PCR引物設(shè)計(jì)及試題分析_張卓鵬.pdf

PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技 術(shù) 它能以極少量的DNA為模板 在幾小時(shí)內(nèi) 復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝 這項(xiàng)技術(shù)有效 地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難于對(duì) 樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題 被廣泛地應(yīng)用于 遺傳疾病的診斷 刑偵破案 古生物學(xué) 基因 克隆和DNA序列測(cè)定等各方面 近年來(lái) 有 關(guān)PCR引物的考查成為高考生物 基因工程 中的一個(gè)亮點(diǎn) 對(duì)學(xué)生思維的靈活性和臨場(chǎng) 答題的機(jī)敏性提出了更高的要求 下面擬通 過(guò)介紹PCR引物設(shè)計(jì)的多個(gè)原則 望能拓寬 學(xué)生解題的思路 遷移知識(shí) 靈活解題 一 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合 適的核苷酸片段 使其能有效地?cái)U(kuò)增模板 DNA序列 因此 引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR 的特異性與成功與否 要設(shè)計(jì)引物 首先要找到DNA序列的保 守區(qū) 同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增片段的單鏈?zhǔn)欠?形成二級(jí)結(jié)構(gòu) DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指兩條脫 氧多核苷酸鏈反向平行盤繞所形成的雙螺旋 結(jié)構(gòu) 如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu) 就 要避開它 如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu) 那 就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物 然后在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物 一般引物長(zhǎng)度為15 30個(gè)堿基對(duì) 擴(kuò)增片段 長(zhǎng)度為100 600個(gè)堿基對(duì) 引物序列中 G C 含量一般為40 60 而且四種堿基的分布最好是隨機(jī)的 不 要有聚嘌呤或聚嘧啶存在 否則引物的設(shè)計(jì) 就不合理 應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物 同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性 一般一 對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ) 引物確定以后 可以對(duì)引物進(jìn)行必要的 修飾 例如可以在引物的5 端加酶切位點(diǎn)序 列 標(biāo)記生物素 熒光素 地高辛等 這對(duì)擴(kuò)增 的特異性影響不大 但3 端絕對(duì)不能進(jìn)行任 何修飾 因?yàn)橐锏难由焓菑? 端開始的 這 里還需提醒的是3 端不要終止于密碼子的第 3位 因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并 會(huì)影響擴(kuò) 增的特異性與效率 綜上所述 可以歸納出十條PCR引物的 設(shè)計(jì)原則 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì) 并 具有特異性 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu) 引物長(zhǎng)度一般在15 30個(gè)堿基對(duì)之間 G C 含量在40 60 之間 堿基要隨機(jī)分布 引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ) 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ) 引物5 端可以修飾 引物3 端不可修飾 引物3 端要避開密碼子的第3位 例1下圖1為采用PCR技術(shù)從 DNA分子中獲取目的基因并擴(kuò)增的部分過(guò) 程 下圖2為獲得抗蟲棉的技術(shù)流程 其中卡 那霉素抗性基因 kan 常作為標(biāo)記基因 只有 含卡那霉素抗性基因的細(xì)胞才能在卡那霉素 培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 請(qǐng)據(jù)圖回答 張卓鵬 PCR引物設(shè)計(jì)及試題分析 圖1 生物 解題方略 97 1 PCR中用到的引物是一段已知脫氧 核苷酸序列的DNA單鏈 為保證復(fù)制正常進(jìn) 行 引物必須符合的基本要求是除了與目的 基因一端互補(bǔ)外 還必須具備 的特點(diǎn) 根據(jù)圖1分析 至少經(jīng)過(guò) 次循 環(huán)復(fù)制過(guò)程 才可從DNA分子中分離出目的 基因片段 2 A過(guò)程需要的酶為 3 B過(guò)程及其結(jié)果體現(xiàn)了質(zhì)粒作為載 體必須具備的兩個(gè)條件是 4 為促進(jìn)土壤農(nóng)桿菌對(duì)重組質(zhì)粒的吸 收 常用 處理土壤農(nóng)桿菌 5 C過(guò)程所用的培養(yǎng)基除含有必要營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì) 瓊脂外 還必須加入 有 利于愈傷組織形成 6 若該轉(zhuǎn)基因植株自交后代的具有卡 那霉素抗性基因的植株比例為3 4 說(shuō)明卡那 霉素抗性基因已存在于該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的 上 若將該轉(zhuǎn)基因植株的花藥在卡 那霉素培養(yǎng)基上作離體培養(yǎng) 則獲得的再生 植株群體中抗卡那霉素型植株占 答案 1 相互之間不能互補(bǔ)3 2 限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 3 具有標(biāo)記基因 能在宿主細(xì)胞中復(fù) 制并穩(wěn)定保存 4 Ca2 5 植物激素 或生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素 6 染色體 或核DNA 只寫DNA不得 分 100 創(chuàng)新一以往關(guān)于PCR技術(shù)引物的問(wèn)法 常為 與體內(nèi)DNA復(fù)制相比 PCR反應(yīng)體系需 加入 種引物和 答案為 2 耐高溫的DNA聚合酶 需2種引物 學(xué)生往往是從DNA復(fù)制時(shí)兩條母鏈均作模板 來(lái)考慮 2種引物除分別與目的基因一端互補(bǔ) 外 還必須具備 的特點(diǎn) 學(xué)生就難 于得出結(jié)論 試想2種引物如果本身相互之間 能夠互補(bǔ) 形成了雙鏈 這就難于保證它們?cè)?分別與目的基因一端互補(bǔ)配對(duì)了 創(chuàng)新二以往關(guān)于PCR技術(shù)DNA復(fù)制有 關(guān)計(jì)算的問(wèn)法常為 假如引物都用3H標(biāo)記 從 理論上計(jì)算 DNA片段經(jīng)3次擴(kuò)增所得的8個(gè) DNA分子中含有3H標(biāo)記的占 假定 DNA片段含200對(duì)脫氧核苷酸 經(jīng)3次擴(kuò)增 從 理論上計(jì)算需要 個(gè)游離脫氧核苷 酸等 這些問(wèn)題學(xué)生常常通過(guò)DNA半保留復(fù) 制特點(diǎn)容易求到 現(xiàn)改問(wèn) 根據(jù)圖1分析 至少 經(jīng)過(guò) 次循環(huán)復(fù)制過(guò)程 才可從 DNA分子中分離出目的基因片段 有的學(xué)生 認(rèn)為復(fù)制一次就行了 這是沒(méi)有審清題意 目 的基因片段 造成的 事實(shí)上 第一次復(fù)制形 成的子鏈比目的基因片段的一條鏈要長(zhǎng) 見 圖1 由此子鏈為模板再進(jìn)行復(fù)制 形成的子 鏈正好和目的基因的一條鏈一樣長(zhǎng) 再由和 目的基因一條鏈一樣長(zhǎng)的子鏈為模板進(jìn)行復(fù) 制 形成的雙鏈DNA片段這才是目的基因片 段 故至少經(jīng)過(guò)3次循環(huán)復(fù)制過(guò)程 例2請(qǐng)回答基因工程方面的有 關(guān)問(wèn)題 1 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 其原 理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似 如下圖所示 圖中引物為單鏈DNA片段 它是子鏈合 成延伸的基礎(chǔ) 從理論上推測(cè) 第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含 圖2 生物 解題方略 98 有引物A的DNA片段所占的比例為 在第 輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn) 兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段 2 設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一 某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物 只標(biāo)注了部分堿基 序列 都不合理 如下圖 請(qǐng)分別說(shuō)明理由 第1組 第2組 3 PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚 合酶 下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合 酶的功能 這是因?yàn)?4 用限制酶EcoRV Mbol單獨(dú)或聯(lián)合 切割同一種質(zhì)粒 得到的DNA片段長(zhǎng)度如下 圖 1 kb即1 000個(gè)堿基對(duì) 請(qǐng)置畫出質(zhì)粒上 EcoRV Mbol的切割位點(diǎn) 答案 1 15 16三 2 引物I和引物 局部發(fā)生堿基互補(bǔ) 配對(duì)而失效引物 自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局 部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效 3 DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸 連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上 4 見下圖 創(chuàng)新一 1 問(wèn)中 如僅經(jīng)過(guò)一輪循環(huán) 通過(guò)圖示DNA半保留復(fù)制形成兩個(gè)DNA片 段 一個(gè)含引物A 一個(gè)含引物B 則含引物A 的DNA片段所占的比例為50 如再經(jīng)一輪 循環(huán) 分別又用引物A 引物B 學(xué)生易思維定 勢(shì) 類推得出第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A 的DNA片段所占的比例仍為50 事實(shí)上 經(jīng) 過(guò)第四輪循環(huán) 共形成16個(gè)DNA片段 只有最 初需要引物B與之配對(duì)的模板鏈作模板合成 的DNA片段中有引物B 沒(méi)有引物A外 其余 的模板鏈合成的DNA片段中都將含有引物 A 引物A要么在模板鏈上 要么在剛合成的 子鏈中 故正確答案為15 16 本小問(wèn)的創(chuàng)新 之處在于用到DNA復(fù)制半保留的特點(diǎn) 但又 超出該特點(diǎn) 創(chuàng)新二 1 問(wèn)中 與例1 1 問(wèn)中 至少 經(jīng)過(guò) 次循環(huán)復(fù)制過(guò)程 才可從 DNA分子中分離出目的基因片段 相似 至 少在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中才開始出現(xiàn)兩條脫氧 核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段 本小問(wèn)的創(chuàng)新之 處在于單靠理解DNA的復(fù)制原理是不夠的 解題時(shí)需畫草圖 增強(qiáng)對(duì)引物作用的認(rèn)識(shí) 創(chuàng)新三 2 問(wèn)中已強(qiáng)調(diào)設(shè)計(jì)的兩組引 物都不合理 在不熟悉PCR引物設(shè)計(jì)原則的 情況下 分析推理的確有難度 學(xué)生一般知道 引物相互之間不能互補(bǔ) 而在第1組引物中 引物 和引物 僅有兩個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ) 要找理由 也只能是它了 而在第2組引物中 引物 和引物 還沒(méi)有兩個(gè)連續(xù)的堿基互 補(bǔ) 但引物 自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互 補(bǔ)配對(duì) 也就因無(wú)法與模板鏈結(jié)合而失效 這 就需要學(xué)生從圖表中獲取豐富的信息臨場(chǎng)發(fā) 生物 解題方略 99 揮了 本小問(wèn)的創(chuàng)新之處在于不僅考查了引 物之間不能有多個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)外 還考 查了引物自身也不能有多個(gè)連續(xù)堿基的互 補(bǔ) 需要學(xué)生靈活遷移 創(chuàng)新四 3 問(wèn)中已清楚說(shuō)出PCR技術(shù) 中所使用的DNA聚合酶具有熱穩(wěn)定性的特 點(diǎn) 其具體功能學(xué)生大多似懂非懂 一般只知 道與形成磷酸二酯鍵有關(guān) 圖中是將兩個(gè)游 離的脫氧核苷酸形成磷酸二酯鍵 現(xiàn)要找出 錯(cuò)誤原因 其關(guān)鍵還是在于考查引物的作用 DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA 而只能 從3 端延伸DNA鏈 因此DNA復(fù)制需要引物 本小問(wèn)的創(chuàng)新之處在于不再是簡(jiǎn)單地考查 PCR中學(xué)生普遍知道的所使用的DNA聚合酶 具有熱穩(wěn)定性的特點(diǎn) 而在于考查DNA聚合 酶以及引物的真實(shí)作用 項(xiàng)目理論基礎(chǔ)意義實(shí)例 物質(zhì)循環(huán)再生原理物質(zhì)循環(huán) 可避免環(huán)境污染及其對(duì)系 統(tǒng)穩(wěn)定和發(fā)展的影響 無(wú)廢棄物農(nóng)業(yè) 物種多樣性原理生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性 生物多樣性程度高 可提高 系統(tǒng)的抵抗力穩(wěn)定性 提高 系統(tǒng)的生產(chǎn)力 三北 防護(hù)林建設(shè)中的問(wèn) 題 珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的生物 多樣性問(wèn)題 協(xié)調(diào)與平衡原理生物與環(huán)境的協(xié)調(diào)與平衡 生物數(shù)量不超過(guò)環(huán)境承載力 可避免系統(tǒng)的失衡和破壞 太湖富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題 過(guò)渡放 牧等 整體性原理社會(huì) 經(jīng)濟(jì) 自然復(fù)合系統(tǒng) 統(tǒng)一協(xié)調(diào)各種關(guān)系 保障系 統(tǒng)的平衡與穩(wěn)定 林業(yè)建設(shè)中自然系統(tǒng)與社 會(huì) 經(jīng)濟(jì)系統(tǒng)的關(guān)系問(wèn)題 系統(tǒng)學(xué)和工程學(xué)原理 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)決定功能原理 分布式優(yōu)于集中式和環(huán)式 改善和優(yōu)化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)以 及改善功能 ?；~塘 系統(tǒng)整體性原理 整體大于 部分 保持系統(tǒng)很高的生產(chǎn)力 珊瑚礁藻類和珊瑚蟲的關(guān) 系 李進(jìn)京 正確理解生態(tài)工程 對(duì)生態(tài)工程及其中生態(tài)農(nóng)業(yè)的考查在高考試題中常常涉及 特別是關(guān)生態(tài)工程的原理的 理解及在實(shí)例中的應(yīng)用考查更較為常見 因此下面對(duì)生態(tài)工程的幾個(gè)原理進(jìn)行分析 一 生態(tài)工程的幾個(gè)原理 二 幾個(gè)基本原理的理解 1 生態(tài)