T H F L U O R O I M A G E R W A L L A C A R T H U R 公司 4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)器 B i o m e t r a 公司 5 無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠 6 D Y Y 2 型穩(wěn)壓溫流電泳儀 北京市六一儀器廠 2 主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶 T4 D N A 連接酶 T a q D N A 聚合酶和 D N A 分子質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)等購(gòu)于 T a K a R a B i o T E C H C o L t d 寶泰克生物科技公司 凝膠回收試劑盒 質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于 Q I A G E N 公司 P C R 引物合成和 D N A 測(cè)序由北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心完成 其他藥品和試劑均為分析純 3 試劑配制 T E 緩沖液 p H 8 0 含 1 m m o l L E D T A p H 8 0 的 1 0 m m o l L T r i s C l p H 8 0 緩沖液 S T E緩沖液 含 1 m m o l L E D T A p H 8 0 和 0 1 m o l L N a C l的 1 0 m m o l L T r i s C l p H 8 0 緩沖液 T A E 緩沖液 0 0 4 m o l L T r i s 乙酸 0 0 0 1 m o l L E D T A 用于制備質(zhì)粒的堿裂解緩沖液 溶液 5 0 m m o l L 葡萄糖 2 5 m m o l L T r i s C l p H 8 0 1 0 m m o l L E D T A 在 6 8 9 5 1 0 4 P a 高壓下蒸氣滅菌 1 5 分鐘后 保存于 4 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 溶液 0 2 m o l L N a O H 從 2 m o l L 貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)稀釋 1 S D S 從 1 0 的貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)稀釋 溶液 5 m o l L 乙酸鉀 6 0 m l 冰乙酸 1 1 5 m l 水 2 8 5 m l 所配 溶液中鉀的濃度為 3 m o l L 乙酸根的濃度為 5 m o l L 4 培養(yǎng)基成分 1 2 Y T 液體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 6 酵母抽提液 1 N a C l 0 5 1 N N a O H調(diào)節(jié) p H值至 7 0 1 5 l b f i n 2 1 0 3 4 1 0 5 P a 滅菌 2 0 分鐘 2 2 Y T 固體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 6 酵母抽提液 1 N a C l 0 5 瓊脂粉 2 1 N N a O H調(diào)節(jié) p H值至 7 0 1 5 l b f i n 2 1 0 3 4 1 0 5 P a 滅菌 2 0 分鐘 3 無(wú)菌氨芐青霉素溶液 1 0 0 m g 氨芐青霉素溶于 1 m l 無(wú)菌水 4 無(wú)菌 I P T G 溶液的配制 0 2 3 8 g I P T G粉末 定溶于 1 0 m l無(wú)菌水 用 0 4 5 m濾器過(guò) 濾除菌 二 實(shí)驗(yàn)方法 1 提取 A e r o p y r u m p e r n i x K1染色體基因組 1 取 1 5 m l 的 A e r o p y r u m p e r n i x K1培養(yǎng)物于 1 0 0 0 0 r p m 離心 分鐘 倒盡上清液 用 2 0 0 l 溶液 重懸沉淀 2 加入 5 0 l 的 5 0 m g m l 溶菌酶 在 4 下消化 小時(shí) 3 加入 1 2 體積的 2 的 S D S 溶液反應(yīng) 1 0 分鐘 4 加入等體積的酚 氯仿 異戊醇 混勻 離心 5分鐘 將上清 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 應(yīng)用鼎國(guó)技術(shù)公司 D N A 片段快速回收試劑盒 操作方法見(jiàn)北京鼎國(guó)技術(shù)公司的產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū) 4 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 1 將甘油保藏的菌種 2 0 0 u l 接種于裝有 1 0 m l L B 培養(yǎng)液的 5 0 m l 試管中于 3 7 震蕩 2 5 0 r p m m i n 培養(yǎng)過(guò)夜 2 向兩個(gè)內(nèi)裝 2 0 0 m l L B 培養(yǎng)液的 1 L三角瓶中各加入 4 m l 過(guò)夜 培養(yǎng)細(xì)胞 于 3 7 下震蕩培養(yǎng)至光密度 O D6 0 0 值介于 0 5 0 6 之 間 約需 1 2 h 3 將每份細(xì)胞培養(yǎng)物分別倒入一個(gè)預(yù)先冰浴的無(wú)菌 2 5 0 m l離心 瓶并置于冰上保持 2 0 m i n 于 4 下離心 1 0 m i n 8 0 0 0 r p m m i n 1 0 0 0 0 g 棄上清 4 將每份沉淀輕緩地懸于 1 0 0 m l 冰冷的 0 1 m o l L M g C l2 p H 7 2 溶液中 按上述方法再次離心 5 去上清 并將每一沉淀輕緩地懸浮于 2 0 m l 冰冷的含 2 0 甘油 的 0 1 m o l L C a C l2 p H 7 2 溶液中 6 每管 1 m l分裝于 4 0個(gè) 1 5 m l E p p e n d o r f管中 8 0 冷凍貯 存?zhèn)溆?5 質(zhì)粒 D N A 的小量制備 堿裂解法 方法一 1 細(xì)菌培養(yǎng)物倒入 1 5 m l 無(wú)菌微量離心管中 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分鐘離 心數(shù)秒 倒盡培養(yǎng)液 2 加 4 0 0 l S T E 溶液重懸 洗滌沉淀后 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分鐘離心 3 0 秒 倒盡上清 3 將細(xì)菌沉淀重懸于 9 0 l用冰預(yù)冷的溶液 中 加 1 0 l溶 菌酶混勻 4 放置 1 小時(shí) 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 4 加入 2 0 0 l 溶液 蓋緊管口 快速顛倒離心管數(shù)次 確保 離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液 接觸 將離心管放置于冰水浴 5 分 鐘 5 加入1 5 0 l 預(yù)冷的溶液 溫和顛倒 4 6 次 冰浴3 5 分鐘 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分離心 5 分鐘 上清移至另一無(wú)菌離心管 6 加等體積的酚 氯仿 異戊醇 振蕩混勻 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分離心 上清移至另一無(wú)菌離心管 7 用 2 倍體積預(yù)冷乙醇沉淀 D N A 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分離心 5 分鐘 沉淀 用 7 0 乙醇洗兩次 干后用 T E 溶解備用 方法二 1 應(yīng)用鼎國(guó)技術(shù)公司質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?2 操作方法見(jiàn)北京鼎國(guó)技術(shù)公司的產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū) 注 在加 入 2 0 0 l B 液后先加入 1 0 l 溶菌酶 4 消化 1 小時(shí) 再加 R n a s e A 操作 其余同說(shuō)明書(shū) 6 體外重組 1 P C R 純化產(chǎn)物的雙酶切 在 1 5 m l E p p e r d o r f 管中 加入 B u f f e r 1 0 K 2 l B a m H 1 l N d e 1 l P C R 純化產(chǎn)物 1 2 l D d H2O 4 l 2 0 l 在 3 7 保溫 1 小時(shí) 2 質(zhì)粒的雙酶切 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 用具有高保真的P C R 擴(kuò)增用的D N A 聚合酶 以古細(xì)菌A e r o p y r u m p e r n i x K1染色體基因組為模板進(jìn)行 A P E 2 3 2 5的擴(kuò)增 P C R反應(yīng)條 件 9 4 2 m i n 對(duì)模板進(jìn)行變性 在 9 4 1 m i n 5 5 1 5 m i n 7 2 2 m i n 3 5 個(gè)循環(huán) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2 瓊脂糖電泳分析 于 4 7 0 b p 左右處出現(xiàn)一條特異帶 大小與預(yù)期 4 7 4 b p 相符 圖 2 1 Fig 2 1 P C R a m p l i c a t i o n o f A P E 2 3 2 5 g e n e A P C R p r o d u c t o f A P E 2 3 2 5 g e n e M D L 2 0 0 0 M a r k e r 將預(yù)期大小 4 7 4 b p 的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收后 與 p E T 1 5 b 載體連接 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 B L P 涂布于氨芐 2 Y T 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 Fig 2 2 R e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t e d o f t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T 1 5 b A P E 2 3 2 5 A D L 2 0 0 0 M a r k e r B C o l o n y o f p E T 1 5 b A P E 2 3 2 5 d i g e s t e d w i t h N d e B a m H C H i n d M a r k e r 選取酶切鑒定正確的克隆質(zhì)粒送交北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中 心進(jìn)行序列測(cè)定 結(jié)果表明 克隆的 A P E 2 3 2 5 基因序列與 G e n e B a n k 中已公布的序列完全一致 測(cè)序資料略 2 1 2 S D S P A G E AM 97400 66200 43000 31000 20100 14400 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 一 材料和方法 主要儀器及試劑 1 U V 2 5 0 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于日本島津公司 2 胰化蛋白胨 酵母抽提液購(gòu)于英國(guó) O X O I D 公司 3 T r i s堿 異丙基硫代 D 半乳糖苷 I P T G 購(gòu)于美國(guó) B e b c o I n d u s t r i e s C o r p 公司 4 氨芐青霉素 丙烯酰胺 N N 亞甲雙丙烯酰胺 N N N N 四甲基乙二胺 十二烷基硫酸納購(gòu)于美國(guó) S i g m a 公司 5 S D S P A G E M o l e c u l a r W e i g h t M a r k e r s f o r P r o t e i n s 低 分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 1 4 4 0 0 9 7 4 0 0 購(gòu)于中科院上海生物化 學(xué)研究所 6 鎳親和柱購(gòu)于德國(guó) N o v a g e n 公司 7 P h o r e t i x 1 D A d v a n c e d 4 0 1 軟件購(gòu)于 P e r k i n E l m e r L i f e S c i e n c e s 公司 2 工程菌來(lái)源 本室構(gòu)建的以 p E T 1 5 b 為載體 大腸桿菌 B L P 為宿主高效表達(dá) 體系的產(chǎn)嗜熱磷脂酶 A2的工程菌 p E T 1 5 b含有七個(gè)組氨酸尾巴和 凝血酶切位點(diǎn) 簡(jiǎn)化了酶表達(dá)后的重組酶純化流程 3 培養(yǎng)基成分 1 2 Y T液體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 6 酵母抽提液 1 N a C l 0 5 1 N N a O H調(diào)節(jié) p H值至 7 0 1 5 l b f i n 2 1 0 3 4 1 0 5 P a 滅菌 2 0 分鐘 2 2 Y T固體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 6 酵母抽提液 1 N a C l 0 5 瓊脂粉 2 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 1 N N a O H調(diào)節(jié) p H值至 7 0 1 5 l b f i n 2 1 0 3 4 1 0 5 P a 滅菌 2 0 分鐘 3 無(wú)菌氨芐青霉素溶液 1 0 0 m g 氨芐青霉素溶于 1 m l 無(wú)菌水 4 無(wú)菌 I P T G 溶液的配制 0 2 3 8 g I P T G 粉末 定溶于 1 0 m l 無(wú)菌水 用 0 4 5 m 濾器過(guò)濾 除菌 4 親和層析溶液 1 8 x B i n d i n g B u f f e r 4 0 M 咪唑 4 M N a C l 1 6 0 m M T r i s H C l p H 7 9 2 4 x E l u t e B u f f e r 4 M 咪唑 2 M N a C l 8 0 m M T r i s H C l p H 7 9 3 8 x C h a r g e B u f f e r 4 0 0 m M N i2S O 4 4 4 x S t r i p B u f f e r 2 M N a C l 8 0 m M T r i s H C l p H 7 9 4 0 0 m M E D T A 二 實(shí)驗(yàn)方法 1 A P E 2 3 2 5 工程菌的復(fù)壯及種子培養(yǎng) 涂布保存于 1 0 甘油管的種子液于固體平板上進(jìn)行復(fù)壯 挑 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 取一環(huán)新鮮的復(fù)壯后的工程菌 接入 2 m l 液體種子培養(yǎng)基中 3 7 1 2 0 r p m m i n 條件下 空氣搖床培養(yǎng) 1 2小時(shí) 作為初步放大的 種子液 2 工程菌發(fā)酵的初步放大 將 2 m l 種 子 液 注 入 到 2 0 0 m l 的液體發(fā)酵液中 3 7 1 2 0 r p m m i n 條件下 空氣搖床培養(yǎng) 1 2 小時(shí) 作為大批培養(yǎng)的種子 液 3 工程菌大批發(fā)酵及目的蛋白的誘導(dǎo) 將初步放大的種子液以 1 的比例接入 6 L的培養(yǎng)液中 3 7 1 2 0 r p m m i n 條件下空氣搖床培養(yǎng) 待菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí) O D 0 6 1 加入1 0 0 m M 的 I P T G的終濃度達(dá)到 1 m M 并降低 搖床的溫度為 2 5 對(duì)菌體進(jìn)行誘導(dǎo)使其產(chǎn)生大量的目的蛋白 同時(shí)避免產(chǎn)生酶的包函體 培養(yǎng) 1 0 1 2 小時(shí)后收獲菌體 4 A P E 2 3 2 5 的純化流程圖 1 粗酶液的獲得 工程菌培養(yǎng)液 離心 6 0 0 0 r p m 2 0 分鐘 稱(chēng)濕重 棄去上清 將菌體于 3 0 冷凍 1 小時(shí) 溶菌體于 b i n d i n g b u f f e r 中 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 超聲破碎 1 0 分鐘 8 5 水浴 3 0 分鐘加熱變性其他菌體蛋白及激活目的蛋白 1 2 0 0 0 r p m 離心 2 0 m i n 收集上清得粗酶液 檢測(cè)蛋白濃度及粗酶活力 2 親和柱層析 3 m l 鎳親和柱 N i C h e l a t i n g C o l u m n 加入去離子水至柱頂端 自然洗脫后用 5 倍體積的 1 C h a r g e b u f f e r 自然洗脫 再加入去離 子水至柱頂端自然洗脫 后用 3 倍柱體積 1 B i n d i n g b u f f e r自然流 干 再將粗酶液上柱 待自然流干后用 1 1 2 倍柱體積的 B i n d i n g b u f f e r自然洗脫 最后用 5 倍柱體積的 1 W a s h b u f f e r 洗脫目的蛋 白 用 1 B i n d i n g b u f f e r 透析蛋白溶液除去咪唑 用聚乙二醇包埋 濃縮目的蛋白 電泳檢測(cè)純度 5 S D S P A G E S D S P A G E 在 P h a m a c i a E l e c t r o p h o r e i s E P S 5 0 0 4 0 0 型電泳儀 上進(jìn)行 1 凝膠的配制 如表 3 1 所示 2 2 X 凝膠加樣緩沖液的配制 5 0 m m o l L T r i s C l p H 6 8 1 0 0 m m o l L 二硫蘇糖醇 D T T 2 S D S 電泳級(jí) 0 1 溴酚藍(lán) 1 0 甘油 3 T r i s 甘氨酸電泳緩沖液的配制 2 5 m m o l L T r i s 2 5 0 m m o l L 甘氨酸 p H 8 3 0 1 S D S 4 染色液的配制 配制 9 0 m l乙醇 水 1 1 V V 和 1 0 m l冰乙酸的混合液 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 振搖均勻 2 6 0 0 r p m 4 離心 1 0 分鐘 收集 2 5 m l 上清液 氮?dú)飧稍?溶于 1 5 0 l 甲醇 氯仿 1 1 v v 3 薄層層析 取 1 0 l 樣品點(diǎn)在薄板上 自然干燥 然后用氯仿 甲醇 水 3 5 6 5 4 v v v 作為展層劑 分離 N B D P C和 N B D a c i d 2 酯酶活力測(cè)定方法 6 1 按表 3 2 以 1 0 m m o l L 對(duì)硝基苯丙酸酯作為底物 取 9 4 0 l 經(jīng) 9 0 保溫的 p H 值為 8 0 的 5 0 m m o l L T r i s H C l 的緩沖液 加入 4 0 l純化的 A P E 2 3 2 5 再加入 2 0 l底物測(cè)對(duì)硝基苯酚在 4 2 0 n m O D 值隨時(shí)間的變化曲線 T a b l e 3 2 反應(yīng)步驟 空白 樣品 加入保溫的 p H 8 0 T r i s H C l緩沖液 9 8 0 l 9 6 0 l 加入對(duì)硝基苯丙酸酯 2 0 l 2 0 l 加入酶液 4 0 l 總體積 1 m l 1 m l 活力計(jì)算方法 活力單位 m g O D4 2 0 0 0 1 6 V V E 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 O D 4 2 0 每分鐘 O D4 2 0 的變化 V 反應(yīng)體系的總體積 m l VE 酶在反應(yīng)體系中的體積 E 酶濃度 m g m l 4 2 0 1 0 0 1 6 M 3 A P E 2 3 2 5 活力單位定義 在上述反應(yīng)條件下 每分鐘催化 1 微摩爾對(duì)硝基苯丙酸酯所需 的酶量代表為一個(gè)活力單位 U 7 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 按 B r a d f o r d 方法測(cè)定蛋白含量 用牛血清白蛋白 B S A 做標(biāo) 準(zhǔn)曲線 6 2 考馬斯亮蘭法 以牛血清白蛋白配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 1 m g m l 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 測(cè)定目的蛋白含量 T a b l e 3 3 B i n d i n g b u f f e r 緩沖液 1 0 0 l 9 5 l 9 0 l 8 0 l 7 0 l 6 0 l 5 0 l 4 0 l 考馬斯 亮蘭溶 液 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 標(biāo)準(zhǔn)蛋 白溶液 5 l 1 0 l 2 0 l 3 0 l 4 0 l 5 0 l 6 0 l 1 考馬斯亮蘭溶液配制 考馬斯亮藍(lán) G 2 5 0 1 0 0 m g 溶于 5 0 m l 9 5 乙醇中 加入 1 0 0 m l 8 5 磷酸 用蒸餾水稀釋至 1 0 0 0 m l 濾紙過(guò)濾 最終試劑中含 0 0 1 W V 考馬斯亮藍(lán) G 2 5 0 4 7 W V 乙醇 8 5 W V 磷酸 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 如表 3 3 所示 三 結(jié)果與討論 1 酶純化活力回收情況 由于表達(dá)產(chǎn)物帶有 H i s t a g 標(biāo)記 所以易于通過(guò) N i 鰲合柱獲 得純化的 A P E 2 3 2 5蛋白 同時(shí)由純化回收率及純化倍數(shù)可知 熱 變性與 N i 親和柱層析均為非常有效的純化目的蛋白的方式 表 3 4 將酶切鑒定的工程菌經(jīng) I P T G 誘導(dǎo)后 在 S D S P A G E 電泳中出 現(xiàn)一條明顯的蛋白表達(dá)帶 其分子量約為 1 8 0 0 0 D a 左右 圖 3 1 與預(yù)期值 1 7 8 7 1 D a A P E 2 3 2 5 七個(gè)組氨酸尾巴和凝血酶切位點(diǎn)基 本相符 用 P h o r e t i x 1 D A d v a n c e d 4 0 1一維圖像分析軟件可以得出 其精確分子量為 1 8 2 8 6 D a 其預(yù)期值相符 如圖 3 2 所示 T a b l e 3 4 P u r i f i c a t i o n o f A P E 2 3 2 5 提純步驟 總活力 U 總 蛋 白 量 m g 比活力 U m g蛋 白 回收率 提純倍數(shù) 凍融后的 粗酶液 2 1 0 3 1 0 8 7 1 9 3 1 0 0 1 鎳親和柱 1 6 3 3 1 3 6 1 1 1 9 9 7 8 3 6 6 2 1 6 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 化性質(zhì) 為深入探討酶的特性 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 必須排除其它因 素對(duì)酶活性的干擾 使酶從產(chǎn)生的環(huán)境中分離提取出來(lái) 所獲得的 酶純度越高 其性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的研究就越準(zhǔn)確 就更利于進(jìn)行理論應(yīng) 用的研究 本章研究了工程菌重組酶 A P E 2 3 2 5 的純化 通過(guò)有效的純化 方法 熱變性及鎳親和柱層析等純化方法 使重組酶 A P E 2 3 2 5 得 到純化 經(jīng) S D S P A G E電泳分析 在分子量為 1 8 0 0 0 D a左右出現(xiàn)電 泳條帶 與預(yù)期值 1 7 8 7 1 D a A P E 2 3 2 5 七個(gè)組氨酸尾巴和凝血酶 切位點(diǎn)基本相符 并只存在單一電泳條帶 表明此酶已被純化 用 P h o r e t i x 1 D A d v a n c e d 4 0 1 一維圖像分析軟件可以得出其精確分 子量為 1 8 2 8 6 D a 與預(yù)期值相符 第四章 A P E 2 3 2 5 的酶學(xué)性質(zhì)研究 一 實(shí)驗(yàn)材料 1 A P E 2 3 2 5 來(lái)源 由本組構(gòu)建的工程菌表達(dá) 經(jīng)純化后獲得 2 實(shí)驗(yàn)儀器 U V 5 5 7紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 熒光分光光度計(jì) R F 5 3 0 1 P C 購(gòu)于日本 S H I M A D Z U 島津 公司 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 購(gòu) 于 1 4 4 2 M U L T I W A V E L E I V G T H F L U O R O I M A G E R 購(gòu)于 W A L L A C A R T H U R P h o r e t i x 1 D A d v a n c e d 4 0 1 P h o r e t i x 2 D A d v a n c e d 5 0 1 等 軟件購(gòu)于 P e r k i n E l m e r L i f e S c i e n c e s 公司 3 實(shí)驗(yàn)試劑 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 對(duì)硝基苯酚丙酸酯 p N I T R O P H E N Y L P R O P I O N A T E 對(duì)硝基苯 酚辛酸酯 p N I T R O P H E N Y L C A P R Y L A T E 對(duì)硝基苯酚月桂酸酯 p N I T R O P H E N Y L L L A U R A T E 對(duì) 硝 基 苯 酚 棕 櫚 酸 酯 p N I T R O P H E N Y L P A L M I T A T E 對(duì)硝基苯酚硬酸酯 p N I T R O P H E N Y L S T E A R A T E a c y l 2 N 4 n i t r o b e n z o 2 o x a 1 3 d i a z o l e a m i n o c a p r o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e N B D P C 購(gòu)于 S i g m a試劑 公司 甲醇 乙腈 氯仿購(gòu)于北京化工廠 乙酸乙酯 丙酮購(gòu)于天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司 二 實(shí)驗(yàn)方法 1 如不特殊說(shuō)明 測(cè)酶活方法同前 2 A P E 2 3 2 5 的底物特異性 分別稱(chēng)取適量的 p N I T R O P H E N Y L P R O P I O N A T E p N I T R O P H E N Y L C A P R Y L A T E p N I T R O P H E N Y L L L A U R A T E p N I T R O P H E N Y L P A L M I T A T E和 p N I T R O P H E N Y L S T E A R A T E溶于乙腈配成 1 0 m m o l L 的底物溶液 進(jìn)行酶活測(cè)定 3 A P E 2 3 2 5 最適溫度的測(cè)定 以 N B D P C 作為反應(yīng)底物 5 0 m M T r i s H C l 緩沖液 p H 8 0 作為溶劑 然后在 5 0 1 0 0 的溫度范圍內(nèi)測(cè)定該酶的 P L A2活力 以對(duì)硝基苯酚丙酸酯作為反應(yīng)底物 5 0 m M T r i s H C l緩沖液 p H 8 0 作為溶劑 然后在 4 0 1 0 0 的溫度范圍內(nèi)測(cè)定該酶 的酯酶活力 4 A P E 2 3 2 5 最適 p H的測(cè)定 配置 5 0 m M 的不同 p H 的緩沖液 包括 p H 5 0 7 0 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 50 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 4 A P E 2 3 2 5 的熱穩(wěn)定性 由于此酶基因來(lái)自于嗜熱古細(xì)菌 所以此酶應(yīng)具有極高的熱穩(wěn) 定性 酶的熱穩(wěn)定性是嗜熱酶最顯著的特性 體現(xiàn)了嗜熱酶對(duì)極端 環(huán)境的適應(yīng)的機(jī)制 將純酶置于不同溫度 5 0 1 0 0 下保溫一 定時(shí)間后迅速冷卻 然后測(cè)定其殘留的酶活力 結(jié)果如圖 4 7 所示 406080100 Temperature 40 60 80 100 120 Relative Activity C 0204060 Time min 40 60 80 100 120 Relative Activity F i g 4 7 T h e r m o s t a b i l i t y o f A P E 2 3 2 5 A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 8 0 A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 9 0 A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 9 5 T h e a s s a y m i x t u r e c o n t a i n e d 5 0 m M T r i s H C l p H 8 0 1 0 m M 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 p N I T R O P H E N Y L P R O P I O N A T E a n d A P E 2 3 2 5 t h e n w a s r e a c t e d a t 9 0 f o r 5 m i n A l i q u o t s w e r e r e m o v e d t o d e t e r m i n e t h e r e m a i n i n g a c t i v i t y 結(jié)果表明 A P E 2 3 2 5 在 8 0 保溫 1 h 后 酶活力還剩 7 6 6 4 在 9 0 保溫 1 h 后 酶活力還剩 6 8 2 3 在 9 5 保溫 1 h 后 酶活 力還剩 5 3 5 6 說(shuō)明該酶的熱穩(wěn)定性較高 5 A P E 2 3 2 5 p H 穩(wěn)定性 由圖 4 8 可以看出 A P E 2 3 2 5 在堿性 p H 7 9 范圍內(nèi)穩(wěn)定性 較高 殘余酶活在 7 0 以上 4681012 pH 0 25 50 75 100 Relative Activity 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 Km 103 3 M Vm 249 69u mg kcat 39 04s 1 7 金屬離子對(duì)酶活的影響 測(cè)試了 5種無(wú)機(jī)離子 N a K C a 2 M g 2 Z n 2 在濃度分別 為 1 m m o l L 時(shí)對(duì)酶活力的影響 表 4 2 結(jié)果表明各種均無(wú)明顯的激 活作用 除 Z n 2 對(duì)酶有較強(qiáng)的抑制作用外 其余離子未見(jiàn)明顯的抑 制作用 T a b l e 4 2 E f f e c t s o f d i f f e r e n t m e t a l c a t i o n s M e t a l c a t i o n s S p e c i f i c R e l a t i v e a c t i v i t y u m g a c t i v i t y B l a n k 1 7 1 8 9 1 0 0 N a 1 0 0 5 8 5 8 5 1 K 1 3 5 5 8 7 8 8 8 C a 2 1 4 1 2 8 8 2 1 1 M g 2 1 2 3 2 3 7 1 6 0 Z n 2 0 0 8 A P E 2 3 2 5 反應(yīng)活化能 恩格斯曾明確地指出 生命的起源必然是通過(guò)化學(xué)的途徑實(shí)現(xiàn) 的 也就是通過(guò)化學(xué)的進(jìn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)的 即從一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化成另一 種物質(zhì) 由簡(jiǎn)單物質(zhì)轉(zhuǎn)化為復(fù)雜物質(zhì) 由無(wú)生命的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成有生 命的物質(zhì) 由生命的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成無(wú)生命的物質(zhì) 生命的結(jié)束 在 所有這些過(guò)程中沒(méi)有一個(gè)不通過(guò)化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程 一涉及化學(xué)反應(yīng) 過(guò)程就存在反應(yīng)快慢的問(wèn)題 而反應(yīng)的快慢又取決于這個(gè)過(guò)程的反 應(yīng)活化能 活化能高 反應(yīng)慢 活化能低 則反應(yīng)快 在圖 4 5 中的曲線上選取 4 0 8 0 的 5 個(gè)點(diǎn) 用 A r r h e n i u s 做圖 法計(jì)算出活化能約為 1 7 5 5 7 k J m o l 1 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 酶 其活化能為 5 6 9 k J m o l 1 K 1 相比 A P E 2 3 2 5 反應(yīng)活化能低得 多 6 4 0 00280 00300 0032 1 T 4 5 5 0 5 5 lnv Fig 4 10 Arrhenius plot of APE 2325 9 A P E 2 3 2 5 的光譜學(xué)性質(zhì) 溫度變化可以導(dǎo)致酶活力的變化 所以我們考察不同溫度對(duì)酶 構(gòu)象的影響 即通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)考察酶的構(gòu)象的變化 熒光的發(fā)生是通過(guò)一個(gè)化合物吸收光子而產(chǎn)生激發(fā)態(tài) 后又因 光子的重新發(fā)射而衰退 衰退可能通過(guò)與一個(gè)分子相碰撞 或通過(guò) 分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基因上去而發(fā)生 這時(shí)熒光稱(chēng)為淬滅 結(jié) 合在配基上的一個(gè)蛋白質(zhì)的色氨酸的熒光淬滅 通?？勺鳛闇y(cè)定結(jié) 合程度低的一個(gè)有用手段 在水中 色氨酸的銀光強(qiáng)度非常弱 但 在蛋白質(zhì)非極性區(qū)域內(nèi) 它的熒光則可能被增強(qiáng)了 所以熒光對(duì)于 分子的構(gòu)象是敏感的 可以用來(lái)探測(cè)蛋白質(zhì) 及其聚合物 外形的 變化 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 Fig 4 12 F l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s p e c t r a o f A P E 2 3 2 5 a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e B l u e c u r v e A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 5 0 f o r 1 0 m i n R e d c u r v e A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 8 0 f o r 1 0 m i n G r e e n c u r v e A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 9 0 B l a c k c u r v e A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 1 0 0 四 小結(jié) 酶的基本酶學(xué)性質(zhì)是研究酶結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ) 是開(kāi)發(fā)酶應(yīng)用 于特殊領(lǐng)域的必要依據(jù) 嗜熱磷脂酶 A2的酶學(xué)性質(zhì)主要包括酶的最 適作用溫度 最適 p H 酶的熱穩(wěn)定性及底物特異性等 對(duì)嗜熱酶 而言 其熱穩(wěn)定性是標(biāo)志其功能的一個(gè)重要指標(biāo) 是研究嗜熱磷脂 酶 A2適應(yīng)機(jī)制的前提和基礎(chǔ) 本章對(duì) A P E 2 3 2 5的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究 觀察在高溫條件 下酶的熱穩(wěn)定性 為進(jìn)一步分析酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定基礎(chǔ) 對(duì) 純化的重組酶 A P E 2 3 2 5進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明 該酶既具有 磷脂酶 A2活力又具有酯酶活力 發(fā)揮催化活力的最適溫度為 9 0 最適 p H為 8 0 該酶具有較強(qiáng)的耐堿性和較高的熱穩(wěn)定性 酶在 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較高 保存 2 4小時(shí)之后殘余活力為 8 0 以上 但在 p H 4 0 的酸性環(huán)境中保存 2 4 小時(shí)酶活力幾乎完全喪失 在 7 0 保溫 6 0分鐘酶活力沒(méi)有損失 在 8 0 保溫 6 0分鐘酶的殘余活 力為 7 6 6 4 在 9 0 保溫 6 0 分鐘酶的殘余活力為 6 8 2 3 在 1 0 0 保溫 6 0 分鐘酶的殘余活力為 4 6 6 9 動(dòng)力學(xué)研究表明 9 0 時(shí) 的 K m k c a t V m 分別為 1 0 3 3 M 3 9 0 4 s 1 2 4 9 6 9 u m g 隨著環(huán)境溫度的升高 A P E 2 3 2 5活力增加 該酶的熒光光譜 研究表明 酶的構(gòu)象隨溫度升高也發(fā)生了相應(yīng)的變化 推測(cè)高溫使 內(nèi)部疏水性生色氨基酸暴露于溶液中 激活了酶在低溫時(shí)原始的無(wú) 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 1 氨基酸同源性分析結(jié)果 在生物學(xué)研究中 有一個(gè)常用的方法 就是通過(guò)比較分析獲取 有用的信息和知識(shí) 達(dá)爾文正是研究比較了 G a l a p a g o s f i n c h e s同其 他一些物種的形態(tài)學(xué)特征 從而提出了自然選擇學(xué)說(shuō) 今天 我們 對(duì)基因和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較 從本質(zhì)上來(lái)講是同達(dá)爾文一樣 進(jìn) 行同樣的分析 只不過(guò)更加精細(xì) 更加詳盡 在這個(gè)意義上 我們 從核酸和氨基酸的層次去分析序列的相同點(diǎn)和不同點(diǎn) 以其能夠推 測(cè)它們的結(jié)構(gòu) 功能以及進(jìn)化上的聯(lián)系 進(jìn)行序列比較的目的就是讓人們能夠判斷序列之間是否具有 足夠的相似性 從而判定二者之間是否具有同源性 雖然相似性和 同源性在某種程度上具有一致性 但它們是完全不同的兩個(gè)概念 相似性是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系 比如部分相同或相似的百分比 或其它一些合適的度量 而同源性是指從一些數(shù)據(jù)中推測(cè)出的兩個(gè) 基因在進(jìn)化上曾具有共同祖先的結(jié)論 它是質(zhì)的判斷 進(jìn)行相似性序列分析的蛋白質(zhì)分別為 S V I P L A 2 來(lái)源于原核菌 S t r e p t o m y c e s v i o l a c e o r u b e r 1 2 2個(gè)氨 基酸 A P E 2 3 2 5 來(lái)源于古細(xì)菌 A e r o p y r u m p e r n i x K1 1 5 7 個(gè)氨基酸 A M E P L A2 來(lái)源于蜜蜂的 A p i s m e l l i f e r a 1 3 4 個(gè)氨基酸 B C A P L A2 來(lái)源于金環(huán)蛇的 B u n g a r u s c a e r u l e u s 1 1 8 個(gè)氨基酸 B T A P L A2 來(lái)源于牛的 B o s t a u r u s 1 2 3 個(gè)氨基酸 P F L P L A2 來(lái)源于細(xì)菌 P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s b v 1 2 8 個(gè)氨基 酸 S S C P L A2 來(lái)源于豬的 S u s s c r o f a 1 2 4 個(gè)氨基酸 V A M P L A2 來(lái)源于毒蛇的 V i p e r a a m m o d y t e s 1 5 7 個(gè)氨基酸 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 F i g 5 1 S e q u e n c e a l i g n m e n t o f P L A2 f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s F i g 5 2 E v o l u t i o n t r e e o f P L A2 f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 F i g 5 3 S e q u e n c e a l i g n m e n t o f A P E 2 3 2