生物化工-遺傳物質(zhì)基礎與基因工程ppt課件.ppt

Chapter4遺傳的分子基礎與基因工程 遺傳和變異的物質(zhì)基礎PhysicsfoundationofHeredityandVariation 基因的表達ExpressionFunctionofGene 基因的重組過程GeneralProcessofReunitingDNATechnique 基因工程的應用ApplicationofGeneEngineering 克隆CloneTechnology 一 遺傳物質(zhì)的確定二 脫氧核糖核酸DNA的化學組成三 DNA的雙螺旋結構四 DNA復制 第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎 Physicsfoundationofheredityandvariation 遺傳 heredity 親代把其自身性狀傳給子代的特性變異 varation 子代具有改變親代遺傳性狀的特性 一 遺傳物質(zhì)的確定 肺炎鏈球菌轉化實驗噬菌體感染實驗 20世紀40年代末 Avery的 肺炎雙球菌轉化 實驗證明DNA是有機體的遺傳物質(zhì) DNA 溫育 光滑有莢膜 S型致病 噬菌體感染實驗 結論 除少數(shù)病毒 RNA病毒 如天花病毒和流感病毒 以RNA作為遺傳物質(zhì)外 多數(shù)有機體的遺傳物質(zhì)是DNA 不同有機體遺傳物質(zhì) 信息分子 的結構差別 使得其所含蛋白質(zhì) 表現(xiàn)分子 的種類和數(shù)量有所差別 有機體表現(xiàn)出不同的形態(tài)結構和代謝類型 RNA的主要作用是從DNA轉錄遺傳信息 并指導蛋白質(zhì)的合成 二 脫氧核糖核酸DNA的化學組成 核糖核酸nucleicacid 核苷酸nucleotide 核苷nucleoside 磷酸phosphate 嘌呤堿purinebase或嘧啶堿pyrimidinebase 堿基base 核糖ribose或脫氧核糖deoxyribose 戊糖amylsugar 一 核糖和脫氧核糖 D 2 核糖 D 2 脫氧核糖 O 核糖 H 糠醛 甲基間苯二酚 FeCl3 綠色產(chǎn)物 脫氧核糖 H 羥基 酮戊醛 二苯胺 藍色產(chǎn)物 RNA和DNA定性 定量測定 二 嘌呤堿和嘧啶堿 1 2 3 4 5 6 7 8 9 嘌呤 腺嘌呤adenine A 鳥嘌呤guanine G H H H 嘧啶 1 2 3 4 5 6 胞嘧啶Cytosine C 尿嘧啶uracil U H H 胸腺嘧啶thymine T H H 烯醇式 三 核苷 腺苷 尿苷 OH 假尿苷 四 核苷酸 P O 胸苷 5 磷酸 O 各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA和DNA合成的直接原料 在體內(nèi)能量代謝中的作用 ATP 能量 貨幣 UTP 參加糖的互相轉化與合成 CTP 參加磷脂的合成 GTP 參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成 3 5 1 P P P OH A T G pGpTpAOH pG T A pGTA 三 DNA的結構 一 DNA的一級結構 因為DNA的脫氧核苷酸只在它們所攜帶的堿基上有區(qū)別 所以脫氧核苷酸的序列常被認為是堿基序列 basesequence 通常堿基序列由DNA鏈的5 3 方向寫 DNA中有4種類型的核苷酸 有n個核苷酸組成的DNA鏈中可能有的不同序列總數(shù)為4n 二 DNA的雙螺旋結構 1953年 Watson和Crick提出 1 雙螺旋結構的主要依據(jù) 1 Wilkins和Franklin發(fā)現(xiàn)不同來源的DNA纖維具有相似的X射線衍射圖譜 2 Chargaff發(fā)現(xiàn)DNA中A與T C與G的數(shù)目相等 后Pauling和Corey發(fā)現(xiàn)A與T生成2個氫鍵 C與G生成3個氫鍵 3 電位滴定證明 嘌呤與嘧啶的可解離基團由氫鍵連接 2 雙螺旋結構模型要點 1 兩條多核苷酸鏈反向平行 2 兩股鏈之間的距離為2nm A與T G與C配對 分別形成2和3個氫鍵 3 磷酸與核糖以3 5 磷酸二酯鍵連接 構成DNA的主鏈骨架 主鏈位于螺旋的外側 堿基位于內(nèi)側 4 每個堿基對的兩個堿基處于同一平面 此平面與螺旋中心軸垂直 3 雙螺旋結構的穩(wěn)定因素 1 氫鍵 太弱 2 堿基堆積力 basestackingforce 由芳香族堿基 電子間的相互作用引起的 能形成疏水核心 是穩(wěn)定DNA最重要的因素 3 離子鍵 減少雙鏈間的靜電斥力 DNA雙螺旋結構模型建立的意義是DNA復制 RNA轉錄和反向轉錄的分子基礎 關系到遺傳信息的表達 分子生物學的開端 三 DNA的三級結構 線形分子 雙鏈環(huán)狀 dcDNA 超螺旋 四 DNA復制 DNA是遺傳信息的載體 必須準確地進行自我復制 復制出與親代DNA分子核苷酸順序完全相同的子代DNA分子 并傳遞到子代細胞中去 解鏈酶 DNA聚合酶 半保留復制 遺傳的功能單位 基因 第二節(jié) 基因的表達功能 ExpressionFunctionsofGene 基本生命物質(zhì) 核酸 nucleicacid 蛋白質(zhì) protein 蛋白質(zhì)的功能 新陳代謝及作為細胞結構的組成物質(zhì) 生命活動的體現(xiàn)者 核酸的生物功能 存儲和傳遞遺傳信息 指導和控制蛋白質(zhì)的合成 遺傳信息的傳遞 DNA的復制和基因表達 geneexpression 基因表達 遺傳物質(zhì)把遺傳信息轉變?yōu)樘囟ò被崤帕许樞虻牡鞍踪|(zhì) 從而決定生物體表型的過程 包括RNA的轉錄和蛋白質(zhì)的生物合成 一 RNA的轉錄 RNA ribonucbicacid 核糖核酸 由數(shù)十上百個核苷酸組成的一條單鏈 其特性也決定于核苷酸的 堿基 的排列順序 RNA分子是含短的不完全的螺旋區(qū)的多核苷酸鏈 核糖代替了脫氧核糖尿嘧啶 U 代替胸腺嘧啶 T 遺傳信息的中心法則 生物的遺傳信息是從DNA流向RNA 再由RNA流向蛋白質(zhì) 描述DNA RNA和蛋白質(zhì)三者關系的過程 RNA的轉錄過程 RNA聚合酶 轉錄酶 編碼鏈 具有轉錄活性 轉錄產(chǎn)物 三種RNAmRNA messengerRNA 信使RNA蛋白質(zhì)合成的模板 rRNA ribosomalRNA 核蛋白體RNA蛋白質(zhì)合成的裝配機 tRNA transferRNA 轉移RNA 氨基酸分子的搬運工 二 蛋白質(zhì)的生物合成 一 遺傳密碼 二 蛋白質(zhì)的生物合成 一 遺傳密碼及其基本特點遺傳密碼 三個核苷酸作為一個密碼來編碼一種氨基酸 三連體密碼 tripletcode 遺傳密碼表 遺傳密碼的基本特點 通用性簡并性讀碼的連續(xù)性 通用性 Universal 從病毒直到人類 細胞核DNA指導的蛋白質(zhì)合成都使用同一套遺傳密碼 簡并性 Degeneracy 遺傳密碼中 除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個密碼子外 其余氨基酸有2 3 4個或多至6個三聯(lián)體為其編碼 這稱為遺傳密碼的簡并性 編碼同一氨基酸的幾組簡并密碼子上第一二位堿基多相同 而第三位堿基改變往往不影響氨基酸翻譯 讀碼的連續(xù)性 Commaless 二 蛋白質(zhì)的生物合成 按照細胞核中DNA的指令 以mRNA為模板 tRNA為工具 在rRNA內(nèi)把細胞質(zhì)中的氨基酸有順序的排列起來的過程即為蛋白質(zhì)的生物合成 遺傳學又叫轉議或者翻譯 三 基因突變 基因突變 自然突變和誘發(fā)突變一切生物的變異和進化都可以說是由于DNA的結構改變而引起蛋白質(zhì)改變的結果 生物遺傳的變異起源于DNA堿基配對的改變 有的由于DNA堿基的顛倒 如TA被顛倒為AT 或被調(diào)換 如GC被換為TA 有的由于在DNA復制過程中被遺漏了一對或多了一對核苷酸 或者在轉譯時發(fā)生了差誤 如氨酰tRNA合成酶錯將一個結構與正常氨基酸十分相似的物質(zhì)交給tRNA 還有一些生物的遺傳性狀發(fā)生了突變 第三節(jié)DNA重組技術的基本過程 generalprocessofreunitingDNAtechnology DNA重組技術是指在體外用酶學方法將不同來源的DNA進行切割 連接 組成一個新的DNA分子的過程 又稱基因重組 基因克隆將重組DNA分子導入到合適的受體細胞中 使其擴增和繁殖 以獲得大量的同一DNA分子 稱此為基因克隆 DNA克隆或分子克隆 基因工程實現(xiàn)基因克隆所采用的方法和相關工作 統(tǒng)稱為重組DNA技術或基因工程 基因工程的基本內(nèi)容 基因工程又叫做基因拼接技術或重組DNA技術 這種技術是在生物體外 通過對DNA分子進行人工 剪切 和 拼接 對生物的基因進行改造和重新組合 然后導入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖 使重組基因在受體細胞內(nèi)表達 產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物 FormingRecombinantDNA DesiredGene DNAfromtargetorganism RecombinantDNAwithgeneofinterest 基因操作的工具 基因的剪刀 限制性內(nèi)切酶 一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 并且能在特定的切點上切割DNA分子 基因的針線 DNA連接酶 基因的運輸工具 運載體 如質(zhì)粒 噬菌體和動植物病毒等 目的基因 基因載體 重組體 分 切 接 轉 篩 表 總體技術路線 DNA重組基本程序包括下列過程分 獲取目的基因和載體接 目的基因與載體的連接轉 重組DNA導入宿主細胞篩 重組DNA的篩選與鑒定 目的基因能表達的受體細胞挑選出來 表 重組基因控制蛋白質(zhì)的合成 1 目的基因的制取 切 酶切 方法 內(nèi)切酶人工化學合成方法mRNA為模板的反轉錄法 2 基因載體DNA的選擇 功能 為目的基因提供進入受體細胞的轉移能力 為目的基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力 為目的基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力 理想載體的基本條件 可轉移性合適的復制位點選擇標志 便于篩選和鑒定分子較小 可容納較大的外源DNA 質(zhì)粒噬菌體腺病毒載體逆轉錄病毒載體 種類 磷酸二酯鍵的形成 DNA連接酶 DNA連接酶 DNA連接酶 3 DNA體外重組 目的基因與載體的連接 接 4 DNA重組體導入受體細胞 重組體的轉化 受體細胞 轉 CaCl2處理 受體細菌 50 100mmol L CaCl2 感受態(tài)細菌 重組體轉入細菌 5 外源基因在宿主細胞中的表達 重組子 目的基因的mRNA 表達蛋白質(zhì) 大腸桿菌 E coli 受體細胞 表 第四節(jié)基因工程 菌 的應用 基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生 生產(chǎn)基因工程藥品 用于基因診斷與基因治療 基因工程與農(nóng)牧業(yè) 食品工業(yè)和化學工業(yè) 培育高產(chǎn) 穩(wěn)產(chǎn)和具有優(yōu)良品質(zhì)的動植物新品種 培育具有各種抗逆性的動植物新品種 為人類開辟新的食物來源 基因工程與環(huán)境保護 用于環(huán)境監(jiān)測 用于被污染環(huán)境的凈化 1 基因工程的藥物生產(chǎn)微生物生長迅速 容易控制 適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn) 如利用大腸桿菌生產(chǎn)胰島素 干擾素 白細胞介素等 既增加產(chǎn)量 又降低成本 基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生 基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生 2 基因診斷 基因診斷是用放射性同位素 如32P 熒光分子等標記的DNA分子做探針 利用DNA分子雜交原理 鑒定被檢測標本上的遺傳信息 達到檢測疾病的目的 生物芯片從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜 從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜 通過比較 分析這兩種圖譜 就可以得出病變的DNA信息 基因芯片診斷技術以其快速 高效 敏感 經(jīng)濟 平行化 自動化等特點 將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術 3 基因治療 GeneTherapy 可能治療的疾病 Diabetes 糖尿病cardiovasculardisease 心血管疾病cysticfibrosis 囊性纖維化Alzheimer s 老年癡呆Parkinson s 帕金森andmanyotherdiseasesispossible 其它一些可以治療的疾病 基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生 基因治療是把健康的外源基因導入有基因缺陷的細胞中 達到治療疾病的目的 基因工程與農(nóng)牧業(yè) 食品工業(yè)TheDNAofplantsandanimalscanalsobealtered PLANTSdisease resistantandinsect resistantcrops2 Hardierfruit3 70 75 offoodinsupermarketisgeneticallymodified HowtoCreateaGeneticallyModifiedPlant 1 Createrecombinantbacteriawithdesiredgene 2 Allowthebacteriato infect theplantcells 3 Desiredgeneisinsertedintoplantchromosomes 基因工程與農(nóng)牧業(yè) 食品工業(yè) 生長快 肉質(zhì)好的轉基因魚 中國 乳汁中含有人生長激素的轉基因牛 阿根廷 基因工程與農(nóng)牧業(yè) 食品工業(yè) 轉黃瓜抗青枯病基因的甜椒 轉魚抗寒基因的番茄 例 基因工程培育抗蟲棉的簡要過程 蘇云金芽孢桿菌 提取 抗蟲基因 與運載體DNA拼接 棉花植株 導入 基因工程與農(nóng)牧業(yè) 食品工業(yè) GoldenRice 黃金大米是一種轉基因大米 它通過轉基因技術將胡蘿卜素轉化酶系統(tǒng)轉入到大米胚乳中而獲得 外表為金黃色 故稱黃金大米 alleviatingvitaminAdeficienciesinthedietsofdisadvantagedpeopleindevelopingcountries traditionalricevarietiesdonotproduceprovitamin A 基因工程與環(huán)境保護 1 環(huán)境監(jiān)測基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒 細菌等污染 利用基因工程培育的 指示生物 能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況 卻不易因環(huán)境污染而大量死亡 甚至還可以吸收和轉化污染物 2 環(huán)境污染治理基因工程做成的 超級細菌 能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質(zhì) Geneticallymodifiedorganismsarecalledtransgenicorganisms TRANSGENICANIMALSMice usedtostudyhumanimmunesystemChickens moreresistanttoinfectionsCows increasemilksupplyandleanermeat4 Goats sheepandpigs producehumanproteinsintheirmilk DesiredDNAisaddedtoaneggcell HowtoCreateaTransgenicAnimal HumanDNAinaGoatCell Thisgoatcontainsahumangenethatcodesforabloodclottingagent Thebloodclottingagentcanbeharvestedinthegoat smilk TransgenicGoat Wecannowgrownewbodypartsandsoondonatingbloodwillbeathingofthepast butwillwegotoofar Photoofamousegrowinga humanear Growthhormoneandtherapy controlsseveralcomplexphysiologicprocesses includinggrowthandmetabolism Twobabymice sameageHumanGrowthhormonegeneinsertedintotheembryoofthemouseontherightcausingrapidgrowthThemouseontheleftisanormalsizedmouse GreenFluorescentProtein GFP andmice GeneticEngineering GeneticEngineerscanaltertheDNAcodeoflivingorganisms SelectiveBreedingRecombinantDNAPCRGelElectrophoresisTransgenicOrganisms PolymeraseChainReactionPCR 基于PCR原理三步驟而設置變性 退火 延伸三個溫度點 在標準反應中采用三溫度點法 變性 雙鏈DNA在90 95 變性 退火 再迅速冷卻至40 60 引物退火并結合到靶序列上 延伸 然后快速升溫至70 75 在TaqDNA聚合酶的作用下 使引物鏈沿模板延伸 循環(huán)次數(shù) 25 30cycles PCR擴增過程 TemplateDNA 變性 退火 延伸 復制過程 聚合酶鏈式反應是美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學家K B Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法 故又稱為基因的體外擴增法 它可以在試管中建立反應 經(jīng)數(shù)小時之后 就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬倍 乃至千百萬倍 而無需通過煩瑣費時的基因克隆程序 便可獲得足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝 所以有人亦稱之為無細胞分子克隆法 凝膠電泳 GelElectrophoresis Thistechnologyallowsscientiststoidentifysomeone sDNA StepsInvolvedinGelElectrophoresis 1 Cut DNAsamplewithrestrictionenzymes 2 RuntheDNAfragmentsthroughagel 3 Bandswillforminthegel 4 Everyone sDNAbandsareuniqueandcanbeusedtoidentifyaperson 5 DNAbandsarelike geneticfingerprints 凝膠電泳的基本原理 1 核酸分子之糖 磷酸骨架中的磷酸基團 呈負離子化狀態(tài) 核酸分子在一定的電場強度的電場中 它們會向正電極方向遷移 2 由于在電泳中往往使用無反應活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì) 電泳遷移率 或遷移速度 與分子的摩擦系數(shù)成反比 而摩擦系數(shù)是分子大小 介質(zhì)粘度等的函數(shù) 因此 在同一凝膠中 一定電場強度下 可在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構型有差異的核酸分子 影響遷移率的內(nèi)在因素 所帶靜電荷的多少 遷移率與表面電荷成正比 大小和形狀 直徑小而接近于球形 則在電場中泳動速度快 DNA構象 一般遷移速率 超螺旋環(huán)狀 線狀DNA 單鏈開環(huán) 瓊脂糖凝膠的檢測靈敏度在0 2 50Kb之間 聚丙烯酰胺的檢測靈敏度在1 1000bp之間 實驗材料 PCR產(chǎn)物 植物基因組DNA 質(zhì)粒DNA等 實驗試劑 電泳緩沖液 TAE 乙酸鹽緩沖液 TBE 硼酸鹽緩沖液 TPE 磷酸鹽緩沖液 電泳載樣緩沖液 loadingbuffer 指示劑溴酚藍和二甲苯酚起到指示的作用 顯示電泳的進程 以便我們適時終止電泳 里邊的成分甘油可以加大樣品密度 使樣品密度大于TAE 從而沉降到點樣孔中 防止樣品飄出點樣孔 電泳染料 溴化乙錠 EB Goldview 凝膠電泳槽 實驗儀器 凝膠成像系統(tǒng) 1 有些轉基因食物含的一些物質(zhì) 可能會影響人體健康 2 大量的轉基因生物進入自然界后很可能會與野生物種進行雜交 產(chǎn)生一些超級生物 從而造成基因污染 3 如有些作物插入抗蟲基因 殺死環(huán)境中有益的生物 基因工程的弊端 克隆 是Clone的譯音 意為生物體通過細胞進行的無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群 簡稱為 無性繁殖 克隆 一詞于1903年被引入園藝學 以后逐漸應用于植物學 動物學和醫(yī)學等方面 但克隆與無性繁殖是不同的 無性繁殖是指不經(jīng)過雌雄兩性生殖細胞的結合 只由一個生物體產(chǎn)生后代的生殖方式 常見的有孢子生殖 出芽生殖和分裂生殖 由植物的根 莖 葉等經(jīng)過壓條或嫁接等方式產(chǎn)生新個體也叫無性繁殖 綿羊 猴子和牛等動物沒有人工操作是不能進行無性繁殖的 科學家把人工遺傳操作動物繁殖的過程叫克隆 這門生物技術叫克隆技術 第五節(jié)克隆技術 Clonetechnology 一克隆的定義 二克隆方面取得的成果 國內(nèi)外克隆研究概況 1968年 英國科學家克隆非洲爪蟾 1978年 我國科學家克隆黑斑蛙 1979年 中國科學家克隆鯽魚 此后克隆出新魚卵 鯉鯽魚 1998年到1999年 美國和瑞士科學家成功克隆了灰鼠 1996年7月 克隆羊多利誕生 我國克隆技術處于世界領先位置 從1990年以來克隆出多種哺乳動物 胚胎細胞移植技術 意大利一位婦科醫(yī)生聲稱已克隆出一名女嬰 受到各國科學家的批評 三胚胎細胞克隆與體細胞克隆 1 胚胎細胞克隆 分離出一個胚胎細胞 將細胞核移植到去核的卵子內(nèi) 然后再將其移植到動物受體內(nèi)妊娠產(chǎn)子 體細胞克隆 多莉 的過程 先 與此同時 手術完成之后 然后 到1996年7月 多利羊 3 克隆的理論基礎 細胞的全能性 totipotenty 每個細胞都具有獨立生長發(fā)育 并形成