特殊毒性及其試驗與評價方法ppt課件.ppt

第二節(jié)生殖發(fā)育毒性及其試驗與評價方法 一 生殖毒性試驗與評定二 發(fā)育毒性試驗與評定 一 生殖毒性試驗與評定 外來化合物對生殖過程的損害作用 即生殖毒性 生殖毒性可發(fā)生于妊娠期 也可發(fā)生于妊娠前期和哺乳期 生殖毒性試驗主要研究外來化合物對生殖細胞發(fā)生 卵細胞受精 胚胎形成 妊娠 分娩和哺乳過程的損害及其評定 過去也稱為繁殖試驗 生殖毒性試驗的目的在于了解外源化學物及其代謝產物對機體成年哺乳動物的生殖功能和生育力的影響 多代繁殖試驗在整個生命期內接觸受試化學物 更符合人類實際生活中長期低劑量接觸食品添加劑 微量重金屬 農藥及環(huán)境污染物的情況 1 試驗方法原則生殖毒性試驗多用性成熟大鼠 也可用小鼠或家兔 大鼠自然受孕率較小鼠為高 較為理想 一般設三個劑量組 另設對照組 最高劑量組劑量應該超過預期人類實際接觸水平 希望能使親代動物出現輕度中毒 但不出現死亡或死亡率不超過10 也不能完全喪失生育能力 低劑量組的親代動物不應觀察到任何中毒癥狀 另設中間劑量組應僅能出現極為輕微的中毒癥狀 中間劑量與高劑量和低劑量應呈等比級數 動物接觸受試物的方式應參照人類實際接觸途徑 一般可混入飼料或飲水中 由動物攝取 也可采用灌胃或膠囊法 利用大鼠或小鼠進行試驗時 每組雌雄各16 20只 或雌性16 20只 雄性8 10只 2 試驗方法 三代兩窩生殖試驗大鼠斷奶或出生8周后 開始喂受試物或以其它方式與受試物接觸 共進行8 12周 即直到性發(fā)育成熟 相當出生后4個月左右 每周至少稱體重一次 記錄進食量并觀察有無中毒癥狀或死亡 將雌雄親代動物 F0 同籠交配 雌雄比例為1 1或2 1 直到受孕或進行3周為止 雌鼠受孕后即單籠飼養(yǎng) 繼續(xù)接觸受試物 交配3周后 如仍未受孕 則停止交配 并進行生殖器官病理學檢查 確定是否受孕的方法是每日清晨進行雌性動物陰道涂片 檢查有無精子 亦可檢查陰道有無陰栓出現 以確定受精日期 小鼠陰栓可在陰道口存留較長時間 但在大鼠極易脫落 次晨檢查時往往在籠下糞便盤中檢出 發(fā)現陰栓或檢出精子 即為受孕0日 也有作為受孕第1日 親代動物 F0 所生仔鼠為第一代 F1 出生后應檢查每窩幼仔數 死亡數以及肉眼可見幼仔畸形 出生后第4天和第21天逐個稱取重量 仔鼠斷奶后 母鼠休息10天 再與雄鼠交配一次 并生出第二窩仔鼠 親代共生出仔鼠兩窩 分別為F1a和F1b F1b出生后 將雄性親鼠淘汰 雌性親鼠繼續(xù)喂受試物 直至F1b出生后21天斷奶為止 F1a斷奶后觀察其發(fā)育情況 不再喂受試物 F1b斷奶后 繼續(xù)接觸受試物8 12周 直到性發(fā)育成熟 選出雌雄各16 20只 按前法進行交配 F1b所產第一窩幼仔為F2a F2a斷奶后 其母鼠F1b休息10天 再次交配 所生幼仔為F2b F2b斷奶后 將F1b淘汰 F2b交配處理方法與F1b相同 但F2b也可只交配一次 所產仔鼠為F3a 不再進行第二次交配 試驗結束 2 兩代一窩和一代一窩生殖試驗近年來許多國家與機構多規(guī)定采用兩代一窩或一代一窩試驗法 兩代一窩生殖試驗法基本程序與三代兩窩試驗法相同 但只進行到第二代F2 每代只交配一窩 兩代一窩生殖試驗 在上述各種生殖毒性試驗中 根據哺乳動物全部生育繁殖過程 可觀察下列4個指標 1 受孕率反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況 受孕率 100 妊娠雌性動物數 交配雌性動物數 三 觀察指標 2 正常分娩率反映雌性動物妊娠過程是否受到影響 正常分娩率 100 正常分娩雌性動物數 妊娠動物數 3 幼仔出生存活率反映雌性動物分娩過程是否正常 如分娩過程受到影響 則幼仔往往在出生4天內死亡 幼仔出生存活率 100 出生后4天存活幼仔數 分娩時出生幼仔數 4 幼仔哺乳成活率反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力 幼仔哺乳成活率 21天斷奶幼仔存活數 出生后4天幼仔存活數 100 四 結果判定 將試驗組動物各項觀察指標統(tǒng)計結果與對照組動物進行比較 如試驗動物在交配 妊娠 幼仔存活 幼仔發(fā)育 哺育 等方面受到影響 則說明受試物對動物繁殖功能有損害作用 二 發(fā)育毒性試驗與評定 1 基本概念發(fā)育毒性指出生前經父體和 或 母體接觸外源理化因素引起的在子代到達成體之前內出現的有害作用 包括結構畸形 生長遲緩 功能障礙及死亡 能造成發(fā)育毒性的物質稱為發(fā)育毒物 畸形 指出生前因素引起發(fā)育生物體的嚴重的解剖學上形態(tài)結構的缺陷 致畸性和致畸作用 均指在妊娠期 出生前 接觸外源性理化因素引起后代結構畸形的特性或作用 變異 是由遺傳和遺傳外因素控制的外觀變化 或由于分化改變而引起的中途歧異 2 發(fā)育毒性的表現 生長遲緩即胚胎與胎仔的發(fā)育過程在外來化合物影響下 較正常的發(fā)育過程緩慢 致畸作用由于外來化合物干擾 活產胎仔胎兒出生時 某種器官表現形態(tài)結構異常 致畸作用所表現的形態(tài)結構異常 在出生后立即可被發(fā)現 功能不全或異常即胎仔的生化 生理 代謝 免疫 神經活動及行為的缺陷或異常 功能不全或異常往往在出生后一定時間才被發(fā)現 因為正常情況下 有些功能在出生后一定時間才發(fā)育完全 胚胎或胎仔致死作用某些外來化合物在一定劑量范圍內 可在胚胎或胎仔發(fā)育期間對胚胎或胎仔具有損害作用 并使其死亡 具體表現為天然流產或死產 死胎率增加 發(fā)育毒性研究的目的是通過計數胚胎或胎仔吸收或死亡數 測量胎仔的重量和性別比 檢查外觀 內臟和骨骼的形態(tài) 來識別受試物有無對胚胎或胎仔的致死 致畸或其他毒性作用 最佳聯合方案是對成年動物進行染毒并包括子代從受精卵到性成熟所有生長發(fā)育階段 觀察期應貫穿一個完整的生命周期 以檢測近 遠期效應 最常選用的方案為三階段試驗 三段生殖試驗圖解 生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗 胚體 胎體毒性試驗 致畸試驗 出生前后發(fā)育毒性試驗 I階段試驗 雌雄交配前 受孕 雌性受精 雌性著床期間染毒研究對成年雌雄性的生殖功能 配子的發(fā)生及成熟 交配行為 受精 著床前的發(fā)育和著床的影響 階段試驗 從著床到硬腭閉合期間染毒研究對成年雌性生殖功能 胚胎發(fā)育 器官形成期的發(fā)育毒性 階段試驗 從著床到幼仔斷乳期間對孕 乳 母染毒從著床到子代性成熟的母體生殖毒性 妊娠 分娩和哺乳 和子代的發(fā)育毒性 胚胎 胎兒生長發(fā)育 新生幼仔宮外生活的適應性 斷乳前后的生長發(fā)育 獨立生活能力和性功能成熟 人 大鼠和家兔的致畸作用關鍵期的比較 短線表示 靶窗 3 發(fā)育毒性作用評價發(fā)育毒性主要表現為致畸作用 所以發(fā)育毒性作用評價主要是評價受試物的致畸作用 通過致畸試驗可以確定一種受試物是否具有致畸作用 致畸試驗是檢查受試外源化學物能否通過妊娠母體引起胚胎毒性或后代畸形的動物試驗 胚胎在器官形成期 可因受到化學物或放射性物質的作用 使細胞分化 器官形成和正常發(fā)育受到阻滯 以致出現胎仔器官的器質性缺陷而呈現畸形 1 母體效應 受試物對母體產生了損害作用 從而影響了正常妊娠 而不是對胚胎的直接損害 2 胚胎效應 受試物對胚胎的直接損害作用 3 出生前胎兒效應 出生胎兒出現外表或內臟畸形 4 出生后效應 引起子代的生理功能或生理結構的缺陷 如后天生長發(fā)育或生殖功能受影響 致畸作用包括 受試動物接觸外源化學物的方式與途徑應與人體實際接觸情況一致 一般多經口給予 雌鼠妊娠的第7 15天染毒 常用灌胃方式 試驗期間每2 3天稱取孕鼠體重 通過體重變化可觀察受試動物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況 受孕鼠的體重如持續(xù)增長 則表示妊娠過程及胚胎發(fā)育正常 如體重停止增長或下降 可能由于受試物的毒性作用或母體的其它原因 引起胚胎死亡或流產 傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗 1 動物選擇 2 劑量分組 3 動物交配處理 4 胎仔檢查 5 數據處理 6 結果評定 1 動物選擇致畸試驗的動物選擇 除參照毒性試驗中選擇動物的一般原則 食性和對受試物代謝過程與人類接近 體型小 馴服 容易飼養(yǎng)和繁殖及價廉 外 還應特別注意妊娠過程較短 每窩產仔數較多和胎盤構造及厚度與人類接近等特點 根據上述原則綜合考慮 致畸試驗可選用二種哺乳動物 一般首先考慮大鼠 此外可采用小鼠或家免 大鼠受孕率高 每窩產仔8 10只 易于得到足夠標本數 而且經驗證明 大鼠對大多數外來化合物代謝過程 基本與人類近似 故可首先考慮 小鼠自然畸形發(fā)生率較大鼠高 但低于家兔 對形成腭裂的致畸物更較敏感 家兔為草食動物 與人類代謝功能差異較大 妊娠期不夠恒定 有時延長至36天 自然畸形發(fā)生率也較高 2 劑量分組致畸試驗中劑量分組的一般原則是一方面要求出最大無作用劑量 以及引起致畸的閾劑量 同時還要保持母體生育能力 不致母體大批流產和過多胚胎死亡 也應避免較多母體死亡 高劑量組 LD50的1 5或1 3 原則是引起母體輕度中毒 死亡率 10 低劑量組 LD50的1 30 1 100 原則是不引起母體的任何中毒癥狀 中劑量組 在高 低劑量之間成等比關系 原則是只引起母體極輕微毒性反應 或者以實際接觸量為低劑量 以其10倍量為高劑量 3 動物交配處理將性成熟雌雄動物按雌雄l 1或2 1比例同籠交配 每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組 由于致畸作用有極為明確的敏感期 應精確掌握動物接觸受試物的時間 必須在器官發(fā)生期 如提前在著床前接觸 將影響受精卵的著床 如在胚胎發(fā)育的最初階段 例如裂卵期和囊胚期接觸受試物 往往可使胚胎死亡 不能造成畸形 如在器官發(fā)生期以后接觸受試物 則各種器官已發(fā)育成熟 致畸作用不易表現 只有器官發(fā)生期的胚胎 對致畸物最為敏感 易于出現畸形 接觸受試物的方式與途徑應與人體實際接觸情況一致 一般多經口給予 也可采用灌胃方式 以保證劑量準確 效果較混入飼料喂給為好 在特殊情況下 也可采用腹腔注射法 效果與經口近似 試驗期間每2 3天稱取母鼠體重 一方面可根據體重增長 隨時調整給予受試物的劑量 同時也可觀察受孕動物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況 受孕動物的體重如持續(xù)增長 則表示妊娠過程及胚胎發(fā)育正常 如體重停止增長或下降 可能由于受試物的毒性作用或母體的其它原因 引起胚胎死亡或流產 4 胎仔檢查 鼠類有食畸形胎仔的習性 應在預期分娩前1d 2d處死母鼠進行檢查 一般大鼠在受孕后第19 20d 小鼠第18 19d 剖檢前稱量并記錄母鼠最終體重 常采用頸椎脫臼法或斷頭處死法處死動物 從腹中線剖腹 暴露子宮和卵巢 為胎仔檢查做準備 活產胎仔取出后 先檢查性別 逐只稱重 并按窩計算平均體重 然后由下列幾方面進行畸形檢查 外觀畸形肉眼檢查 例如露腦 肉眼檢查內臟及軟組織畸形 例如腭裂 骨骼畸形檢查 例如顱頂骨缺損 分叉肋等 畸形檢查只限活產胎仔 以上檢查只能檢出結構與形態(tài)異常的畸形 不能檢出可能發(fā)生的生化功能或神經行為缺陷 因此有人主張將試驗雌鼠保留1 4左右 待其自然分娩 并將出生幼仔飼養(yǎng)觀察 至少到斷奶 以便檢查可能存在的先天缺陷和生理功能異常 表7 3常見的外觀畸形 表7 4常見的內臟畸形 表7 5常見的骨骼畸形 表7 6致畸試驗記錄內容 5 數據處理在致畸試驗結果評定時 主要計算畸胎總數和畸形總數 計算畸胎總數時 每一活產幼仔出現一種或一種以上畸形均作為一個畸胎 計算畸形總數時 在同一幼仔每出現一種畸形 即作為一個畸形 如出現二種或二個畸形 則作為二個畸形計 并依此類推 計算時還要對劑量效應 反應 關系加以分析 更重要的是按下列指標將各劑量組與對照組結果進行比較 活產幼仔平均畸形出現數 即根據出現的畸形總數 計算每個活產幼仔出現的畸形平均數 對較為重要的畸形 還可分別單獨進行計數 活產幼仔平均畸形出現數 畸形總數 活產幼仔總數 畸形出現率 即作為畸胎的幼仔在活產幼仔總數中所占的百分率 出現畸形的胎仔總數畸胎出現率 100 活產胎仔總數 母體畸胎出現率 即出現畸形胎仔的母體在妊娠母體總數中所占的百分率 計算出現畸形母體數時 同一母體無論出現多少畸形胎仔或多少種畸形 一律按一個出現畸胎的母體計