化妝品安全性.doc

中國(guó)化妝品技術(shù)信息網(wǎng)化妝品安全性評(píng)價(jià)程序和方法GB 791919871 目的為向廣大消費(fèi)者提供符合衛(wèi)生要求的化妝品，防止化妝品對(duì)人體產(chǎn)生近期和遠(yuǎn)期危害，特制定本程序和方法。2 適用范圍本程序和方法適用于在我國(guó)生產(chǎn)和銷售的一切化妝品原料和化妝品產(chǎn)品。3 化妝品安全性評(píng)價(jià)程序31 第一階段 急性毒性和動(dòng)物皮膚、粘膜試驗(yàn)311 急性毒性試驗(yàn)3111 急性皮膚毒性試驗(yàn)。3112 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。312 動(dòng)物皮膚、粘膜試驗(yàn)3121 皮膚刺激試驗(yàn)。3122 眼刺激試驗(yàn)。3123 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。3124 皮膚光毒和光變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。32 第二階段 亞慢性毒性和致畸試驗(yàn)321 亞慢性皮膚毒性試驗(yàn)。322 亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。323 致畸試驗(yàn)。33 第三階段 致突變、致癌短期生物篩選試驗(yàn)331 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）。332 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變和SCE檢測(cè)試驗(yàn)。333 哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變率檢測(cè)試驗(yàn)。334 動(dòng)物骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)。335 小鼠精子畸形檢測(cè)試驗(yàn)。34 第四階段 慢性毒性和致癌試驗(yàn)341 慢性毒性試驗(yàn)。342 致癌試驗(yàn)。35 第五階段 人體激發(fā)斑貼試驗(yàn)和試用試驗(yàn)。4 對(duì)化妝品原料和化妝品產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的規(guī)定41 凡屬于化妝品新原料，必須進(jìn)行五個(gè)階段的試驗(yàn)。42 凡屬于含藥物化妝品必須進(jìn)行動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)、皮膚與粘膜試驗(yàn)和人體試驗(yàn)，但是根據(jù)化妝品所含成分的性質(zhì)、使用方式和使用部位等因素，可分別選擇其中幾項(xiàng)甚至全部試驗(yàn)項(xiàng)目。43 凡屬于化妝品新產(chǎn)品必須進(jìn)行動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)、皮膚與粘膜試驗(yàn)和人體試驗(yàn)，但是根據(jù)化妝品所含成分的性質(zhì)、使用方式和使用部位等因素，可分別選擇其中幾項(xiàng)甚至全部試驗(yàn)項(xiàng)目。44 凡進(jìn)口化妝品應(yīng)由進(jìn)口單位提供安全性評(píng)價(jià)資料。5 化妝品安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法51 急性皮膚毒性試驗(yàn)人體接觸化妝品主要途徑是皮膚。當(dāng)評(píng)價(jià)化妝品及其成分對(duì)人體健康的可能危害時(shí)，進(jìn)行皮膚毒性的研究是必不可少的。511 目的：確定受試物能否經(jīng)皮膚滲透和短期作用所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，并為確定亞慢性試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。512 定義：系指受試物涂敷皮膚一次劑量后所產(chǎn)生的不良反應(yīng)。劑量表示方法：以敷用受試物的質(zhì)量（g、mg）或以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均單位體重敷用受試物的質(zhì)量（mgkg）來(lái)表示。一次敷用受試物引起50受試動(dòng)物死亡的劑量，稱之為半數(shù)致死量（LD50）。LD50值的單位為mg或gkg體重。513 動(dòng)物的準(zhǔn)備：選用兩種性別成年大鼠、豚鼠或家兔均可。建議試驗(yàn)起始動(dòng)物體重范圍為大鼠200300g，豚鼠350450g，家兔2030kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)在動(dòng)物籠內(nèi)觀察35天，使其適應(yīng)環(huán)境，并觀察其健康狀況。正式給藥前24h，將動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)毛發(fā)剪掉或剃掉，注意不要擦傷皮膚，因?yàn)閾p傷能改變皮膚的滲透性，受試物涂抹處，不應(yīng)少于動(dòng)物體表面積的10。各類動(dòng)物體表面積計(jì)算方法見(jiàn)附錄A。514 受試物的配制：若受試物是固體，應(yīng)磨成細(xì)粉狀，并用適量水或無(wú)毒無(wú)刺激性賦形劑混勻，以保證受試物與皮膚良好的接觸。常用的賦形劑有橄欖油、羊毛脂、凡士林等。若受試物是液體，一般不必稀釋。515 劑量和分組：將兩種性別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別隨機(jī)分為56組，若用賦形劑，需設(shè)賦形劑對(duì)照組。化學(xué)物質(zhì)毒性的半數(shù)致死量（LD50）計(jì)算方法見(jiàn)附錄B。機(jī)率單位對(duì)數(shù)圖解法，每組最好10只動(dòng)物。各劑量組間要有適當(dāng)?shù)慕M距，以使各劑量組產(chǎn)生一系列的毒性反應(yīng)或死亡率。最高劑量可達(dá)2000mgkg。516 試驗(yàn)方法：將受試物均勻地涂敷于動(dòng)物背部，并用油紙和兩層紗布覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布或繃帶加以固定，以防脫落和動(dòng)物舔食受試物，共敷藥24h。試驗(yàn)結(jié)束后，可用溫水或適當(dāng)?shù)娜軇┣宄龤埩舻氖茉囄铩Ｒ话阌^察一周，若給藥4天后仍有動(dòng)物死亡時(shí)，仍需繼續(xù)觀察一周。給藥后注意觀察動(dòng)物的全身中毒表現(xiàn)和死亡情況，包括動(dòng)物皮膚、毛發(fā)、眼睛和粘膜的變化，呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)和行為方式等的變化，特別要注意觀察震顫、驚厥、流涎、腹瀉、嗜睡、昏迷等現(xiàn)象。凡是試驗(yàn)過(guò)程中死亡的動(dòng)物和或有毒性反應(yīng)的動(dòng)物，均應(yīng)進(jìn)行尸檢和肉眼觀察。當(dāng)肉眼可見(jiàn)病變時(shí)，還應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)鏡檢。517 結(jié)果評(píng)價(jià)：急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)附錄C。52 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)當(dāng)化妝品成分的皮膚毒性低時(shí)，很難測(cè)得其經(jīng)皮LD50，為了解該化學(xué)物質(zhì)與已知毒物的相對(duì)毒性，以及由于嬰幼兒誤服化妝品的可能，進(jìn)行經(jīng)口毒性試驗(yàn)也很必要。521 定義：系指受試物一次經(jīng)口飼予動(dòng)物所引起的不良反應(yīng)。劑量表示法同急性皮膚毒性試驗(yàn)。522 動(dòng)物的準(zhǔn)備：分別選用兩種性別的成年小鼠和或大鼠。小鼠體重1822g，大鼠180200g，或選擇其它敏感的動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)前，一般禁食16h左右，不限制飲水。523 受試物溶液的配制：常用水或食用植物油為溶劑。若受試物不溶于水或油中，可用羧甲基纖維素、明膠、淀粉做成混懸液。給藥最大體積，小鼠不超過(guò)04ml20g體重，大鼠不超過(guò)10ml100g體重。524 劑量和分組：一般分為56個(gè)劑量組。每組動(dòng)物數(shù)510只，根據(jù)所選LD50計(jì)算方法而定。各劑量組間間距大小，隨受試物的毒性作用帶寬窄而異。通常以較大組距和較少量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試，找出其粗略致死劑量范圍，然后再設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量分組。受試物最高劑量可達(dá)5000mgkg體重。525 試驗(yàn)方法：正式試驗(yàn)時(shí)，將動(dòng)物稱量，并隨機(jī)分組，然后用特制的灌胃針頭將受試物一次給予動(dòng)物。若估計(jì)受試物毒性很低，一次給藥容積太大，可在24h內(nèi)分成23次給藥，但合并作為一日劑量計(jì)算。給藥后，密切注意觀察并記錄動(dòng)物的一般狀態(tài)、中毒表現(xiàn)和死亡情況，并進(jìn)行LD50的計(jì)算，其方法見(jiàn)附錄B。526 結(jié)果評(píng)價(jià)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)附錄C。53 皮膚刺激試驗(yàn)皮膚刺激是指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的可逆性炎性癥狀。531 試驗(yàn)方法的原則5311 受試物應(yīng)以一次劑量或多次劑量涂（敷）于健康的無(wú)破損的皮膚上。5312 每種受試物至少要用4只健康成年動(dòng)物（家兔或豚鼠）。5313 試驗(yàn)均采用自身對(duì)照。5314 受試物使用濃度，一般情況下，液態(tài)受試物采用原液或預(yù)計(jì)人應(yīng)用的濃度。固態(tài)受試物則用水或合適賦形劑（如花生油、凡士林、羊毛脂等），按1：1濃度調(diào)制。5315 凡具有高度皮膚毒性，或pH2或pH115的化學(xué)物質(zhì)，均不進(jìn)行本項(xiàng)試驗(yàn)。532 試驗(yàn)方法5321 急性皮膚刺激試驗(yàn)（一次皮膚涂抹實(shí)驗(yàn)）53211 試驗(yàn)前24h，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)毛剪掉，不可損傷表皮，去毛范圍左、右各約3cm6cm。53212 取受試物01ml（g）滴在25cm25cm大小的四層紗布上敷貼在一側(cè)皮膚上，或直接將受試物涂在皮膚上，然后用一層油紙覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)涂賦形劑作為對(duì)照。敷用時(shí)間一般為24h，亦可一次敷用4h。試驗(yàn)結(jié)束后用溫水或無(wú)刺激性溶劑除去殘留受試物。53213 于除去受試物后的1、24和48h觀察涂抹部位皮膚反應(yīng)，按表1和表2進(jìn)行皮膚反應(yīng)積分和刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。表1 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分表2 皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)5322 多次皮膚刺激試驗(yàn)53221 先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)皮膚的毛剪掉或剃掉，去毛范圍各為25cm25cm。53222 取受試物0105ml（g）涂抹在一側(cè)皮膚上，另一側(cè)涂賦形劑作為對(duì)照，每天涂抹12次，連續(xù)涂抹14天。每次涂藥前應(yīng)剪毛，不得損傷皮膚，保證受試物與皮膚充分接觸。53223 每天觀察皮膚反應(yīng)，按表1評(píng)分。脫屑積分為1。最高刺激指數(shù)為14（觀察次數(shù)）8（總積分?jǐn)?shù)）112。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用角膜環(huán)鉆取涂抹部位皮膚進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，按表3評(píng)分。533 結(jié)果評(píng)價(jià)按上述評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)和指標(biāo)的最高分值判斷受試物的皮膚刺激作用的有無(wú)或刺激的強(qiáng)弱。多次皮膚刺激試驗(yàn)刺激指數(shù)超過(guò)30、病理組織檢查積分超過(guò)4，應(yīng)判斷受試物對(duì)皮膚有明顯刺激性。在許多情況下，家兔和豚鼠對(duì)刺激物質(zhì)較人敏感，從動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果外推到人可提供較重要的依據(jù)。54 眼刺激試驗(yàn)眼刺激性是指眼表面接觸受試物后產(chǎn)生的可逆性炎性變化。541 試驗(yàn)方法的原則5411 受試物應(yīng)以一次劑量或多次劑量滴入（涂入）或噴灑眼內(nèi)。5412 每種受試動(dòng)物的眼睛應(yīng)保證無(wú)任何炎性反應(yīng)和眼損傷。5413 每組試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)至少4只，采用自身對(duì)照，首選動(dòng)物為家兔。5414 受試物使用濃度一般用原液或用適當(dāng)無(wú)刺激性賦形劑配制的50軟膏或其他劑型。5415 已證明有皮膚刺激性的物質(zhì)，不必進(jìn)行本項(xiàng)試驗(yàn)。542 試驗(yàn)方法表3 皮膚慢性刺激試驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)5421 一次眼刺激試驗(yàn)54211 將液態(tài)或軟膏（01ml或100mg）受試物滴入（涂入）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)眼作為對(duì)照。滴藥后使眼被動(dòng)閉合510s，記錄滴藥后6、24、48和72h眼的局部反應(yīng)，第4、7天觀察恢復(fù)情況。觀察時(shí)應(yīng)用熒光素鈉檢查角膜損害，最好用裂隙燈檢查角膜透明度、虹膜紋理改變。54212 如果受試物明顯引起眼刺激反應(yīng)，可再選用6只動(dòng)物，將受試物滴入一側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)，接觸4s或30s后用生理鹽水沖洗干凈，再觀察眼的刺激反應(yīng)。54213 按表4所列眼損害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)積分，再按表5進(jìn)行眼刺激強(qiáng)度的評(píng)價(jià)。5422 多次性眼刺激試驗(yàn)將受試物原液01ml或配制成的50軟膏約100mg滴入或涂入一側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)眼作為對(duì)照，每日一次，連續(xù)14天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，繼續(xù)觀察714天，按表4分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄眼的刺激反應(yīng)，并按表5眼刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行眼刺激強(qiáng)度的評(píng)價(jià)。表4 眼損害的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)表5 眼刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)543 結(jié)果評(píng)價(jià)按上述分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定，如一次或多次接觸受試物，不引起角膜、虹膜和結(jié)膜的炎癥變化，或雖引起輕度反應(yīng)，但這種改變是可逆的，則認(rèn)為該受試物可以安全使用。在許多情況下，哺乳動(dòng)物眼的反應(yīng)較人敏感，從動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果外推到人可提供較有價(jià)值的依據(jù)。55 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)是指通過(guò)重復(fù)接觸某種物質(zhì)后機(jī)體產(chǎn)生免疫傳遞的皮膚反應(yīng)。化學(xué)物質(zhì)引起的變態(tài)性接觸性皮炎，屬型（即延遲型）變態(tài)反應(yīng)。在人類的反應(yīng)可能是瘙癢、紅斑、丘疹、水皰或大皰，動(dòng)物僅見(jiàn)皮膚紅斑和水腫。551 試驗(yàn)方法的原則5511 由于接觸致敏的發(fā)病過(guò)程包括致敏（誘導(dǎo)）和激發(fā)兩個(gè)階段，動(dòng)物在第一次接觸受試物后至少1周，再次給予激發(fā)接觸。通過(guò)激發(fā)接觸能否引起皮膚反應(yīng)確定有無(wú)致敏作用。5512 實(shí)驗(yàn)首選動(dòng)物為白色豚鼠，每組動(dòng)物數(shù)1025只。5513 受試物劑量（濃度）：致敏（誘導(dǎo)）濃度允許引起皮膚輕度刺激反應(yīng)（即最高耐受濃度）。激發(fā)濃度一般應(yīng)低于致敏濃度，不得引起原發(fā)刺激性皮膚炎癥反應(yīng)。5514 為避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，試驗(yàn)中除要求使用的試劑、繃帶、膠布均無(wú)刺激性外，并設(shè)立陽(yáng)性或陰性對(duì)照組。5515 為提高皮膚反應(yīng)的陽(yáng)性率（增加敏感性），通常采用福氏完全佐劑（FCA），而不影響實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)。注：福氏完全佐劑（FCA）的制備：輕質(zhì)石蠟油 50ml羊毛脂（或吐溫80） 25ml結(jié)核桿菌（滅活） 62mg生理鹽水 25ml制成油包水乳化劑后，經(jīng)高壓消毒備用。552 豚鼠最大值試驗(yàn)（皮內(nèi)和涂皮結(jié)合法，簡(jiǎn)稱GPMT）5521 試驗(yàn)前24h在豚鼠頸背脊柱兩側(cè)4cm6cm范圍內(nèi)剪毛或脫毛。注：脫毛劑配方：可溶性淀粉 6份滑石粉 6份硫化鋇 6份顆粒狀陽(yáng)離子表面活性劑 27份用水調(diào)成糊狀涂在脫毛部位，保留4min左右，用水沖洗殘留脫毛劑。5522 從頭部向尾部成對(duì)地做三次皮內(nèi)注射。注射01mlFCA；注射01ml受試物；注射01ml受試物與FCA的等量混合物。如圖1所示，各點(diǎn)間距15cm。5523 注射后第8天，用2cm4cm濾紙涂以用適當(dāng)賦形劑（花生油、凡士林、羊毛脂等）配制的受試物，將其貼敷在上背部的注射部位，持續(xù)封閉固定48h，作為第二次致敏。為加強(qiáng)致敏作用，對(duì)無(wú)皮膚刺激作用的化學(xué)物質(zhì)，可在第二次致敏前24h，在注射部位涂抹10十二烷基硫酸鈉（SLS）。對(duì)照組僅用溶劑或賦形劑注射或涂抹。5524 激發(fā)接觸，即在末次致敏后1428天，分別用2cm2cm的濾紙涂以受試物，再次貼敷在上背部?jī)蓚?cè)的去毛區(qū)，持續(xù)封閉和固定24h。對(duì)照動(dòng)物作同樣處理。5525 激發(fā)接觸后24、48和72h觀察反應(yīng)，按表6進(jìn)行皮膚反應(yīng)強(qiáng)度評(píng)分。表6 皮膚反應(yīng)強(qiáng)度評(píng)價(jià)由于化學(xué)物的接觸致敏作用并非完全遵循一般的毒理學(xué)劑量反應(yīng)規(guī)律。Maghusson按動(dòng)物致敏百分?jǐn)?shù)提出以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表7）。表7 致敏率5526 結(jié)果評(píng)價(jià)本試驗(yàn)適用于弱致敏物（化學(xué)原料）的篩選。凡能引起10以下動(dòng)物致敏，即115或120動(dòng)物致敏，可認(rèn)為該受試物為弱致敏物，依以上分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)類推。由于人群中變態(tài)性接觸性皮炎的發(fā)生因素復(fù)雜，受到諸多因素如化學(xué)物的使用濃度、接觸頻數(shù)、持續(xù)時(shí)間及接觸時(shí)原皮膚的健康狀況等的影響，試驗(yàn)所得陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)結(jié)合人群斑貼試驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)行綜合性分析和評(píng)價(jià)。553 局部封閉涂皮法（Buehler test，簡(jiǎn)稱BT）5531 實(shí)驗(yàn)前24h，用脫毛劑將豚鼠背部左側(cè)3cm3cm范圍區(qū)脫毛。5532 將受試物0102ml涂在2cm2cm濾紙上，并將其敷貼在去毛區(qū)，二層紗布一層油紙覆蓋，再以無(wú)刺激膠布封閉固定，持續(xù)6h。第7天和第14天以同樣方法重復(fù)一次。5533 激發(fā)接觸，即末次致敏后1428天，將0102ml或低于誘導(dǎo)濃度的受試物斑貼于豚鼠背部右側(cè)2cm2cm去毛區(qū)（接觸前24h脫毛），然后用二層紗布、一層油紙和無(wú)刺激膠布固定6h，將斑貼受試物拿掉，24和48h后觀察皮膚反應(yīng)，按表5評(píng)分。對(duì)照動(dòng)物僅給予激發(fā)接觸。本試驗(yàn)要求動(dòng)物數(shù)每組1020只。5534 結(jié)果評(píng)價(jià)本試驗(yàn)適用于強(qiáng)致敏物（或成品）的篩選。致敏途徑與實(shí)際接觸方式接近，按皮膚反應(yīng)強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。根據(jù)對(duì)照組與試驗(yàn)組豚鼠皮膚反應(yīng)的差別測(cè)定變態(tài)反應(yīng)的程度。一般情況下，在豚鼠身上致強(qiáng)過(guò)敏物質(zhì)，可能在人身上引起大量的變態(tài)反應(yīng)，但在豚鼠身上致弱過(guò)敏者有可能或不可能引起人體變態(tài)反應(yīng)。56 皮膚光毒和光變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)皮膚光變態(tài)反應(yīng)是指某些化學(xué)物質(zhì)在光能參與下所產(chǎn)生的抗原抗體皮膚反應(yīng)。不通過(guò)機(jī)體免疫機(jī)制，而由光能直接加強(qiáng)化學(xué)物質(zhì)所致的原發(fā)皮膚反應(yīng)，則稱為光毒反應(yīng)。561 試驗(yàn)方法的原則5611 首選動(dòng)物為白色豚鼠和白色家兔，每組動(dòng)物810只。5612 照射源一般采用治療用汞石英燈，水冷式石英燈作光源，波長(zhǎng)在280320nm范圍的中波紫外線或波長(zhǎng)在320400nm范圍的長(zhǎng)波紫外線。5613 照射劑量按引起最小紅斑量（MED）的照射時(shí)間和最適距離來(lái)控制。一般需做預(yù)備試驗(yàn)確定MED值。5614 受試物濃度采用原液或按人類實(shí)際用濃度，光變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的激發(fā)接觸濃度可采用適當(dāng)?shù)南♂対舛?。采用無(wú)光感作用的丙酮或酒精作稀釋劑。5615 光變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)需采用陽(yáng)性對(duì)照，常用陽(yáng)性光感物為四氯水楊酰替苯胺。5616 光源照射前應(yīng)使受試物有足夠的時(shí)間穿透皮膚，一般大于30min，并確證受試物存留在皮膚內(nèi)。5617 如已證明受試物具有光毒性，可以不做光變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。562 皮膚光毒試驗(yàn)方法5621 先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱一側(cè)的毛剪掉，去毛范圍為3cm8cm（見(jiàn)圖2）。5622 用中波紫外線燈照射去毛區(qū)，時(shí)間以秒為單位，分幾檔，測(cè)定MED。5623 觀察確定照射后812h引起一度紅斑（剛剛可見(jiàn)）的照射時(shí)間為1個(gè)MED。5624 預(yù)試驗(yàn)3天后，用剪刀再將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)去毛共四塊，范圍每塊2cm2cm（見(jiàn)圖3）。5625 將受試物00501ml（g）均勻涂在1、2脫毛區(qū)，并用黑紙覆蓋避光。5626 涂藥30min后，第一脫毛區(qū)用亞MED的中波紫外線燈照射；第二脫毛區(qū)用黑紙覆蓋不予照射；第三區(qū)僅用亞MED的中波紫外線照射，不涂藥；第四區(qū)作空白對(duì)照，不給予任何處理。5627 照射后1、24和48h，觀察皮膚反應(yīng)，按表6進(jìn)行皮膚反應(yīng)強(qiáng)度的評(píng)價(jià)。5628 結(jié)果評(píng)價(jià)凡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物第一次與受試物接觸，并在光能作用下引起類似曬斑的局部皮膚炎癥反應(yīng)，即可認(rèn)為該受試物具有光毒作用。563 皮膚光變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)5631 誘導(dǎo)階段：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸部用脫毛劑脫毛2cm4cm，于脫毛區(qū)四角皮內(nèi)注射福氏完全佐劑（FCA）各01ml（見(jiàn)圖4）。5632 于脫毛區(qū)涂20十二烷基硫酸鈉（SLS）溶液，再將受試物01ml（g）涂在該脫毛部位。5633 用波長(zhǎng)在280400nm的中長(zhǎng)波紫外線燈照射涂藥部位，距離和時(shí)間以產(chǎn)生明顯紅斑為準(zhǔn)。中波紫外線的照射劑量為66Jcm(上標(biāo)始)2(上標(biāo)終)，長(zhǎng)波紫外線為10Jcm(上標(biāo)始)2(上標(biāo)終)。5634 隔日重復(fù)5632及5633步驟，共5次。5635 激發(fā)階段：于誘導(dǎo)操作后兩周，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)脫毛15cm15cm塊，共4塊（見(jiàn)圖5）。5636 第1塊涂受試物01ml后30min用長(zhǎng)波紫外線照射；第2塊涂受試物后用黑紙遮蓋不照射；第3塊不涂受試物，僅用長(zhǎng)波紫外線照射；第4塊用黑紙遮蓋，不涂受試物，亦不照射。5637 照射后24、48和72h，觀察皮膚反應(yīng)，按表5進(jìn)行皮膚反應(yīng)強(qiáng)度評(píng)分。5638 結(jié)果評(píng)價(jià)凡化學(xué)物質(zhì)單獨(dú)與皮膚接觸無(wú)作用，經(jīng)過(guò)激發(fā)接觸和特定波長(zhǎng)光照射后，局部皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、甚而全身反應(yīng)，而未照射部位無(wú)此反應(yīng)者，可認(rèn)為該受試物是光敏感物質(zhì)。57 人體激發(fā)斑貼試驗(yàn)和試用試驗(yàn)激發(fā)斑貼試驗(yàn)是借用皮膚科臨床檢測(cè)接觸性皮炎致敏原的方法，進(jìn)一步模擬人體致敏的全過(guò)程，預(yù)測(cè)受試物的潛在致敏原性。571 人體激發(fā)斑貼試驗(yàn)方法的原則5711 實(shí)驗(yàn)全過(guò)程應(yīng)包括誘導(dǎo)期、中間休止期及激發(fā)期。5712 受試物（可疑致敏原）與皮膚有充分接觸時(shí)間。5713 選擇合適敏感斑貼部位，如人體上背部或前臂屈側(cè)皮膚。5714 受試者應(yīng)無(wú)過(guò)敏史，樣本數(shù)不少于25人。5715 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)向受試者詳細(xì)介紹實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头椒ǎ匀〉脠A滿合作。572 試驗(yàn)方法5721 將5十二烷基硫酸鈉（SLS）液01ml滴在2cm2cm大小的四層紗布上，然后敷貼在受試者上背部或前臂屈側(cè)皮膚上，再用玻璃紙覆蓋，用無(wú)刺激膠布固定。24h后將敷貼物去掉，皮膚應(yīng)出現(xiàn)中度紅斑反應(yīng)。如無(wú)反應(yīng)，調(diào)節(jié)SLS濃度或再重復(fù)一次。5722 將02ml（g）受試物按上述方法敷貼在同一部位上，固定48h后，去掉斑貼物，休息一日。5723 重復(fù)5722步驟，共四次。如試驗(yàn)中皮膚出現(xiàn)明顯反應(yīng)，誘導(dǎo)可停止。5724 于最后一次誘導(dǎo)兩周，選擇未做過(guò)斑貼的上背部或前臂屈側(cè)皮膚兩塊，間距3cm，一塊作對(duì)照，一塊敷貼含上述受試物02ml（g）的1cm1cm紗布，封閉固定48h后，去除斑貼物，立即觀察皮膚反應(yīng)。24、48和72h再觀察皮膚反應(yīng)的發(fā)展或消失情況。按表8和表9進(jìn)行皮膚反應(yīng)評(píng)定。表8 皮膚反應(yīng)評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)573 結(jié)果評(píng)定如人體斑貼試驗(yàn)表明受試物為輕度致敏原，可作出禁止生產(chǎn)和銷售的評(píng)價(jià)。574 人體試用試驗(yàn)的原則及方法5741 志愿者按日常使用方法或選用前臂屈側(cè)5cm5cm皮膚進(jìn)行受試物試用試驗(yàn)。5742 樣本數(shù)為200人。5743 受試物每天使用12次，連續(xù)試用30天以上。5744 每周至少觀察一次，記錄受試者主訴，如癢、熱、刺痛感覺(jué)等或局部皮膚反應(yīng)，如皮膚脫屑、皸裂、紅斑、水腫、丘疹、水皰、痤瘡或色素沉著等。5745 結(jié)果評(píng)價(jià)200名受試者中有1人出現(xiàn)上述主訴和體征，均可認(rèn)為該受試物有皮膚刺激或致敏作用。結(jié)合化妝品的試用情況以及動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果，作出是否安全的評(píng)價(jià)。58 亞慢性皮膚毒性試驗(yàn)581 目的：確定受試物多次重復(fù)涂抹皮膚可能引起健康的潛在危害，為提供經(jīng)皮滲透可能性，靶器官和慢性皮膚毒性試驗(yàn)劑量選擇提供依據(jù)。582 定義：系指受試物重復(fù)涂抹動(dòng)物皮膚所引起的不良反應(yīng)。583 動(dòng)物的選擇：選用成年大鼠、家兔和豚鼠。建議實(shí)驗(yàn)起始動(dòng)物體重范圍，大鼠200300g，家兔2030kg，豚鼠350450g。動(dòng)物皮膚的準(zhǔn)備和受試物的配制，參見(jiàn)急性皮膚毒性試驗(yàn)，不過(guò)一般需每天或兩三天剪毛一次。584 劑量和分組：至少有三個(gè)劑量組和一個(gè)賦形劑對(duì)照組。每個(gè)劑量組至少20只動(dòng)物，雌、雄動(dòng)物各10只。最高劑量組可出現(xiàn)毒性反應(yīng)，但不能出現(xiàn)死亡。最低劑量組不能出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)。理想的中間劑量，應(yīng)產(chǎn)生最小的可觀察到的毒性反應(yīng)。如果受試物涂抹后產(chǎn)生了嚴(yán)重的皮膚刺激毒性，應(yīng)該中止試驗(yàn)，重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，使新設(shè)計(jì)的最高劑量組，由于濃度的降低致使皮膚刺激反應(yīng)減弱或消失。585 試驗(yàn)方法：將受試物涂抹于動(dòng)物背部皮膚，涂皮面積參見(jiàn)急性皮膚毒性試驗(yàn)，對(duì)毒性強(qiáng)的物質(zhì)，涂抹面積可適當(dāng)減少。實(shí)驗(yàn)期限為90天。5851 臨床檢查：整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，注意觀察并記錄動(dòng)物的一般表現(xiàn)、行為、中毒癥狀和死亡情況。每周稱體重一次，并調(diào)整敷藥量。5852 血液學(xué)檢查：一般于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定之。包括項(xiàng)目：血色素含量、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及其分類計(jì)數(shù)、血小板數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)等。5853 血液生化學(xué)檢查：一般認(rèn)為適合于所有研究的測(cè)試范圍是肝、腎功能、碳水化合物代謝、電解質(zhì)平衡。特殊測(cè)定之項(xiàng)目由受試物的作用方式來(lái)決定。建議的項(xiàng)目有：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶，血中尿素氮、非蛋白氮及肌酐含量，血清中白蛋白球蛋白等。必要時(shí)，可根據(jù)所觀察的毒性反應(yīng)選擇其他的臨床生化學(xué)指標(biāo)。5854 臟器稱重：肝、腎和其他臟器的絕對(duì)重量和臟體之比的測(cè)定。5855 病理學(xué)檢查：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死所有動(dòng)物，進(jìn)行大體尸檢，并將主要器官和組織固定保存、制片和鏡檢。在各劑量組動(dòng)物大體檢查無(wú)明顯病變時(shí)，可以只進(jìn)行高劑量組和對(duì)照組動(dòng)物主要臟器（肝、腎、脾、胃、腸等）和皮膚的組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對(duì)較低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行鏡檢。許多毒物可引起肝、腎組織病變，故肝、腎的鏡檢已列入常規(guī)項(xiàng)目，其他器官或組織的鏡檢則需根據(jù)情況而定。586 試驗(yàn)的意義和價(jià)值亞慢性皮膚毒性試驗(yàn)將提供重復(fù)皮膚接觸受試物時(shí)動(dòng)物機(jī)體反應(yīng)的資料。雖然從實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人的正確性是有限的，但它能提供關(guān)于化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收程度的有用資料。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明受試物經(jīng)皮吸收可能性甚微或幾乎無(wú)可能性，則沒(méi)有必要進(jìn)行經(jīng)皮慢性毒性和致癌試驗(yàn)。59 亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)591 目的：確定受試物重復(fù)經(jīng)口給予動(dòng)物可能引起健康的潛在危害，為提供靶器官、蓄積可能性和慢性致癌性實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。592 定義：系指動(dòng)物多次重復(fù)經(jīng)口接受化學(xué)物質(zhì)所引起的不良反應(yīng)。593 動(dòng)物的選擇：一般選用嚙齒類動(dòng)物，首選品種為大鼠。使用雌雄兩種性別，理想的給藥時(shí)間是小于6周令。594 劑量和分組：至少應(yīng)有三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。每個(gè)劑量組至少20只動(dòng)物，雌雄各10只。各劑量組選擇的原則同亞慢性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)。595 試驗(yàn)方法：給藥方式可采用受試物摻入飼料、飲水或灌胃方式。當(dāng)受試物摻入飼料時(shí)，要確保給藥量不能影響動(dòng)物正常的營(yíng)養(yǎng)需要。以灌胃方式給藥時(shí)，每周稱體重，并按體重調(diào)整給藥量，以維持穩(wěn)定的給藥量。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，動(dòng)物一般觀察、臨床檢查和病理檢查的原則和具體要求，參見(jiàn)亞慢性皮膚毒性試驗(yàn)。596 試驗(yàn)的意義和價(jià)值：亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)將提供重復(fù)經(jīng)口給藥后動(dòng)物所表現(xiàn)的不良反應(yīng)的資料。雖然從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人的正確性是有限的，但它能提供無(wú)反應(yīng)劑量和可允許的人類接觸量的有用資料。510 致畸試驗(yàn)5101 目的：致畸試驗(yàn)是鑒定化學(xué)物質(zhì)是否具有致畸性的一種方法。通過(guò)致畸試驗(yàn)，一方面鑒定化學(xué)物質(zhì)有無(wú)致畸性，另一方面確定其胚胎毒作用，為化學(xué)物質(zhì)在化妝品中安全使用提供依據(jù)。5102 定義：胚胎發(fā)育過(guò)程中，接觸了某種有害物質(zhì)影響器官的分化和發(fā)育，導(dǎo)致形態(tài)和機(jī)能的缺陷，出現(xiàn)胎兒畸形，這種現(xiàn)象稱為致畸作用。引起胎兒畸形的物質(zhì)稱為致畸原。5103 器材和試劑51031 生物顯微鏡、體視顯微鏡、放大鏡、扭力天平、游標(biāo)卡尺、眼科鑷子、眼科剪、平皿、濾紙等。51032 11000茜素紅溶液：茜素紅01g，氫氧化鉀10g，蒸餾水1000ml。51033 透明液A：甘油200ml，氫氧化鉀10g，蒸餾水790ml。51034 透明液B：甘油與蒸餾水等量混合。51035 固定液（Bouins液）：苦味酸飽和液75份，甲醛20份，冰醋酸5份。5104 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是小白鼠，大白鼠和兔，大、小白鼠為首選動(dòng)物。選用健康性成熟大鼠90100天齡，雌性應(yīng)是初產(chǎn)的。5105 劑量和分組：至少設(shè)4組，其中三組給藥組和一組空白對(duì)照組。每組至少12只孕鼠。初次進(jìn)行致畸試驗(yàn)或引入新的動(dòng)物種株時(shí)，需要設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。常用陽(yáng)性對(duì)照物有敵枯雙、五氯酚鈉、維生素A等等。根據(jù)受試物的動(dòng)物半數(shù)致死量（LD50）和蓄積性的大小，確定受試物的給藥劑量，應(yīng)該包括無(wú)作用劑量組，有致畸作用劑量組和明顯致畸劑量組。5106 試驗(yàn)方法51061 “孕鼠”的檢出和給藥時(shí)間雌鼠和雄鼠按1：1（或2：1）同籠，每日晨觀察陰栓（或陰道涂片），查出陰栓（或精子）的當(dāng)天定為孕期零天。如果五天內(nèi)沒(méi)查出“受精鼠”，應(yīng)調(diào)換雌鼠。檢出的“受精鼠”按隨機(jī)分組，稱重和編號(hào)。在大鼠孕期615天期間，每天灌胃給藥。孕鼠于孕期0日、6日、10日、15日和20日稱重，并根據(jù)體重調(diào)整給藥量。保持動(dòng)物室內(nèi)環(huán)境安靜，室溫控制在2025為宜，適當(dāng)?shù)亟o孕鼠增加營(yíng)養(yǎng)，如加麥芽或蛋糕等。51062 孕鼠處死和一般檢查第20天孕大鼠用20硫賁妥鈉115ml腹腔注射麻醉斷頭處死。剖腹腔檢查卵巢內(nèi)黃體數(shù)，取出子宮，稱重；檢查活胎、早期吸收和遲死胎數(shù)目。51063 活胎鼠的檢查逐個(gè)記錄活胎鼠體重，性別，體長(zhǎng)。外觀檢查頭顱外形、面部、軀干、四肢等有無(wú)畸形，包括：露腦、腦膨出、眼部畸形（小眼、無(wú)眼、睜眼等）鼻孔擴(kuò)大，單鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢及尾畸形等等。51064 胎鼠骨骼標(biāo)本的制備每窩約23活胎鼠以眼科鑷子剝皮，小心挖掉胸腹腔內(nèi)臟，去掉后頸和兩肩胛骨之間的脂肪塊，然后將胎鼠放入茜素紅溶液軟化染色。當(dāng)天下午搖動(dòng)玻璃瓶23次，視氣溫情況需染色半天至兩天，至頭骨染紅為止，第二（或三）天，將胎鼠換入透明液A，第三（或四）天，將胎鼠換入透明液B，第四（或五）天，胎鼠骨骼染紅而軟組織的紫紅色基本退色，可換入甘油中。51065 胎鼠骨骼檢查染好的標(biāo)本連同甘油一起倒入小平皿內(nèi)，在體視顯微鏡下，用透射光源，先觀察胎鼠全身，然后逐步檢查骨骼。首先，測(cè)量囪門的大小，矢狀縫的寬度，觀察是否囪門擴(kuò)大，矢狀縫增寬，頭頂間骨及后頭骨缺損。然后，檢查胸骨的發(fā)育和數(shù)目，是否胸骨缺失或融合。肋骨常見(jiàn)畸形有融合肋，分叉肋，肋骨中斷，缺肋，短肋，波狀肋，多肋等；脊柱骨的缺失、融合、縱裂等畸形；另外，檢查骨盆，四肢骨等是否有畸形。51066 胎鼠內(nèi)臟檢查每窩約13活胎鼠浸入Bouins氏液后一周作內(nèi)臟檢查。先用自來(lái)水沖去固定液，把胎鼠仰放在石蠟板上，剪去四肢和尾巴，用刀片從頭部開(kāi)始，往下逐漸經(jīng)頸、胸腹部共切6刀。第6刀切完后，可以用小剪刀剖開(kāi)腹腔，仔細(xì)檢查消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)各器官的大小、形狀以及位置。5107 統(tǒng)計(jì)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)受精鼠數(shù)、受孕鼠數(shù)、孕鼠死亡數(shù)，有一個(gè)以上活胎孕鼠數(shù)，用卡方檢查；窩平均黃體數(shù)、窩平均著床數(shù)、窩平均活胎數(shù)以及活胎鼠平均體重用t檢驗(yàn)；吸收胎和遲死胎用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)，窩畸形率、胎鼠畸形率用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果應(yīng)能得出受試物是否有母體毒性，胚胎毒性以及致畸性。如果受試物有致畸效應(yīng)，可以得出最小致畸劑量。為了比較不同化學(xué)物的致畸性強(qiáng)度，可用致畸指數(shù)來(lái)表示：暫以致畸指數(shù)10以下為不致畸，10100為致畸，100以上為強(qiáng)致畸。如果致畸危害指數(shù)300，說(shuō)明受試物對(duì)人危害小，100300為中等，100為大（暫定）。511 慢性毒性試驗(yàn)5111 目的：確定動(dòng)物長(zhǎng)期接觸化學(xué)物質(zhì)后所產(chǎn)生的危害。5112 定義：系指動(dòng)物長(zhǎng)期接觸受試物所引起的不良反應(yīng)。5113 動(dòng)物的選擇：一般建議兩種哺乳動(dòng)物，常用大鼠和小鼠。使用兩種性別。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)選用剛斷乳的動(dòng)物。5114 劑量和分組：一般至少設(shè)三至四個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。大鼠至少20只每組每性別，小鼠比大鼠適當(dāng)增加數(shù)量。在慢性毒性試驗(yàn)中，最好要有劑量反應(yīng)關(guān)系。最高劑量組應(yīng)引起毒性反應(yīng)或明確的損害作用，低劑量組不應(yīng)引起毒性作用或有害影響。5115 試驗(yàn)方法：慢性經(jīng)口或皮膚毒性試驗(yàn)，分別采取相應(yīng)的給藥途徑，具體方法參見(jiàn)相應(yīng)的亞慢性毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)期限至少為6個(gè)月，甚至一年。整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)動(dòng)物的一般觀察、臨床檢查和病理學(xué)檢查，參見(jiàn)亞慢性毒性試驗(yàn)。除此而外，還有一些具體要求：在試驗(yàn)的頭三個(gè)月，每周稱重一次；在46個(gè)月期間，每?jī)芍芊Q重一次，以后每四周稱重一次。在試驗(yàn)開(kāi)始后的第三個(gè)月、第六個(gè)月和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，進(jìn)行血液學(xué)和臨床生化學(xué)有關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。一般從每組每種性別中選10只動(dòng)物進(jìn)行測(cè)定。如果可能的話，最好每次血樣來(lái)自相同的動(dòng)物。測(cè)定臟器的絕對(duì)重量和臟體之比，至少包括肝、腎、脾、睪丸和腦等臟器，必要時(shí)還應(yīng)選擇其他臟器。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)全部的動(dòng)物，包括試驗(yàn)過(guò)程中死亡的或因處于垂死狀態(tài)而被處死的動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行全面的肉眼檢查。對(duì)所有動(dòng)物（包括中途死亡或處死的）的主要器官和組織（包括皮膚）以及所有肉眼可見(jiàn)的病變、腫瘤或可疑為腫瘤的組織，都應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。5116 試驗(yàn)的意義和價(jià)值：慢性毒性試驗(yàn)為提供人體長(zhǎng)期接觸該化學(xué)物質(zhì)的最大耐受量或安全劑量提供資料。512 致癌試驗(yàn)5121 目的：確定經(jīng)一定途徑長(zhǎng)期給予試驗(yàn)動(dòng)物不同劑量的受試物的過(guò)程中，觀察其大部分生命期間腫瘤疾患產(chǎn)生情況。5122 定義：系指動(dòng)物長(zhǎng)期接觸化學(xué)物質(zhì)后所引起的腫瘤危害。5123 動(dòng)物的選擇：建議對(duì)活性不明的化學(xué)物質(zhì)采用兩種動(dòng)物，一般優(yōu)先選用小鼠和大鼠，動(dòng)物的敏感性對(duì)試驗(yàn)影響很大。一般來(lái)講，用小鼠誘發(fā)肝癌比大鼠容易，相反地，誘發(fā)皮下腫瘤則大鼠比小鼠更容易。小鼠和兔子的皮膚對(duì)局部涂抹誘發(fā)腫瘤可能比大鼠和地鼠更為敏感。兩種性別都應(yīng)該使用，常使用剛斷乳或已斷乳動(dòng)物進(jìn)行致癌試驗(yàn)。5124 劑量和分組：至少三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。最高劑量組應(yīng)足以引起最低毒性反應(yīng)，又沒(méi)有因腫瘤以外的因素和明顯改變其正常生命期限。這些毒性反應(yīng)可能表現(xiàn)為血清酶水平的改變，或體重增加受到輕度抑制（降低百分之）。最低劑量應(yīng)該不影響動(dòng)物的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和壽命，即不能引起任何毒性表現(xiàn)。中間劑量應(yīng)該處于最高和最低劑量的中間范圍。每個(gè)劑量組和對(duì)照組的每種性別至少2550只動(dòng)物。試驗(yàn)期限：應(yīng)該包括動(dòng)物正常生命期的大部分時(shí)間。建議參考下面幾條準(zhǔn)則： 一般情況，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)間對(duì)小鼠和地鼠應(yīng)為18個(gè)月，大鼠為24個(gè)月。 當(dāng)最低劑量組或?qū)φ战M存活的動(dòng)物數(shù)只有百分之二十五時(shí)，也可以結(jié)束試驗(yàn)。對(duì)于有明顯性別差異的試驗(yàn)，則其結(jié)束的時(shí)間，不同的性別應(yīng)有所不同。若高劑量組因明顯的毒性作用造成過(guò)早死亡，此時(shí)不應(yīng)結(jié)束試驗(yàn)。一個(gè)合格的陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)： 因疾病、被同類吃掉，或因管理問(wèn)題所造成的動(dòng)物損失在任何組都不能高于百分之十。 小鼠和地鼠在18個(gè)月，大鼠在24個(gè)月時(shí)，各組存活的動(dòng)物不能少于50。5125 試驗(yàn)方法：給受試物的途徑，根據(jù)受試物的理化特性和對(duì)人有代表性的接觸方式（經(jīng)口或皮膚涂抹）而定。整個(gè)致癌過(guò)程中，注意觀察并記錄動(dòng)物出現(xiàn)的癥狀或死亡情況，尤其要注意腫瘤發(fā)生情況，每一個(gè)肉眼可見(jiàn)的或觸及的腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、部位、大小、外形和發(fā)展情況都應(yīng)記錄。在試驗(yàn)的前三個(gè)月，每周稱量一次，以后每四周稱量一次。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡或因處于垂死狀態(tài)而被處死，以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)全部宰殺的動(dòng)物，都應(yīng)進(jìn)行完整的大體尸檢。所有動(dòng)物的全部器官和組織都應(yīng)保留以進(jìn)行鏡檢，但實(shí)際上是有困難的，只能有選擇地進(jìn)行，至少下述情況要進(jìn)行鏡檢： 各組所有肉眼可見(jiàn)的腫瘤或可疑腫瘤的病變。 最高劑量組和對(duì)照組動(dòng)物，以及試驗(yàn)過(guò)程中死亡或處死的所有動(dòng)物所保留的器官和組織。詳細(xì)描述增生、瘤前病變或腫瘤的形態(tài)學(xué)改變。 如果在最高劑量和對(duì)照組之間，增生、瘤前病變或腫瘤有明顯區(qū)別，則應(yīng)該對(duì)該試驗(yàn)各組所有動(dòng)物的特殊有關(guān)的器官和組織進(jìn)行鏡檢。 如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明動(dòng)物正常壽命有明顯改變或產(chǎn)生了一些能影響腫瘤發(fā)生的作用，則下二個(gè)低劑量組動(dòng)物也應(yīng)按上述方式進(jìn)行鏡檢。5126 致癌試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)采用聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織提出的四條判斷誘癌試驗(yàn)陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)： 腫瘤只發(fā)生在試驗(yàn)組動(dòng)物中，對(duì)照組無(wú)腫瘤。 試驗(yàn)組與對(duì)照組動(dòng)物均發(fā)生腫瘤，但試驗(yàn)組中發(fā)生率高。 試驗(yàn)組動(dòng)物中多發(fā)性腫瘤明顯，對(duì)照組中無(wú)多發(fā)性腫瘤或只少數(shù)動(dòng)物有多發(fā)性腫瘤。 試驗(yàn)組與對(duì)照組動(dòng)物腫瘤的發(fā)生率無(wú)明顯差異，但試驗(yàn)組中腫瘤發(fā)生的時(shí)間較早。上述四條中，試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后任何一條有顯著的差異時(shí)即可認(rèn)為檢品的誘癌試驗(yàn)屬陽(yáng)性。動(dòng)物致癌試驗(yàn)為人體長(zhǎng)期接觸該物質(zhì)是否引起腫瘤的可能性提供資料。5.13 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）鼠傷寒沙門氏菌組氨酸（his）回復(fù)突變系統(tǒng)是一種微生物試驗(yàn)。該試驗(yàn)用于測(cè)定可引起沙門氏桿菌基因堿基置換和或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的his(上標(biāo)始)(上標(biāo)終)his(上標(biāo)始)(上標(biāo)終)的回復(fù)突變。5131 定義：用來(lái)測(cè)定依賴于組氨酸的菌株產(chǎn)生不依賴于組氨酸的基因突變。堿基型突變劑：它引起DNA分子堿基對(duì)置換。移碼型突變劑：它引起DNA分子增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。5132 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株鑒定菌株：建議使用TA98、TA100、TA97和TA102等四種組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株。增菌培養(yǎng)：將貯存菌接種于5m1營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于37振蕩培養(yǎng)10h。51321 組氨酸需求試驗(yàn)凡組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌株只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上則不能生長(zhǎng)。鑒定方法：將試驗(yàn)菌株分別接種于含組氨酸培養(yǎng)基和無(wú)組氨酸培養(yǎng)基平板，于37培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。結(jié)果判斷：試驗(yàn)菌株在含組氨酸平板上生長(zhǎng)，在不含組氨酸平板上不會(huì)生長(zhǎng)。51322 脂多糖屏障缺陷鑒定粗糙型突變的微生物，其細(xì)胞表面一層脂多糖屏障已經(jīng)破壞，因此一些大分子物質(zhì)能穿過(guò)菌膜進(jìn)入菌體內(nèi)而抑制其生長(zhǎng)，野生型菌株或含gal缺失的菌株則不受影響。鑒定方法：含01ml試驗(yàn)菌株增菌液的頂瓊脂培養(yǎng)液倒入肉湯瓊脂平板上，冷凝后中央放置無(wú)菌圓形濾紙片，滴上10l的01結(jié)晶紫溶液，經(jīng)37培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：在濾紙片周圍出現(xiàn)一個(gè)透明的抑菌環(huán)，說(shuō)明此菌存在深粗型（rfa）突變。TA98、TA100、TA97和TA102均有抑菌環(huán)，野生型鼠傷寒桿菌沒(méi)有抑菌環(huán)。51323 對(duì)氨芐青霉素的抗性鑒定含R因子的試驗(yàn)菌株對(duì)氨芐青霉素具有抗性。因R因子大太穩(wěn)定容易丟失從而使試驗(yàn)菌株喪失R因子的特性，因此需要鑒定R因子是否存在。鑒定方法：將試驗(yàn)菌株于肉湯瓊脂平板上劃線，然后把沾有氨芐青霉素溶液濾紙條與劃線交叉放置，37培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：具有R因子的試驗(yàn)菌株（TA98、TA100、TA97和TA102）有抗氨芐青霉素作用，故濾紙條周圍照常生長(zhǎng)。51324 對(duì)紫外線敏感性的試驗(yàn)具有uvrB修復(fù)缺陷型的試驗(yàn)菌株，在紫外線照射后仍能照常生長(zhǎng)，借此可以證明uvrB突變的存在。鑒定方法：將試驗(yàn)菌株在肉湯瓊脂平板上劃線，然后用黑紙覆蓋平板的一半，在15W的紫外燈下，距離33cm處照射8s，37培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：對(duì)紫外線敏感的菌株（TA98、TA100、TA97），僅在沒(méi)有照射的那一半生長(zhǎng)，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株（TA102）仍能生長(zhǎng)。51325 四環(huán)素抗性的鑒定鑒定方法：將試驗(yàn)菌株增菌液在營(yíng)養(yǎng)肉湯平板上劃線，待干后，吸取四環(huán)素（8mgml）溶液與菌株劃線處交叉劃線，經(jīng)37培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：對(duì)四環(huán)素有抗性的TA102菌株生長(zhǎng)不受抑制，對(duì)四環(huán)素沒(méi)有抗性的菌株，因此在四環(huán)素帶的周圍有一段生長(zhǎng)抑制區(qū)。51326 陽(yáng)性突變劑的敏感性的鑒定試驗(yàn)菌株對(duì)陽(yáng)性突變劑的敏感性鑒定結(jié)果，參見(jiàn)下表。51327 自發(fā)回變測(cè)試菌株的回變性在誘變?cè)囼?yàn)中，不同的試驗(yàn)菌株有不同的自發(fā)回變數(shù)，通常以每皿的回變菌落數(shù)來(lái)表示。各種試驗(yàn)菌株的自發(fā)回變數(shù)如下：TA97（90180），TA98（2050），TA100（100200），TA102（240320）。經(jīng)過(guò)體外代謝活化系統(tǒng)后的自發(fā)回變數(shù)，要比不經(jīng)體外代謝活化系統(tǒng)的自發(fā)回變數(shù)略高。5133 大鼠肝微粒體酶（S9）的誘導(dǎo)和制備選健康雄性大白鼠體重200克左右，將多氯聯(lián)苯溶于玉米油中，濃度為200mgml，一次腹腔注射PCB劑量為500mgkg體重。第五天斷頭處死動(dòng)物，處死前12h停食不停飲水。消毒動(dòng)物皮毛，打開(kāi)腹腔，取出肝臟后，用015molL KCl溶液多次沖洗，每克肝臟加015molL KCl3ml后，用剪刀剪碎肝臟，并在玻璃勻漿器中制成肝勻漿，然后在低溫高速離心機(jī)上，以9000g離心10min，然后分裝保存于液氮或-80冰箱中。制備S9的一切器皿均經(jīng)消毒，全部操作在冰水浴中進(jìn)行。S9制備后，其活力必須以標(biāo)準(zhǔn)致癌物進(jìn)行測(cè)定。5134 受試物的劑量選擇和常用溶劑受試物的劑量選擇范圍在01g5mg或?qū)?xì)菌產(chǎn)生毒性的劑量之間。常用的溶劑為二甲基亞砜，除此之外，還可以選擇丙酮、二甲基甲酰胺、甲酰胺、95乙醇等溶劑，最高加入量為01ml。每種受試物至少三個(gè)劑量，每個(gè)劑量至少三個(gè)平板。5135 試驗(yàn)方法51351 直接平板摻入法：將含05m molL組氨酸生物素的頂層瓊脂20ml分裝于試管中，45恒溫水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液01ml、受試溶液01ml和S9混合液05ml（需代謝活化時(shí)）混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻，冷凝固化，37下培養(yǎng)48h后，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。突變?cè)囼?yàn)中，除樣品各劑量組外，還應(yīng)設(shè)溶劑對(duì)照、空白對(duì)照、陽(yáng)性突變劑對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照。51352 點(diǎn)試法：方法基本同平板摻入法，不同的是，將含菌液（或S9混合液）的頂層瓊脂倒入底層培養(yǎng)基上，然后取直徑約6mm無(wú)菌圓形濾紙片放在已固化的頂層培養(yǎng)基中央位置。再滴入受試物溶液或直接將受試物放在平皿中央，37培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。5136 結(jié)果評(píng)價(jià)：如果受試物的回變菌落數(shù)超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍以上，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理證明有劑量回變反應(yīng)關(guān)系者和可重復(fù)性，則定為陽(yáng)性。5137 培養(yǎng)基和試劑的制備51371 頂層培養(yǎng)基瓊脂 12g氯化鈉 10g蒸餾水 200ml121（15 lb）30min高壓消毒后，加入05mmolL組氨酸生物素溶液20ml。51372 底層培養(yǎng)基瓊脂 75g蒸餾水 465ml121（15 lb）30min高壓消毒后，加入（VB）培養(yǎng)基E10ml和40葡萄糖溶液25ml，混勻，按每皿30ml倒平皿，冷凝固化后倒置于37培養(yǎng)箱中2448h。51373 VogelBonner（VB）培養(yǎng)基E硫酸鎂（MgSO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)7H(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)O） 10g枸櫞酸（C(下標(biāo)始)6(下標(biāo)終)H(下標(biāo)始)8(下標(biāo)終)O(下標(biāo)始)7(下標(biāo)終)H(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)O） 100g磷酸氫二鉀（K(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)HPO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)）500g磷酸氫銨鈉（NaNH(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)HPO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)4H(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)O） 175g先將后三種溶解后，再加入硫酸鎂，待完全溶解后倒入容量瓶中，用蒸餾水稀釋至1000ml，分裝于錐形瓶里，121（15 lb）30min高壓消毒。51374 40葡萄糖溶液稱取400g葡萄糖，加入蒸餾水稀釋至1000ml，115（10 lb）20min高壓消毒。51375 肉湯培養(yǎng)基牛肉膏 25g胰胨 50g氯化鈉 25g磷酸氫二鉀 10g蒸餾水 500ml121（15 lb）30min高壓消毒。51376 肉湯斜面或平板瓊脂粉 75g肉湯培養(yǎng)基 500ml121（15 lb）30min高壓消毒后，倒斜面或平皿。用于菌株鑒定或常規(guī)試驗(yàn)用菌株保存。51377 05m molL組氨酸生物素溶液D生物素（分子量2473） 309mgL組氨酸鹽酸鹽（分子量1917） 240mg加蒸餾水至 250ml121（15 lb）20min高壓消毒。51378 S9混和液配制（按每毫升S9混合液計(jì)算）大鼠肝 S9 100lMgCl(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)-KC1鹽溶液 20l6 磷酸葡萄糖