（物理電子學(xué)專業(yè)論文）微流路醫(yī)學(xué)診斷芯片的制作及研究.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 微全分析系統(tǒng)( u t a s ) 研究是目前醫(yī)用儀器發(fā)展的重要方向和前沿領(lǐng)域， 在疾病檢測、環(huán)境監(jiān)測、藥物篩選等方面有著重要的意義。尤其是在醫(yī)學(xué)診斷方 面，微全分析系統(tǒng)可有效的降低污染，減小試劑消耗，降低成本，實(shí)現(xiàn)自動化。 目前，關(guān)于微全分析系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)疾病診斷方面的研究剛剛起步，本論文旨在對微 全分析系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)診斷方面的應(yīng)用進(jìn)行探究。 用于醫(yī)學(xué)診斷的微全分析系統(tǒng)主要可分為三個部分：樣品前處理，產(chǎn)物擴(kuò)增 檢測( 包括電泳或雜交檢測) 。其主要技術(shù)是制作微流路的生物芯片 ( m i c r o f l u i d i cb i o c h i p ) ，針對這些，本文主要的研究內(nèi)容如下： 1 制作了兩類基于s p e ( s o l i dp h a s ep x t r a c t i o n ) 法的d n a 提取芯片一硅 芯片和磁珠吸附的p d m s 芯片。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明：這兩種方法都可有效的對p c r 產(chǎn)物 中的d n a 進(jìn)行回收，同時還利用硅芯片進(jìn)行了酵母菌的d n a 提取，取得了較好的 結(jié)果。 2 對本室制作的p c r 芯片進(jìn)行了驗(yàn)證，主要是進(jìn)行熒光p c r 檢測，建立了 一套適宜做熒光p c r 的方法和系統(tǒng)，為實(shí)時熒光檢測研究創(chuàng)造了條件。 3 制作并研究了芯片上的免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。在p d m s 芯片上使用磁珠介導(dǎo)，成 功的完成了人i g g 在磁珠上的固定、人i g g 和熒光標(biāo)記的羊抗人i g g 在芯片上 的免疫反應(yīng)。 4 制作并研究了p d m s 芯片上的d n a 分子雜交反應(yīng)。針對p d i s 新型材料， 試驗(yàn)了兩種d n a 分子的固定方法。確定了生物素一親和素介導(dǎo)的d n a 分子固定化 方法，并使用此芯片和固定方法進(jìn)行了芯片上的d n a 雜交反應(yīng)。同時摸索出消除 非特異性信號，提高反應(yīng)特異性的方法，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 關(guān)鍵詞：p d m s 磁珠樣品處理p c r d n a 免疫雜交 a b s t r a c t d e s i g n a n df a b r i c a t i o no fm i c r o f l u i d i c d i a g n o s t i cs y s t e m s c h e n x i a n g ( p h y s i c a le l e c t r o n i c s ) ( d i r e c t e db yp r o f e s s o rd a f uc u d a b s t r a c t t h ea r e ao fm i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，a l s oc a l l e d “l(fā) a bo nac h i p ”，o rm i n i a t u r i z e d a n a l y s i ss y s t e m s ，i sg r o w i n gr a p i d l y ，e s p e c i a l l yi nt h ef i e l do f c l i n i c a ld i a g n o s t i c s t h e p r i n c i p a l ea d v a n d a g e sa s s o c i a t e dw i t hu - t a si n c l u d es a v i n gt i m ea n dc o s t ，s e v e r a l a n a l y s e sc a r lb ec o m p l e t e ds i m u l t a n e o u s l ya n da u t o m a t i c a l l y t h em i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m sa r eb a s e do nt h em i c r o f l u i d i c si n t e r g r a t e dc h e m i c a l p r o c e s s i n ga n da n a l y s i s ，t h o u g hs t i l li nm a n yw a y s j ni t sj n f a n c y i n t e r e s ti nt h i sf i e l d h a sg r o w ne x p l o s i v e l yo v e rt h el a s t d e c a d e s t y p i c a lm i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s u s e df o rc l i n i c a ld i a g n o s t i c sa r eo f t e nc o m p o s e do ft h r e ep a r t s ：s a m p l ep r e p a r a t i o n ； c h e m i c a la m p l i f i c a t i o na n dd e t e c t i o n ( i n c l u d i n ge l e c t r o p h o r e s i sa n dh y b r i d i z a t i o n ) t h i sd i s s e r t a t i o nm a i n l yf o c u s e so n s t u d y i n gt h e s et h r e ep a r t s 1 t w oi y p e so fd n a p u r i f i c a t i o nc h i p sb a s e do nt h em e t h o do fs p e ( s o l i dp h a s e e x t r a c t i o n ) h a v eb e e nf a b r i c a t e da n ds t u d i e d o n ew a sf a b r i c a t e db ys i l i c o nu s i n g m e m s ( m i c r o - e l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m ) t e c h n o l o g y ；t h eo t h e rw a sf a b r i c a t e db v p d m s ( p o l y d e m e t h y l s i l o x a n e ) t h r o u g hs o f tl i t h o g r a p h y u s i n gm a g n e t i cb e a d st o p u r l f yd n a b o t hc h i p sw e r eu s e d t op u r i f yt h ed n af r o mp c r p r o d u c t s t h es i l i c o n c h i pw a s a l s ou s e dt op u n f yd n af r o my e a s tb a c t e r i a 2 b i o l o g i c a le x p e r i m e n t sh a v eb e e nc o n d u c t e dt ot e s tt h ep c r c h i pa n d af l u o r e s c e n t m e t h o dh a sb e e n d e v e l o p e d 3 ，a ni m m t m o c h i pw a sf a b r i c a t e db yp d m su s i n gs o f tl i t h o g r a p h y m e t h o d sw e - e d e v e l o p e d t oi m m o b i l i z eh u m a n i g g o nt h es u r f a c eo f m a g e n e t i cb e a d s t h ei m m u n o r e a c t i o nw a ss u c c e s s f u l l yp e r f o r m e db e t w e e nt h eh u m a ni g oi m m o b i l i z a e do nt h e m a g n e t i cb e a d sa n df f f cl a b e l e ds h e e pa n t ih u m a n 垃gi nt h ec h a n n e l 4 p d m s g l a s sm i c r o c h i pu s e df o rp e r f o r m i n gd n a h y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n h a sb e e n f a b r i c a t e da n ds t u d i e d b i o t i n - a v i t i n s y s t e r a ( b a s ) w a su s e dt oi m m o b i l i z ed n a o n t h ep d m sc h a n n e lc o m p a r e dt ot h ed i r e c ti m m o b i l i z a t i o nm e t h d s t h e h y b r i d i z a t i o n r e a c t i o na l s oh a sb e e ne x a m i n e db e t w e e ni m m o b i l i z e d p r o b e a n d t a r g e td n a k e yw o r d s ：p d m s d n a s a m p l e p r e p a r a t i o n p c r a n t i b o d y h y b r i d i z a t i o n 第1 章緒論 1 1 微流路醫(yī)學(xué)診斷芯片簡介 1 1 1 診斷芯片研究的內(nèi)容 第1 章緒論 診斷芯片研究的內(nèi)容是使用醫(yī)學(xué)診斷學(xué)技術(shù)，在微芯片上進(jìn)行疾病檢測，以 達(dá)到預(yù)防和診斷治療的目的。 在發(fā)展中國家，近一半的死亡病例由傳染病所導(dǎo)致，發(fā)展中國家現(xiàn)有的很多 診斷技術(shù)存在著操作不便、費(fèi)用高昂等缺陷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、單克隆抗體等分 子診斷技術(shù)如能得到更廣泛的使用，進(jìn)一步降低成本，將可以提高發(fā)展中國家傳 染病診斷的水平，使死亡率降低。 醫(yī)學(xué)診斷學(xué)包括基因診斷、免疫學(xué)診斷和細(xì)胞學(xué)診斷等多方面。目前用于醫(yī) 學(xué)診斷的微流路芯片主要是基于分子學(xué)診斷的，即基因芯片和免疫芯片，所以在 這里簡單介紹基因診斷和免疫學(xué)診斷。 基因診斷 除了朊病毒( 如瘋牛病病毒) 等生物以外，幾乎所有的生物，從病毒、單細(xì) 胞的細(xì)菌到人類自身的細(xì)胞，都含有遺傳物質(zhì)核酸，核酸帶有所有生命體的基因 信息。所以不同物種之間的d n a 有其獨(dú)特性。近三、四十年由于各種觀念韻突破 及研究方法的推出，配合計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，分子生物的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨 床醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。 現(xiàn)代化的醫(yī)學(xué)中心將有分子生物實(shí)驗(yàn)室的設(shè)立，備有d n a 提取設(shè)備，d n a 擴(kuò)增， 電泳或雜交檢測，同時結(jié)合數(shù)據(jù)快速檢測儀和生物數(shù)據(jù)信號處理儀所組成的計(jì)算 機(jī)化處理系統(tǒng)。對于基因缺陷的遺傳疾病可經(jīng)由“缺失”、“過多”、“點(diǎn)突變一等 特性進(jìn)行診斷，亦可進(jìn)行家族連鎖分析。 如使用致癌基因的探針，可進(jìn)行惡性腫瘤的診斷及研究。利用聚合鎊鏈反應(yīng) ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技術(shù)，可將小量d n a 于短時間內(nèi)大量復(fù)制， 除了可檢測細(xì)胞內(nèi)基因形態(tài)的變化，也可由末稍血液或骨髓找出極少量的癌細(xì) 第1 章緒論 胞，故可用于癌癥復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的早期診斷。 人類的遺傳標(biāo)記各有其特異性，只要少量的血液、尿液、痰液、唾液等，甚 至是一根毛發(fā)，配合p c r 技術(shù)即可得到足量d n a 分析其遺傳特征。除了可用于器官 移植方面，對于法醫(yī)學(xué)的刑事鑒定上也有著重要的意義。 分子生物技術(shù)亦可應(yīng)用于病原微生物( 如后天性免疫不全病毒，及其它一些 常見病毒、細(xì)菌、真菌等) 的偵測，檢定其毒性、分型或測其對于抗生索的抗藥 性等，不僅可增加疾病的診斷率且可以縮短診斷時間，亦可解決一些病原菌不易 培養(yǎng)的問題。另外早期偵測出抗藥性菌種可提供醫(yī)生選擇最佳的治療方法及作為 治療成效的評估。 d n a 診斷法具有準(zhǔn)確、快速、高靈敏度等特點(diǎn)，使得此種技術(shù)廣為應(yīng)用于臨 床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上。分子檢驗(yàn)的大量運(yùn)用是未來檢驗(yàn)的新趨勢。 免疫學(xué)診斷 免疫學(xué)檢測技術(shù)是感染病原檢測的主要方法。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的原理是：外來致 病微生物的特異性蛋白為抗原，人體針對這種抗原的特異性免疫球蛋白為抗體。 抗原、抗體在體內(nèi)會發(fā)生對應(yīng)的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室可以用嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件，在體 外模擬這種免疫反應(yīng)。如果抗原、抗體中一種是已知的，就可以檢測另一種是否 存在。比如，可以在體外用乙型肝炎病毒特異抗體檢測病人血清，如果發(fā)生了免 疫反應(yīng)，便可以通過指示反應(yīng)指示出來，最終說明病人受到了乙肝病毒感染。 常用的兩個免疫實(shí)驗(yàn)是免疫熒光實(shí)驗(yàn)( i m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y ，i f a ) 和酶 聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b a n t a s s a y ，e l i s a ) 。免疫熒光實(shí)驗(yàn) 和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的區(qū)別只是指示反應(yīng)不同。免疫熒光實(shí)驗(yàn)用熒光素來指示， 而酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)用過氧化物酶交聯(lián)色原顯色。兩種反應(yīng)的靈敏度很好，特異 性也非常高。 分子醫(yī)學(xué)診斷學(xué)有著極其重要的意義，而開發(fā)快速、準(zhǔn)確、簡便、成本低 廉的醫(yī)學(xué)診斷芯片對于我們這個人口眾多，醫(yī)療水平還不發(fā)達(dá)的國家尤其有著重 要的現(xiàn)實(shí)意義。以s a r s ( s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e ) 病毒為例。其病 毒剛出現(xiàn)時，病毒感染的機(jī)理和治療措旅尚不明確，因此對s a r s 病毒進(jìn)行p c r 檢測及免疫學(xué)檢測是控制疾病流行的主要措施，由于s a r s 病毒感染性極強(qiáng)。檢 第1 章緒論 測結(jié)果污染性較大，成本也較高，因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確、一次性使用的微流控微 全分析診斷芯片極有必要。雖然現(xiàn)在國內(nèi)外尚沒有較成熟的基于醫(yī)學(xué)診斷的微流 控芯片，但這是醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展趨勢，必將對人類的生活產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義。 1 。1 。2 徽流路醫(yī)學(xué)診斷芯片妁簡介及意義 微流路醫(yī)學(xué)診斷芯片是生物芯片一個新的發(fā)展方向。生物芯片是近十年來 迅速發(fā)展起來的一種嶄新的微器件或微系統(tǒng)，它將在2 1 世紀(jì)給生物、化學(xué)分析 和醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)帶來一場革命。 目前，生物芯片已出現(xiàn)多種類型和結(jié)構(gòu)，制造生物芯片也有多種技術(shù)。最 有代表性的是二維微陣列結(jié)構(gòu)生物芯片，這種芯片采用微電子集成電路( i c ) 制 造工藝技術(shù)或點(diǎn)樣印刷、噴墨技術(shù)來制造。用i c 技術(shù)可制作高、中、低不同d n a 探針密度的芯片；而點(diǎn)樣印刷和噴墨技術(shù)主要制作廉價的中低密度d n a 探針點(diǎn) 陣芯片。另外一種類型芯片是三維微結(jié)構(gòu)芯片，是采用微電子機(jī)械系統(tǒng)( m e m s ) 技術(shù)制造的帶有微流路的生物芯片。這種生物芯片可以具有單一功能，也可以是 集成化多功能的微系統(tǒng)。 生物芯片技可進(jìn)行生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)中的各種生物化學(xué)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對基因、 配體、抗原等生物活性物質(zhì)高效、快捷的測試和分析。它的出現(xiàn)將給生命科學(xué)、 醫(yī)學(xué)、化學(xué)、新藥開發(fā)、生物化武器、司法鑒定、食品與環(huán)境監(jiān)督等眾多領(lǐng)域帶 來巨大的影響。 目前，生物芯片在疾病診斷方面的研究和應(yīng)用剛開始，與常規(guī)的生物檢測 手段相比，生物芯片技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)：由于尺寸的縮小，意味著更少的試劑消耗； 可以同時進(jìn)行多個樣品的處理，而且每個樣品處理的時間更快，縮短了整個檢測 所需的時間：生物芯片的集成化也減小了試驗(yàn)的不確定因素；而由于自動化程度 的提高和整合，對專業(yè)技術(shù)人員的要求會降低；在整個過程中減少了對試劑的接 觸，因此增強(qiáng)了安全性，減少了污染。另外就是體積小。攜帶方便。因此生物芯 片在臨床應(yīng)用上有著相當(dāng)大的優(yōu)勢。目前在臨床診斷上應(yīng)用的生物芯片主要可以 分為兩類： ( 1 ) 微陣列的生物芯片( m i c r o a r r a yc h i p ) 。此類芯片是將d n a 或蛋白質(zhì)等 第l 章緒論 固定在芯片上，利用雜交反應(yīng)對生物樣品進(jìn)行檢測，從功能上分有兩類。 序列芯片( s e q u e n c ec h i p ) ：各類文獻(xiàn)中討論最多的基因芯片就是此類 芯片。最早是h y s c q 和a f f y m e t f i x 公司制作這種芯片。其原理是：將通常為 2 0 個堿基的d n a 片斷分子固定在微芯片上，靶d n a 導(dǎo)入到芯片里，迸行 雜交反應(yīng)，通過雜交結(jié)果確定靶d n a 的序列。用從正常人基因組中分離出 的d n a 與d n a 芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜。用從病人基因組中分離出的 d n a 與d n a 芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜， 就可以得出病變的d n a 信息。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏 感、經(jīng)濟(jì)、平行化、自動化等特點(diǎn)，將成為一項(xiàng)現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。例如， a f f y m e t r i x 公司，把p 5 3 基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制 成p 5 3 基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。又如，h e l l e r 等構(gòu)建了9 6 個基因的e d n a 微陣，用于檢測分析風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎( r a ) 相關(guān)的基因，以 探討d n a 芯片在感染性疾病診斷方面的應(yīng)用?，F(xiàn)在，肝炎病毒檢測診斷芯 片、結(jié)核桿菌耐藥性檢測芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等一系列診 斷芯片逐步開始進(jìn)入市場。 表達(dá)蒼片( e x p r e s s i o nc h i p ) ：它的原理是通過檢測某一特定基因產(chǎn)生的 m r n a 的數(shù)量來確定此基因的表達(dá)水平。此類芯片對診斷和治療與基因相關(guān) 的疾病很有用處，特別是一些癌癥。具有代表性的是v y s i s 和s y n t c n i ( f r 鋤o n t ，c a ) 兩家公司的表達(dá)芯片產(chǎn)品和配套設(shè)施。 ( 2 ) 微流控生物芯片( m i c r o f l n i d i e b a s e db i c r o c h i p ) ：d n a 或蛋白質(zhì)在芯片內(nèi)流 動，反應(yīng)。并通過電泳或雜交等方法被檢測。近年來，在這方面的研究發(fā)展 很快，如檢測g l u c o s e ，l a c t i ca c i d 和a s c o r b i ca c i d 的芯片【”，在疾病診斷 方面，此類芯片有很廣闊的應(yīng)用前景，如檢測致病因子等方面。其發(fā)展趨勢 是在芯片上集成多種功能，使其能串行或并行處理多種生物反應(yīng)。如微流體 d n a 分析芯片常整合生物醫(yī)學(xué)樣品處理，生化反應(yīng)，如：p c r 反應(yīng)，d n a 酶消化 反應(yīng)和d n a 檢測等多種功能在一個芯片上。 4 第l 章緒論 圖1 1 芯片結(jié)構(gòu)示意圖 如圖1 1 所示，為此類蒼片的典型結(jié)構(gòu)。目前，此類芯片已經(jīng)取得了很大的 發(fā)展，使常規(guī)的試劑用量降到微升級，納升級甚至是皮升級，樣品和試劑的消耗 都大大的減少，反應(yīng)速度加快，并且展示了向自動化和并行處理多個樣品的可 能性?；谖⒘髀返纳镄酒ㄓ眯院透咝园l(fā)展，各種各樣的芯片正在 被研制，而微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，對藥物研制開發(fā)，臨床醫(yī)學(xué)診斷，藥物釋放， 組織工程學(xué)和生物武器等領(lǐng)域都有極大的推動作用。無疑將帶來分離檢測技術(shù)的 一場革命。 微流控芯片的加工技術(shù)，材料以及流體控制方式也引起了越來越多的關(guān)注。 如對材料的選擇上，除了傳統(tǒng)的硅，玻璃等材料外，近年來塑性材料制作的微流 控系統(tǒng)也得到了很大的發(fā)展，而加工技術(shù)除了傳統(tǒng)的微機(jī)械加工技術(shù)外，還有注 射成型，注模成型法，激光融合法等。目前有許多公司和研究單位從事微流控系 統(tǒng)的研究，比較有代表性的如a c l a r a 、a g i l e n t 、c a l i p e r 以及c e p h e i d 等公司。 圖1 _ 2a g l l e n t2 1 0 0 生物分析儀 第1 章緒論 1 2 微流路診斷芯片的工藝制作 微流控芯片的加工技術(shù)以m e m s ( m i c r oe l e c t r o - m e c h a n i c a ls y s t e m s ) 加工技 術(shù)為主。m e m s 加工技術(shù)是在微電子器件制造技術(shù)( 也稱集成電路i c 技術(shù)) 基礎(chǔ) 上進(jìn)一步融入微機(jī)械加工技術(shù)，并把兩者結(jié)合起來的微制造技術(shù)。i t e m s 具有微 小化、可批量生產(chǎn)( b a t c hp r o d u c t i o n ) 及降低成本等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛的應(yīng)用與醫(yī) 學(xué)、生化、光電、航空等的研究。 傳統(tǒng)的i c z 藝包括光刻、氧化、摻雜、擴(kuò)散、蒸發(fā)、濺射，濕法刻、離子刻 蝕等工藝，材料主要是硅、氧化硅、氮化硅、鋁等；而臟船工藝除了i c 傳統(tǒng)工藝 外，還增加有各相異性腐蝕單晶硅、深刻蝕、x 一射線光刻、電鍍、厚膜( s u 一8 ) 、 l i g a 、硅玻璃及硅一硅鍵合等工藝，加工對象也增加了壓電材料、磁性材料、 塑性材料、鉑、金、玻璃等材料。 1 2 1 玻璃的微加工技術(shù) 硅及玻璃的微加工技術(shù)仍然是制作微流控生物芯片的主要工藝技術(shù)，這是因 為其工藝比較成熟，重復(fù)性較好，可以得到很好的縱深比，而且加工后的芯片易 于鍵合，有利于芯片的封裝。 典型的硅微加工工藝制作微流控芯片的流程是：首先在硅片上甩正膠或負(fù) 膠，然后在高分辨率的掩膜下進(jìn)行紫外曝光，去膠后進(jìn)行濕法刻蝕，如果需要管 壁垂直或一定的深度。則通常使用深離子刻蝕( d e e pr e a c t i v ei o ne t c h i n g ) ， 玻璃鉆孔以便進(jìn)樣和出樣并與硅片進(jìn)行鍵合。硅片上的好處是有利于和微電極進(jìn) 行整合；也有在玻璃上刻蝕溝道的做法，其典型工藝如圖卜3 所示。這類芯片具 有很好的硬度，便于保持芯片的形狀而不至于變形。 第1 章緒論 1 2 2l i g 工藝 圖1 3 玻璃加工工藝 德國為代表的l i g a ( l i g a 是德文l i t h o g r a p i e - - 光刻、g a l v a n o f o r m u u g - - 電鑄和a b f o r m u n g - - 鑄塑三個詞的縮寫) 技術(shù)，它是利用x 射線光刻技術(shù)，通過 電鑄成型和鑄塑形成深層微結(jié)構(gòu)的方法。其中第二種方法與傳統(tǒng)i c 工藝兼容， 可以實(shí)現(xiàn)微機(jī)械和微電子的系統(tǒng)集成，而且該方法適合于批量生產(chǎn)，已經(jīng)成為目 前m e m s 的主流技術(shù)。由于利用l i g a 技術(shù)可以加工各種金屬、塑料和陶瓷等 材料，而且利用該技術(shù)可以得到高深寬比的精細(xì)結(jié)構(gòu)，它的加工深度可以達(dá)到幾 百微米，因此l i g a 技術(shù)也是一種比較重要的m e m s 加工技術(shù)。l i g a 技術(shù)自八 十年代中期由德國開發(fā)出來以后得到了迅速發(fā)展，利用該技術(shù)已經(jīng)開發(fā)和制造出 了微齒輪、微馬達(dá)、微加速度計(jì)、微射流計(jì)等。第一種加工方法，則可以用于加 工一些在特殊場合應(yīng)用的微機(jī)械裝置，如微型機(jī)器人、微型手術(shù)臺等。 1 2 3 塑性材料加工工藝 使用玻璃、硅基材料加工微流控芯片雖然工藝技術(shù)成熟，但是存在著加工成 本高的問題，使用塑性材料加工微流控芯片則具有很大的成本優(yōu)勢，有利與芯片 降低成本，一次性使用以避免污染，因此近幾年來，利用塑性材料制各芯片的報(bào) 導(dǎo)越來越多。 第1 章緒論 塑性微流控芯片的加工方法包括激光消融法( l a s e ra b l a t i o n ) ，鑄模法 ( m o l d i n g ) 等，簡單介紹如下： 激光消融法是通過吸收短波長的激光脈沖來打破長鏈聚合物的共價鍵，形成 分解的聚合物片斷。然后再根據(jù)掩板的設(shè)計(jì)，通過x y 方向控制激光的位置，得 到不同形狀尺寸的微孔穴和微通道。最后所得到的微流控芯片結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：受熱 破壞小，通道壁垂直，得到通道的深度是確定的。 鑄模的方法很多，根據(jù)使用的材料的不同。有噴射模塑法( i n j e c t i o n m o l d i n g ) ，壓縮模塑法( c o m p r e s s i o n m 0 1 d i n g ) ，熱壓紋法( h o te m b o s s i n g ) ， 軟印法( s o f tl i t h o g r a p h y ) 等。常用的加工塑性微流控芯片的材料有聚碳酸酯 p o l y c a r b o n a t e 、聚甲基丙烯酸甲酯p o l y ( m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) 、聚苯 乙烯p o l y s t y r e n e 、硝化纖維n i t r o c e l l u l o s e 、聚乙烯p o l y ( e t h y l e n e ) 、聚四 氟乙烯p o l y ( t e t r a f l u o r o e t h y l e n e ) ( t e f l o n ) 、聚二甲基硅氧烷p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ( p d m s ) 等。一般加工塑性微流控芯片的流程為：首先是 利用傳統(tǒng)的光刻工藝加工微流控芯片的模具，然后用鑄模法得到溝道未封閉的微 流控芯片，最后進(jìn)行封裝得到微流控芯片。 使用鑄模法加工微流控芯片的方法一般包括兩個步驟，首先是加工模具，然 后將溝道模式從模板轉(zhuǎn)移到聚合物底片上。根據(jù)對溝道的尺度和精度的不同要 求，可以使用不同的技術(shù)來制造模具。對于加工尺寸較大的模具( 1 0 0 m ) ，利 用計(jì)算機(jī)數(shù)字控帝4 法( c n c ) 加工出的不銹鋼模具就足以滿足要求了；對于加工 尺寸較小的模具( 1 0 0 “m ) ，可以先在硅片上甩上光刻膠，然后利用光刻技術(shù)對 光刻膠進(jìn)行腐蝕得到所需結(jié)構(gòu)，最后在上面電鍍上金屬材料( 如鎳或鎳一鈷合金) 制得模具；對于加工具有更精細(xì)結(jié)構(gòu)的模具，則需要使用l i g a 技術(shù)。l i g a 技術(shù) 使用同步加速器產(chǎn)生光刻用的x 射線，然后進(jìn)行電鍍處理得到模具。 可通過噴射模塑法、壓縮模塑法、熱壓紋法、軟印法進(jìn)行復(fù)模，得到微流控 芯片。噴射模塑法是將聚合材料融化后噴注在放置于鑄模腔中的模具上，5 - i 0 秒后進(jìn)行脫模，這種方法非常適合大規(guī)模的加工低成本的器件【“ 。熱壓紋法過程 中，先將模具和聚合材料底片分別至于真空中加熱至一定的溫度，然后將模具與 聚合材料底片表面緊密接觸，壓出溝道的紋理，這個過程一般要進(jìn)行相對較長的 時間。軟印法不需要對模具和聚合材料進(jìn)行事先加熱處理，而是直接將聚合材料 第1 章緒論 澆鑄到模具上。 1 3 目前國內(nèi)外微流路診斷芯片的發(fā)展應(yīng)用 微流路診斷芯片包含有多個元件，如樣品處理芯片、d n a 擴(kuò)增芯片、毛細(xì)管 電泳芯片、微泵、微閥等，必須考慮芯片封裝、信號檢測等多方面的問題。下面 就國內(nèi)外微流路芯片相關(guān)技術(shù)最新的發(fā)展做簡要介紹。 i 3 1 樣品制備芯片 在醫(yī)學(xué)診斷中，樣品的來源是多樣豹，如全血、血清、尿液或唾液等，兩樣 品的成分比較復(fù)雜，如全血中包含有蛋白、細(xì)胞、d n a 等，必須對樣品進(jìn)行初步 的分離。不同的樣品處理的方式是不同的?，F(xiàn)在，已發(fā)展出各種各樣的微加工芯 片以對樣品進(jìn)行處理。 1 細(xì)胞分離和聚集 對某些樣品而言，必須進(jìn)行細(xì)胞分離以降低原始樣品的復(fù)雜性。而有些樣品 中待檢測的靶分子很少，則需要對樣品進(jìn)行富集。如假設(shè)l m l 血樣中有1 0 0 拷貝 的h i v ( 艾滋病毒) ，則至少需要0 5 m l 的血液才可以檢測出來。而這0 5 m l 的 血中還包含有2 5 1 0 9 紅血球和2 5 5 x1 0 6 的自細(xì)胞，在采用擴(kuò)增技術(shù)檢測此 微量的病毒前必須去除血細(xì)胞并富集病毒顆?！，F(xiàn)在，已有多種微芯片應(yīng)用在 細(xì)胞分離和細(xì)胞富集上，主要有以下幾種方法。 ( 1 ) 微過濾：現(xiàn)已設(shè)計(jì)出各種各樣的微過濾芯片，如在玻璃和硅片上制作 柱狀、彎曲的溝道q 、梳狀門或堰狀的微過濾器從全血中分離白細(xì)胞。微過 濾芯片的好處是不需要特殊的緩沖液，缺點(diǎn)是此方法要求需要的細(xì)胞和不需要的 細(xì)胞必須有明顯的尺寸差異。 ( 2 ) 介電電泳法( d i e l e c t r o p h o r e s i s ) 是另一種常用的分離細(xì)胞的方法。 不同的細(xì)胞在所加的電場下有不同的反應(yīng)，因此可以通過改變交變電場頻率對細(xì) 胞進(jìn)行分離。介電電泳芯片可以通過光刻法在玻璃或硅片上制作微電極陣列制 得，混合細(xì)胞由于對電場的不同反應(yīng)會聚集在電極的不同地方。由于其簡便性， 第1 章緒論 介電電泳法是比較常用的芯片級細(xì)胞分離的方法。已有利用這種芯片分離細(xì)菌 5 , 6 , 7 , 8 癌癥細(xì)胞田1 0 干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。與過濾方法不同的是，此方法不受 分離的細(xì)胞尺寸的限制。同時具有靈活性、易操作性和易于自動化，也不需要標(biāo) 記。其缺點(diǎn)是介電電泳的分離需要低電導(dǎo)的緩沖液，這意味著原始樣品不能直接 進(jìn)行分離。 ( 3 ) 超聲波處理：c o a k l e y 等人報(bào)道采用超聲波從全血中分離細(xì)胞?！斑€ 有一些文獻(xiàn)也有相關(guān)的報(bào)導(dǎo)?！? 川 2 細(xì)胞破裂 細(xì)胞破裂法常分為機(jī)械方法和非機(jī)械方法。 機(jī)械方法是利用物理方法破碎細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來。如利用高 壓，微珠剪切等。 超聲波“4 方法是最常用的破碎細(xì)胞的機(jī)械方法，超聲波系統(tǒng)會在液體內(nèi)產(chǎn) 生聲壓，在合適的條件下，這會導(dǎo)致微小氣泡劇烈的產(chǎn)生和破裂，在封閉的環(huán)境 內(nèi)會產(chǎn)生具有足夠能量的沖擊波破碎細(xì)胞膜?，F(xiàn)在芯片上的聲波處理器常常是由 鋯酸鈦制備的壓電換能器，諧振頻率在1 5 - - 2 5 k h z 。聲波方法的好處是可以處理 難處理的樣品，如孢子等樣品。其缺點(diǎn)是超聲波方法容易產(chǎn)生熱量和輻射影響生 物分子。 機(jī)械方法還存在一些問題。破碎細(xì)胞比較徹底，因此給下一步d n a 從蛋白和 細(xì)胞裂解物中分離帶來困難；并且細(xì)胞碎片使得溶液難以澄清。但最大的問題是 機(jī)械方法需要的裝置復(fù)雜，不利于芯片的微型化。 非機(jī)械方法：包括化學(xué)法、酶法、滲透法、熱學(xué)法、電法等。 化學(xué)方法“5 主要是通過使用化學(xué)方法使細(xì)胞壁破碎，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出 來，常用的化學(xué)試劑有酚、氯仿、d m s o 、苯等，近年來比較熱的是采取高鹽離子 溶液進(jìn)行d n a 的固相提取?；瘜W(xué)方法的缺點(diǎn)是化學(xué)試劑不易除掉，而且必須在芯 片中增加儲液池的設(shè)計(jì)以儲存化學(xué)試劑。 熱學(xué)法“。易于小型化，但缺點(diǎn)是不適宜于所有的樣品處理；電學(xué)法。l t t ) 易于小型化，但效率不高。 3 d n a 提取 o 第】章緒論 在疾病診斷中，常常需要提取d n a 進(jìn)行下一步的反應(yīng)。d n a 的提取常采用 離子交換法，微珠法，膜法等，這些方法都易于在芯片上實(shí)施。 1 3 2p c r 擴(kuò)增芯片 利用生物芯片診斷疾病，有必要采取d n a 擴(kuò)增技術(shù)對樣品制備的d n a 進(jìn)行擴(kuò) 增。p c r ( p o l y m e r a s e c h i n r e a c t i o n ) 技術(shù)是擴(kuò)增常用的技術(shù)，可以將目的基因 或某一d n a 片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷。 有三種基本且不同的方法來制作p c r 芯片。一類是n o r t h r u p 等人1 9 9 3 年 曾經(jīng)發(fā)表的一個( b u l k m i c r o m a c h i n e ds i l i c o nc h a m b e r ) p c r 生化反應(yīng)室“”， 此芯片是在硅片上刻蝕出小池，用耐熱玻璃密封，小池背面是多晶硅加熱器。 d a n i e l 也曾發(fā)表一個加以變形的裝置，以增加反應(yīng)室的熱絕緣性。較之前實(shí)行 p c r 反應(yīng)的大型儀器，這些裝置都在根本上進(jìn)行小型化，減少周期反應(yīng)所需的 時間。如下圖所示： 圖1 - 4 n o r t h r u p 的p c r 芯片 另一類芯片最早是k o p p 發(fā)表的一個連續(xù)流芯片( c o n t i n u o u s f l o wd e s i g n ) 。 在此裝置內(nèi)，樣品從一個固定溫度的區(qū)塊流動至下一個區(qū)塊，沿著流道來執(zhí)行 p c r 周期。 圖1 t 5k o p p 的p c r 芯片 第1 章緒論 還有一類芯片的設(shè)計(jì)類似第二類芯片。所不同的是：在：占片設(shè)計(jì)中，樣品區(qū) 恒定不動，三個溫區(qū)模塊不停轉(zhuǎn)動對樣品進(jìn)行加熱處理( 6 5 ) o p c rj 占片關(guān)鍵在于芯片材料的選擇和加熱器的制作。材料表面的性質(zhì)對p c r 反應(yīng)的影響較大。有研究表明：p c r 反應(yīng)在硅和氮化硅表面成功率較低，對硅表 面進(jìn)行修飾后會提高成功率，而s i o 。是進(jìn)行p c r 比較好的材料?！? 2 0 ) 0 目前有 報(bào)導(dǎo)利用玻璃噸”，塑性材料旺2 等制作p c r 芯片。p c r 反應(yīng)必需要求較快的升溫 和降溫速率，因此選擇好的加熱方式很重要。目前有報(bào)導(dǎo)利用p e l t i e r 元件，紅 外旺“等做熱源。現(xiàn)在利用硅制作的p c r 芯片可以達(dá)到1 7 s 每循環(huán)，。舢，而反應(yīng) 體積只需幾微升甚至皮升( 2 4 ) 0 p c r 信號檢測的方式也很多。有報(bào)導(dǎo)采用光纖插入至f j p c r 反應(yīng)池中收集激發(fā)光 來檢測p c r 產(chǎn)物的信號，也有采用光電二極管檢測p c r 產(chǎn)物旺鄹，但文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中最 常見是將p c r 和毛細(xì)管電泳( c e ) 相結(jié)合。實(shí)時p c r 技術(shù)( r e a lt i m ep c r ) 也是 常用的p c r 產(chǎn)物檢測手段。t a y l o r 等人。郇采用商業(yè)化的試劑盒實(shí)時監(jiān)測在硅 片刻蝕出的小池內(nèi)進(jìn)行的p c r 反應(yīng)。而b e l g r a d e r 等人設(shè)計(jì)的可攜式實(shí)時p c r 擴(kuò)增 器。其反應(yīng)體積為2 5 u i ，檢測遺傳血色沉著病( h e m o c h r o m a - - t o s i s ) 基因的s n p 約為2 0 分鐘“”。 單純的p c r 芯片由于仍無法避免加樣和取樣時的污染，故實(shí)用的p c r 芯片常常 和別的部分整合在一起，組成多功能芯片。妻h w a t e r s 等人設(shè)計(jì)的芯片，將細(xì)胞 裂解，p c r 擴(kuò)增和電泳分離結(jié)合在一起( 2 勖。在其后續(xù)的工作中，還有在一個芯片 上同時進(jìn)行多個樣品的p c r 反應(yīng)和電泳分離心鐘。 c e p h e i d 公司的產(chǎn)品則將樣品處理和快速p c r 整合在一起，并利用分子信標(biāo) 或t a q m a n 的技術(shù)實(shí)時熒光檢測微生物樣品。如圖0 - 6 。 圖 1 - 6c e p h e i d 的整臺芯片 在臨床檢測中，基因檢測有著重要的意義，如某些病毒d n a 的檢測等。常規(guī) 第1 章緒論 的p a r 反應(yīng)由于污染，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高等原因，不利于作為臨床診斷的依據(jù)。 這些芯片由于將樣品前處理，p a r 擴(kuò)增和信號檢測集成在一起，減少了污染，使 臨床p c r 結(jié)果的判斷更為可信，在臨床診斷上有著廣闊的應(yīng)用前景。 1 3 3 毛細(xì)管電泳芯片 最早采用毛細(xì)管電泳玻璃芯片快速分離氨基酸的報(bào)導(dǎo)是在9 0 年代早期“， 其后有許多研究者研究毛細(xì)管芯片電泳并將其用于核酸的分離。最早分離d n a 的 報(bào)道是e f f e n h a u s e r 等人( 3 1 利用芯片分離熒光標(biāo)記的寡核苷酸。整個分離過程 在4 5 s 以內(nèi)，而芯片的長度僅為3 8 c m 。其所加的高電壓2 3 0 0 v c m 和較小的樣 品體積有利于得到較好的分離效果。而傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳分離d n a 樣品通常需要 l o 到3 0 分鐘，電壓只能加到5 0 0 v c m 。另一個例子是w 0 0 1 e y 等人。2 制作的 用于高速d n a 分離的芯片，芯片在玻璃上刻蝕，有效長度僅為3 5 e m ，分離從7 0 到1 0 0 0 b p 的d n a 片斷時間在1 2 0 s 以內(nèi)。早期關(guān)于毛細(xì)管芯片電泳較重要的報(bào)道 還有將質(zhì)粒p b r 3 2 2 的消化和電泳分離結(jié)合在一起，其芯片是采用注射成型的塑 性材料制作而得q ”。 目前，高速、高通量的芯片毛細(xì)管電泳分離已經(jīng)發(fā)展的比較完善。s h i 等人 設(shè)計(jì)的并行d n a 電泳芯片，在一個芯片上制作有9 6 個毛細(xì)電泳陣列，分別和9 6 個樣品池相連，呈輻射狀。一個旋轉(zhuǎn)的共聚焦的熒光檢洌4 系統(tǒng)對信號進(jìn)行檢測。 此系統(tǒng)可以同時對9 6 個不同的樣品進(jìn)行分離，整個分離檢測過程在8 分鐘以內(nèi) 心o 。而u e d a 等人用p a 材料制作的毛細(xì)電泳芯片，可以對d n a 樣品進(jìn)行高 速分離?！?。安捷倫( a g i l e n t ) 公司最早推出了商業(yè)化的毛細(xì)管電泳芯片及檢測 系統(tǒng)a g i l c n t2 1 0 0 ，它集成毛細(xì)管電泳芯片和檢測系統(tǒng)在一個儀器內(nèi)。與傳統(tǒng)的 電泳相比，時間更短，試劑消耗更少，而操作更簡單?？稍? 0 m i n 內(nèi)對1 2 個樣 品進(jìn)行電泳分離，其分辨率相當(dāng)高，可以達(dá)到1 個b p 。 芯片毛細(xì)管電泳在芯片d n a 分析上起著重要的作用。事實(shí)上，現(xiàn)在微流控 芯片上的d n a 分析除了少數(shù)p c r 實(shí)時分析d n a 樣品外，幾乎全部采用毛細(xì)電 泳方法進(jìn)行分析。利用芯片毛細(xì)電泳可以進(jìn)行d n a 長度分析，序列分析和基因 分型等研究。而基因分型在臨床檢測，尤其在遺傳病的診斷和預(yù)測中具有重大的 第1 章緒論 意義。 1 3 4 雜交芯片和免疫芯片 雜交反應(yīng)和電泳是分子生物學(xué)中檢測的兩個基本手段，在疾病診斷中都有著 重要的作用。最常見的雜交芯片是基于m i c r o a r r a y 的d n a 芯片，d n am i c r o a r r a y 在基因分析等方面有著重要的作用；而另一種雜交芯片，基于微流道 ( m i c r o f l u i d i c ) 的雜交芯片在疾病診斷中也有著重要的作用，它可以和樣品處 理等部分整合在一起，是芯片實(shí)驗(yàn)室( l a bo nac h i p ) 的一部分。 最早關(guān)于微流道的d n a 雜交芯片的報(bào)道是利用磁珠在微流道內(nèi)進(jìn)行d n a 動態(tài) 雜交作基因表達(dá)分析c 3 6 ) 。微磁珠通過標(biāo)記p o l y t ，或利用生物素親和素和不 同的d n a 樣品結(jié)合，利用磁力固定在芯片內(nèi)，熒光標(biāo)記的d n a 探針泵入芯片內(nèi)進(jìn) 行雜交，雜交反應(yīng)后，通過芯片內(nèi)的加熱器移除雜交的探針，再加入另一序列的 d n a 探針進(jìn)行雜交。和傳統(tǒng)的雜交反應(yīng)相比，此芯片內(nèi)的雜交反應(yīng)速度相當(dāng)快， 只需幾秒鐘。而另一個報(bào)道檢測h i v 病毒的芯片將樣品處理，雜交等步驟整合在 一起。整個芯片大小和信用卡相當(dāng)o 。 n a n o g e n e 公司的雜交芯片采用電控方式進(jìn)行雜交，其具體的做法是在i m m 2 的位點(diǎn)上制作有微電極陣列，其上覆以鏈親和素標(biāo)記的瓊脂糖。生物素標(biāo)記的探 針分子可快速地結(jié)合到位于電極上方的瓊脂糖上，從而提高了雜交速度。其原理 為：當(dāng)位于待檢位點(diǎn)鏈親和素標(biāo)記的瓊脂糖凝膠下方的微電極引入直流正電壓 后，溶液中的生物素標(biāo)記化的探針就可在電場的作用下快速泳動并濃縮結(jié)合于該 處。同樣的道理，可以使待檢的d n a 分子快速濃縮于此，從而有力地雜交反應(yīng) 迅速進(jìn)行。雜交完成后，改變電場方向、可將未雜交的樣品d n a 從檢測位點(diǎn)“洗” 去，選擇適當(dāng)?shù)碾妶鰪?qiáng)度就可以使非特異雜交的d n a 與未雜交的探針選擇性地 從特定位點(diǎn)分開除去，而保留完全雜交的d n a 分子。由于電場的這種濃縮和選 擇特性，使得該方法有很高的靈敏度和特異性，最重要的是它使原來數(shù)小時的雜 交反應(yīng)縮短到1 5 秒。 基于微流道的免疫芯片也有相當(dāng)?shù)陌l(fā)展，d o d g e 等人將蛋白a 固定在芯片 內(nèi)檢測兔i g gq 鄹。有許多研究報(bào)道采用塑性材料制作免疫芯片，塑性材料具有 價格低廉，加工簡便等優(yōu)勢，如p d m s ，p m m a 等是常用的塑性材料。e t e s h o l a 1 4 第1 章緒論 等人在p d m s 芯片上研究e l i s a 實(shí)驗(yàn)，討論了固定的方法和封閉的方法。3 乳。s a t o 等人制作多樣品處理芯片，可同時處理4 個樣品，整個時間在5 0 r a i n 內(nèi)m 。 1 3 5 微泵 目前，雖然大部分關(guān)于芯片的文獻(xiàn)報(bào)道仍采用傳統(tǒng)的注射泵或蠕動泵操縱液 體在微芯片內(nèi)的流動，但集成化芯片中的微泵研究已有很大的發(fā)展，主要有以下 幾種類型： 1 ) 機(jī)械泵：3 i d h z e n t e 大學(xué)用于胰島素輸送的硅微加工的機(jī)械泵( 5 6 ) 0 由于硅 加工成本較高，所以近年來也有利用塑性材料制作微機(jī)械泵巧”。雖然微機(jī)械泵 發(fā)展較快，但仍然存在以下的問題：制作工藝復(fù)雜，產(chǎn)生的壓力較小，體積較大， 消耗的能量較多。不利于芯片的小型化。 2 ) 電滲泵：是微芯片上常用的驅(qū)動液體的方式，制作簡單，無霈移動的部分。 其原理是樣品進(jìn)入毛細(xì)管后，在毛細(xì)管兩端加高電壓，通過電泳和電滲的混和作 用，從而操縱液體的流動。電滲泵一般在1 2 0 0 v c m 時速率為1 m m s ，如j o r g e n s o n 等人報(bào)道的電滲泵速率為1 7 m m s ( 5 鍆，這可以滿足大部分的分析要求。其缺點(diǎn)是 需要高壓，在操作時電極直接和液體接觸，受毛細(xì)管壁所帶的電荷，溶液的離子 強(qiáng)度，p h 值等影響很大，因此適用范圍較小。 3 ) 其它的泵：如聲動泵，常用于微芯片上試劑的混合恬鯽，和電滲泵相比，加工 較復(fù)雜，但這種泵受樣品的化學(xué)性質(zhì)的影響較小。還有磁力泵循，離心泵嗡 等。 1 3 6微閥 微閥是集成化芯片中控制液體流動和試劑混合的重要元件。近年來也有采用 表面張力或毛細(xì)作用制作被動閩( p a s s i v ev a l v e ) 。這種方法有利于微閥在芯片 內(nèi)的集成。 1 3 7 集成化芯片 上述單獨(dú)組件在應(yīng)用中尚不完善，d n a 分析需要這些分立器件相連接集成 第1 壹緒詮 目前尚沒有種好的微平臺來支撐；另外大部分功能組件需要外部的光學(xué)讀出裝 置，而限制在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下應(yīng)用，并且增加了分析費(fèi)用