（植物學(xué)專業(yè)論文）擬南芥134三磷酸肌醇56激酶在光形態(tài)建成中的功能研究.pdf

摘要 1 3 4 三磷酸肌醇5 6 一激酶 簡(jiǎn)稱5 6 一激酶 是磷酸肌醇代謝過程中的一種重要的調(diào)控 酶 動(dòng)物細(xì)胞中 它具有肌醇激酶和蛋白激酶雙重活性 還能進(jìn)行自身磷酸化 是一個(gè)從植 物到人甚至線蟲都保守的酶 而且5 6 一激酶還是第一個(gè)鑒定出的與c o p 9 信號(hào)體 簡(jiǎn)稱c s n 互作的蛋白激酶 但它們互作的生物學(xué)意義還不清楚 植物細(xì)胞中 僅知道5 6 一激酶是一種 廣泛存在的肌醇激酶 有關(guān)它的功能沒有更多的報(bào)道 因此 研究5 6 一激酶是否具有蛋白激 酶的活性 是否與c s n 互作 并參與植物的光形態(tài)建成 對(duì)揭示5 6 一激酶的生物學(xué)功能 闡 明植物光形態(tài)建成機(jī)理等方面具有重要的理論意義 本文以擬南芥為材料 克隆了5 6 一激酶的基因 命名為a t i t p k 1 并進(jìn)行了原核表達(dá) h i s 標(biāo)簽 純化融合蛋白并制備了多克隆抗體 通過對(duì)a t l t p k 1 在不同光質(zhì)下的表達(dá)分 析 發(fā)現(xiàn)它受紅光強(qiáng)誘導(dǎo) 說明a t t p k 一 可能參與了植物對(duì)紅光的應(yīng)答 通過對(duì)a t t p k i 在擬南芥中的定位研究 發(fā)現(xiàn)a t l t p k 1 定位在細(xì)胞核中 為了研究5 6 一激酶在擬南芥中的生物學(xué)意義 對(duì)a t l t p k 1 的t d n a 插入突變體 a t j t p k 一 一 和a t i t p k 2 進(jìn)行了篩選和鑒定 并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了超表達(dá)a t l t p k 1 基因的轉(zhuǎn)基因植株 表型分析表明 與野生型相比 a t i t p k i 突變體表現(xiàn)為紅光抑制下胚 軸伸長(zhǎng) 超表達(dá)植株則表現(xiàn)為紅光促進(jìn)下胚軸伸長(zhǎng) 另外 當(dāng)將a t l t p k 1 基因轉(zhuǎn)到突變體 a t e t p k 一卜 中 下胚軸伸長(zhǎng)便恢復(fù)到與野生型一樣 這些結(jié)果表明擬南芥5 6 一激酶h t l t p k 一1 可能參與了紅光下的光形態(tài)建成 利用我們制各的有活性的g s t a t i t p k 一1 融合蛋白 進(jìn)行了自身磷酸化實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn) a t i t p k l 具有蛋白激酶的活性 這為進(jìn)一步解釋5 6 一激酶在光形態(tài)建成中的可能作用提供 了線索 以f u s f c s n l 3 4 為材料 利用a t l t p k i 的抗體和c s n 4 c s n 5 的抗體 進(jìn)行了5 6 一 激酶和c s n 的免疫麩沉淀實(shí)驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥的5 6 一激酶可以和c s n 共沉淀 基于免疫 菇沉淀和a t l t p k l c s n 都是核蛋白的結(jié)果 我們認(rèn)為在擬南芥中存在5 6 一激酶和c s n 互 作的可能性 本研究發(fā)現(xiàn)了擬南芥的5 6 一激酶參與了紅光下的光形態(tài)建成 這一作用可能是通過與 c s n 互作完成的 并且5 6 一激酶在光形態(tài)建成中的功能可能是通過它的蛋白激酶活性來實(shí)現(xiàn) 的 但是 植物的光形態(tài)建成是一個(gè)菲常復(fù)雜的過程 5 1 6 一激酶參與光形態(tài)建成的具體機(jī)制 仍需要進(jìn)一步探討 關(guān)鍵詞擬南芥 c o p 9 信號(hào)體 1 3 4 三磷酸肌醇5 6 一激酶 蛋白激酶 紅光 a b s t r a c t i n o s i t o l1 3 4 一t r i s p h o s p h a t e5 6 k i n a s e 5 6 一k i n a s e i sak e yr e g u l a t o r ye n z y m ei nt h ep r o c e s s o ft h ei n o s i t o lp h o s p h a t em e t a b o l i s m i nm a m m a l i a nc e l l s t h e5 6 一k i n a s ee x h i b i t st h ea c t i v i t yo f b o t hi n o s i t o lk i n a s ea n dp r o t e i nk i n a s e a n di sa l s o r e p o r t e dt oh a v et h ea c t i v i t yo f a u t o p h o s p h o r y l a t i o n i ti sc o n s e r v e df r o mp l a n t s t oh u m a n sa n di sf o u n de v e ni ne n t a m o e b a h i s t o l y t i c a m o r e o v e r t h e5 6 一k i n a s ei sa l s ot h ef i r s t i d e n t i f i e dc o p 9s i g n a l o s o m e c s n 一a s s o c i a t e dk i n a s ei nm a m m a l i a nc e l l s b u tt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no ft h e i ra s s o c i a t i o ns t i l l r e m a i n su n c l e a r i np l a n t s i ti so n l yr e p o r t e dt h a tt h e5 6 k i n a s ei st h eu b i q u i t o u si n o s i t o lk i n a s e b u tt h e r ea r en o tn l o r er e p o r t so nt h ef u n c t i o no ft h i se n z y m e s o t h ew o r k st h a ts t u d yi ft h e 5 6 k i n a s ee x h i b i t st h ea c t i v i t yo fp r o t e i nk i n a s e a n di fi ta s s o c i a t e sw i t hc s na n dt h e ni n v o l v e s i np l a n tp h o t o m o r p h o g e n e s i sw i l lb es i g n i f i c a t i v ef o ro p e n i n go u tt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n o f 5 6 k i n a s ea n de l u c i d a t i n gt h em e c h a n i s mo f p l a n tp h o t o m o r p h o g e n e s i s i nt h er e s e a r c hf o rt h ed i s s e r t a t i o n w ec l o n e dt h e5 6 k i n a s eg e n e a t l t p k 1f r o m a r a b m o p s i s w ea l s oe x p r e s s e dt h eh i s a t l t p k 1p r o t e i ni ne c o l i o b t a i n e dt h ep u r i f i e df u s i o np r o t e i na n d p r e p a r e dt h ea n t i a t l t p k 1a n t i b o d y i no r d e rt oa n a l y z et h ee x p r e s s i o no f a t l t p k ju n d e rd i f f e r e n t l i g h tq u m i t y r t p c ra n dw e s t e r nb l o tw e r ep e r f o r m e d t h e1 r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o n o f a t l t p k 1w a ss t r o n g l yi n d u c e db yr e dl i g h t w h i c hs u g g e s t e dt h a t a t l t p k im a yb ei n v o l v e di n t h er e s p o n s eo fp l a n tt or e dl i g h t i na d d i t i o n t h es t u d yo fl o c a l i z a t i o ns h o w e dt h a ta t l 自o k 1i s l o c a t e di nt h en u c l e u si n a r a b i d o p s i s i no r d e rt os t u d yt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no f5 6 一k i n a s ei na r a b i d o p s i s t w ot d n ai n s e r t i o n m u t a n t so f a t l t p k 1 d e s i g n a t e d b yu s a sa t i t p k j ja n da t i t p k j 2 w e r es c r e e n e da n di d e n t i f i e d a l s o t h et r a n s g e n i cp l a n t so v e r e x p r e s s i n g a t l t p k 1w e r eg e n e r a t e db yt r a n s g e n i ct e c h n o l o g y t h e p h e n o t y p i cr e s u l t si n d i c a t e dw h e nc o m p a r e dw i t hw i l d t y p ep l a n t s t h ea a q k 1m u t a n t se x h i b i t t h ep h e n o t y p et h a tr e dl i g h ti n h i b i t st h ee l o n g a t i o no fh y p o c o t y l s a n dt h eo v e r e x p r e s s i o nl i n e so f a t l 印k 1s h o wt h ep h e n o t y p et h a tr e dl i g h tp r o m o t e st h ee l o n g a t i o no fh y p o c o t y l s i na d d i t i o n w h e nt h ea t i l p k 1g e n ew a st r a n s f o r m e di n t oa t i r p k 1 m u t a n t t h el e n g t ho fh y p o c o t y l sw a s r e s t o r e dt ot h a to ft h ew i l d t y p e t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e5 6 k i n a s ea t l t p k 一1m a yb e i n v o l v e di np h o t o m o r p h o g e n e s i su n d e rr e dl i g h ti n a r a b i d o p s i s u s i n g t h ea c t i v e g s t a t i t p k 一1 f u s i o n p r o t e i ne x p r e s s e db y o u r s e l v e s t h e a u t o p h o s p h o r y l a t i n ua s s a yw a sp e r f o r m e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta t l t p k 1h a sp r o t e i nk i n a s e a c t i v i t y w h i c hc a np r o v i d et h ec l u e sf u ri n t e r p r e t i n gt h ep o s s i b l ef u n c t i o no f5 6 一k i n a s ei n t h e p h o t o m o r p h o g e n e s i s t h ef u s 6 c s n l 3 4w a su s e dt od ot h ec o i m m u n o p r e c i p i t a t i o nr c 0 一i p o f5 6 k i n a s ea n d c s nu s i n gt h ea n t i a t l t p k 1 a n t i c s n 4 a n da n t i c s n 5a n t i b o d i e s t h er e s u l ts h o w e dt h a t 5 6 一k i n a s ec a nc o i m m u n o p r e c i p i t a t e dw i t hc s ni na r a b i d o p s i s b a s e do nc o i pa n dt h er e s u l t t h a tb o t ha t l t p k 1a n dc s nw e r el o c a t e di nt h en u c l e u s w et h i n kt h a ti ti sp o s s i b l ef o rt h e a s s o c i a t i o no f5 6 k i n a s ea n dc s ni na r a b i d o p s i s i no a fr e s e a r c h i tw a sf o u n dt h e5 6 l i n a s em a yb ei n v o l v e di np h o t o m o r p h o g e n e s i su n d e r r e dl i g h ti na r a b i d o p s i s p o s s i b l yv i ai n t e r a c t i o nw i t hc s n t h er o l eo f5 6 k i n a s ei n p h o t o m o r p h o g e n e s i si sp o s s i b l yb a s e do i li t sa c t i v i t yo fp r o t e i nk i n a s e b u tt h ep r o c e s so fp l a n t p h o t o m o r p h o g e n e s i si sv e r yc o m p l e xa n dt h ed e t a i l e dm e c h a n i s mf o r5 6 一k i n a s ei n v o l v i n gi n p h o t o m o r p h o g e n e s i ss t i l ln e e d st os t u d yf u r t h e r k e yw o r d s a r a b i d o p s i s c o p 9s i g n a l o s o m e i n o s i t o l1 3 4 t r i s p h o s p h a t e5 6 k i n a s e p r o t e i n i d n a s e r e dl i g h t m 英文縮寫 a c r a t l t p k 一1 a t l t l 2 a p b c i p b i s b s a c d s c l 2 c o i p c s n d r r e b g f p g s t i n s 1 3 4 p 3 i n s 1 3 4 5 p 4 i n s 1 3 4 5 6 p s i n s 1 3 4 6 p 4 i n s 1 4 5 p 3 l n s 3 4 5 6 p 4 l n s p 6 i p 3 l n s p 3 i p t g k a n n b t p b s p k d 英文名稱 縮略詞 a c r y l a m i d e a r a b i d o p s i si n o s i t o l1 3 4 t r i s p h o s p h a t e5 6 k i n a s e a r a b i d o p s i s i n o s i t o l 5 6 k i n a s e l i k ep r o t e i n1 a r a b i d o p s i s i n o s i t o l 5 6 一k i n a s e l i k ep r o t e i n2 1 3 4 一t r i s p h o s p h a t e j 3 4 t r i s p h o s p h a t e a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 5 b r o m o 4 c m o r o 一3 一i n d o l y lp h o s p h a t e n n m e t h y l e n eb i s a c r y l a m i d e b o v i n es e r u ma l b u m i n c o d i n g s e q u e n c e p r o t e i nk i n a s ec k 2 c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n c o p 9s i g n a l o s o m e d i t h i o e r y t h r e i t o l e t j l i d i n mb r o m i d e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g l u t a t h i o n e s t r a n s f e r a s e i n o s i t o l1 3 4 一t r i s p h o s p h a t e l n o s i t o l1 3 4 5 t e t r a p h o s p h a t e i n o s i t o l1 3 4 5 6 p e n t a p h o s p h a t e l n o s i t o l1 3 4 6 一t e t r a p h o s p h a t e i n o s i t o l1 4 5 t r i s p h o s p h a t e l n o s i t o l3 4 5 6 t e t r a p h o p h a t e i n o s i t o l1 2 3 4 5 6 一h e x a p h o s p h a t e i n s 1 4 5 p 3 i s o p r o p y l t h i o b o g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n a m y c i n p n i t r o b l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p r o t e i nk i n a s ed v i 中文名稱 丙烯酰胺 擬南芥1 3 4 一三磷酸肌 醇5 6 一激酶 擬南芥1 3 4 三磷酸肌 醇5 6 一激酶類似物蛋白 l 擬南芥i 3 4 三磷酸肌 醇5 6 一激酶類似物蛋白 2 堿性磷酸酯酶 5 一溴4 氯 3 吲哚磷酸甲 苯胺藍(lán) 甲叉雙丙烯酰胺 牛血清白蛋白 編碼序列 蛋白激酶c k 2 免疫共沉淀 c o p 9 信號(hào)體 二硫蘇糖醇 溴化乙錠 綠色熒光蛋白 谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶 1 3 4 三磷酸肌醇 1 3 4 5 四磷酸肌醇 1 3 4 5 6 五磷酸肌酵 1 3 4 6 四磷酸肌醇 1 4 5 三磷酸肌醇 3 4 5 6 四磷酸肌醇 l 2 3 4 5 6 六磷酸肌 醇 1 4 5 三磷酸肌醇 異丙基 p d 一硫代半乳 糖苷 卡那霉素 氯化硝基四氮唑藍(lán) 磷酸鹽緩沖液 蛋白激酶d p m s f p t d l n s 4 5 p 2 r i f r l r n a s e a s d s t r i s w l w t x g a l p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l4 5 b i s p h o s p h a t e r i f a m p i n r e dl i g h t r i b o n u c l e a s ea s o d i u md o d e e y ls u l f a t e t r i s t h y d r o z y m e t h y l 一a m i n om e t h a n e w h i t el i g h t w i l dt y p e 5 b r o m o 4 c h l o r o 3 一i n d o l y l d g a l a c t o s i d e v u 苯甲基磺酰氟 磷脂酰肌醇4 5 二磷酸 利福平 紅光 核糖核酸酶a 十二烷基磺酸鈉 三羥甲基氨基甲烷 白光 野生型 5 澳 4 氯 3 吲哚 d 半 乳糖苷 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研 究成果 盡我所知 除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外 論文中不包含其它 人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果 也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè) 入學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu) 的學(xué)位或證書而使用過的材料 與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均 已在論文中作了明確的說明并表示了謝意 研究生簽名 蒸缸確 時(shí)間 j 年舌月 f 1 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 即 學(xué)校有權(quán) 保留送交論文的復(fù)印件和磁盤 允許論文被查閱和借閱 可以采用影印 縮印或 掃描等復(fù)制手段保存 匯編學(xué)位論文 同意中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同 媒體上發(fā)表 傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 霹究生簽名 景洛棚 導(dǎo)師簽名 時(shí)間 7 哪 年 月 尸日 時(shí)風(fēng)似修韻月仞日 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 第一章文獻(xiàn)綜述 1 1 磷酸肌醇激酶的研究進(jìn)展 植物生活在不斷變化的環(huán)境中 必然會(huì)感受外界環(huán)境的變化 如光 溫度 重力 水分等 隨之作出相應(yīng)的生理生化反應(yīng)來適應(yīng)環(huán)境 從而達(dá)到生長(zhǎng)發(fā)育的目的 外界的刺激一般是通過一 系列的步驟轉(zhuǎn)換成胞內(nèi)的信使分子 這些信使分子再通過其受體蛋白或蛋白質(zhì)磷酸化 引起生理 生化反應(yīng)的啟動(dòng)與放大 植物細(xì)胞中的肌醇磷脂信號(hào)系統(tǒng)參與了植物細(xì)胞代謝 生理過程的許多 方面 早在2 0 世紀(jì)5 0 年代 h o k i n 等就觀察到乙酰膽堿刺激胰臟中肌醇磷脂類的代謝 h o n 等 1 9 5 3 之后人們發(fā)現(xiàn) 某些特殊的磷酸肌醇類化合物與外部信號(hào)闊存在著密切的聯(lián)系 動(dòng)物細(xì)胞 中 肌醇磷脂循環(huán)在多種生長(zhǎng)因子和激素調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起核心作用 近年來的 研究發(fā)現(xiàn) 植物細(xì)胞中也存在一個(gè)和動(dòng)物細(xì)胞類似的肌酵磷脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) 可見 磷酸肌醇代 謝在動(dòng)植物細(xì)胞中扮演著重要的角色 1 1 11 4 5 一三磷酸肌醇3 一激酶 磷酸肌醇代謝在生物感受胞外刺激及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用 在這條代謝途徑中 許多 催化可溶性多磷酸肌醇的磷酸化和去磷酸化反應(yīng)的激酶和磷酸醑酶參與了反應(yīng) h a n k sa n d o u i n n 1 9 9 1 這些酶蛋白可以完成各種磷酸肌醇之間的轉(zhuǎn)化 而且其中一些激酶還具有蛋白激 酶的功能 它們通過磷酸化調(diào)控 些蛋白質(zhì)包括轉(zhuǎn)錄因子的活性 進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá) l 4 5 一三磷酸肌醇3 一激酶 即通常所說的肌醇多磷酸激酶 簡(jiǎn)稱i p k 在動(dòng)物細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)中起著非常重要的作用 它催化1 4 5 三磷酸肌醇的3 一磷酸化 調(diào)節(jié)著i n s 1 4 5 p 和i n s 1 3 4 5 p 的水平 c o m m u n i 等 1 9 9 5 i n s 1 4 5 p 3 是關(guān)鍵的二級(jí)信使 它負(fù)責(zé)局部c a 的瞬時(shí)增加 b e r r i d g ea n di r v i n e 1 9 8 9 b e r r i d g e 1 9 9 7 有證據(jù)表明i n s 1 3 4 5 p 本身也可以通過促進(jìn)c a 2 扣押 s e q u e s t r a t i o n 或與i n s p s 互作促進(jìn)胞肉c f 庫的釋放來調(diào)節(jié)胞內(nèi) c a 濃度 m o r r i s 等 1 9 8 7 也有證據(jù)表明i n s 1 3 4 5 p 是一個(gè)直接的二級(jí)信使 使胞c a 2 庫釋放c a 2 l u e k h o f fa n dc l a p h a m 1 9 9 2 各種組織中 特異的i n s 1 3 4 5 p 4 受體的發(fā)現(xiàn) 進(jìn)一步支持了i n s 1 3 4 5 p 在肌醇磷酸信號(hào)途徑中的作用 c u l l e n 1 9 9 8 擬南芥的1 4 5 一 三磷酸肌醇3 一激酶 a t l p k 2 9 是一個(gè)3 3 k d 的蛋白 它與動(dòng)物以及酵母的同源性僅有2 5 缺少鈣調(diào) 索的結(jié)合位點(diǎn) x i a 等 2 0 0 3 擬南芥的重組的a t i p k 2 b 不僅能磷酸化i n s 1 4 5 p 3 生成i n s 1 4 5 6 p 也可以生成i n s 1 3 4 5 6 p b 而且還能磷酸化i n s i 3 4 5 p 4 生成i n s 1 3 4 5 6 p 表明該酶為d 3 t d 6 位雙重特異的磷酸肌酵激酶 x i a 等 2 0 0 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 1 1 21 3 4 一三磷酸肌醇5 6 一激酶 1 3 4 一三磷酸肌醇5 6 一激酶 以下簡(jiǎn)稱5 6 一激酶 是磷酸肌醇代謝過程中的一種重要的酶 它催化1 3 4 三磷酸肌醇在5 或6 位磷酸化 生成兩種四磷酸肌醇產(chǎn)物 l 3 4 5 一四磷酸肌酵 i n s 1 3 4 5 和l 3 4 6 一四磷酸肌醇 i n s 1 3 4 6 n 在動(dòng)物中這兩種產(chǎn)物的比例為1 3 在植物中兩種產(chǎn)物的比例是3 l 同時(shí) 這也是包括植酸 i n s p e 在內(nèi)的多磷酸肌醇形成的第 一步 w i l s o na n dm a j e r u s 1 9 9 7 有證據(jù)表明 5 6 一激酶是一種在動(dòng)物 植物 甚至線蟲中 都比較保守的多功能酶 f i e l d 等 2 0 0 0 動(dòng)物中它不僅具有磷酸肌醇激酶活性 而且有蛋白 激酶活性 w i ls o n 等 2 0 0 1 但是植物中 目前只有磷酸肌醇激酶活性的報(bào)道 沒有蛋白激酶 活性的相關(guān)報(bào)道 另外 5 6 一激酶也是一種多功能的肌醇激酶 在線蟲 點(diǎn)h i s t o 砂t i c a 中 i n s 1 3 4 5 6 一激酶以i n s 1 3 4 p s 和i n s 1 4 5 p a 作為底物 f i e l d 等 2 0 0 0 當(dāng)以i n s 1 4 5 p s 為底物時(shí) 產(chǎn)物只有i n s 1 3 4 5 p 最近的研究表明 人的5 6 激酶還具有3 4 5 6 四磷酸肌醇 i n s 3 4 5 6 r 卜激酶的活性 即以i n s 3 4 5 6 p 溈底物產(chǎn)生i n s p y a n g 等 2 0 0 0 1 9 9 7 年 w i l s o n 等首次從擬南芥中克隆了1 3 4 三磷酸肌醇5 6 一激酶基因 并在大腸桿菌 中表達(dá)了融合蛋白 經(jīng)測(cè)定該蛋白具有l(wèi) 3 4 三磷酸肌醇5 6 一激酶活性 w i l s o n 等 1 9 9 7 1 9 9 8 年 p h i l l i p l j y 在未成熟大豆中發(fā)現(xiàn)了各自獨(dú)立的1 3 4 z 磷酸肌醇5 一激酶和l 3 4 三磷 酸肌醇6 一激酶插性 b r i a n 等 1 9 9 8 2 0 0 3 年 s h i 等在玉米中發(fā)現(xiàn)了該酶基因 并發(fā)現(xiàn)該基 因的缺失可以降低種子的植酸 i n s p s 含量 使玉米可以更好地被動(dòng)物消化 s h i 等 2 0 0 3 同時(shí) 陳其軍等 2 0 0 3 又在擬南芥中克隆到一個(gè)5 6 一激酶類似物基因 命名為a t 尼i 對(duì)其 進(jìn)行b l a s t 分析發(fā)現(xiàn) 擬南芥中還存在一個(gè)5 6 一激酶類似物基因 命名為 豇幺其中 j 慰 療勺m 心a 前體具有兩種剪切方式 分別生成兩種d r n a 或相應(yīng)豹c 1 n a 被分別命名為彳h 花婦和 a t i r l l b 陳其軍等 2 0 0 3 下面綜合近年來在哺乳動(dòng)物等領(lǐng)域的研究資料 就5 6 激酶的生理生化特點(diǎn)概括如下 1 1 2 15 6 激酶具有多樣化的肌醇激酶活性 真核細(xì)胞中最豐富的可溶性磷酸肌醇是1 3 4 5 6 五磷酸肌醇 i n s p s 和六磷酸肌醇 i n s p 6 其生物合成的一條重要途徑為 i n s 1 4 5 p 一i n s 1 3 4 5 p t i n s 1 3 4 p 3 一i n s 1 3 4 6 p 一i n s 1 3 4 5 6 如一i n s p s 5 6 一激酶能夠催化1 3 4 三磷酸肌醇 i n s i 3 4 n 產(chǎn)生1 3 4 6 四磷酸肌醇 i n s 1 3 4 6 p 和1 3 4 5 四磷酸肌 醇 i n s 1 3 4 5 p 是更高級(jí)形式的肌醇多磷酸鹽 包括i n s p 異構(gòu)體 i n s p s 和i n s p 生物合 成的關(guān)鍵調(diào)控酶之一 v e r b s k y 等 2 0 0 2 s t e v e n s o n p a u l i k 2 0 0 2 最近的研究表明 人的 5 6 一激酶還具有3 4 5 6 一四磷酸肌醇 i n s 3 4 5 6 卜激酶活性 y a n g 等 2 0 0 0 即以 i n s 3 4 5 6 p 4 為底物產(chǎn)生i n s 1 3 4 5 6 p s 玉米5 6 一激酶同哺乳動(dòng)物的一樣 除具有 i n s 1 3 4 p 5 6 一激酶活性外 也有i n s 3 4 5 6 p 卜激酶活性 此外 玉米5 6 一激酶還可以 磷酸化i n s 3 5 6 p s 和i n s 1 2 5 6 p 一 s h i 等 2 0 0 3 近年來 各種肌醇多磷酸 包括 i n s 1 3 4 p 3 y a n g 等 1 9 9 9 i n s 1 3 4 5 p i r v i n ea n ds c h e l l 2 0 0 1 i n s 1 3 4 6 p l i r v i n ea n ds c h e l i 2 0 0 1 i n s 3 4 5 6 p 4 z o n i a 等 2 0 0 2 i n s p 6 l e m t i r i e h l i e h 等 2 0 0 0 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 等 的生理生化功能開始得到闡明 1 1 2 25 6 激酶還具有蛋白激酶的活性 能夠磷酸化轉(zhuǎn)錄因子 小牛腦5 6 一激酶能磷酸化參與脅迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子c j u n 和a t f 2 這是肌醇激酶具有蛋白 激酶活性的第一例報(bào)告 在此之前有研究表明以磷脂酰肌醇磷酸為底物的幾個(gè)激酶具有蛋白激酶 的活性 v i l s o i l 等 2 0 0 1 另外 5 6 一激酶還具有自身磷酸化的能力 s u n 等 2 0 0 2 但是植 物中5 6 一激酶是否具有蛋白激酶活性 還沒有報(bào)道 如果有蛋白激酶活性 其靶分子是什么 這 些都是有待于解決的問題 1 1 2 35 6 激酶與c o p 9 信號(hào)體之間存在相互作用的關(guān)系 在純化小牛腦5 6 一激酶過程中 發(fā)現(xiàn)5 6 一激酶與c o p 9 信號(hào)體免疫共沉淀 表明細(xì)胞內(nèi)的5 1 6 一 激酶和c o p 9 信號(hào)體存在一種相互作用的關(guān)系 w i i s o n 等 2 0 0 1 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn) 5 6 激 酶與c o p 9 信號(hào)體的c s n l 亞基結(jié)合 在h e k 2 9 3 細(xì)胞中超表達(dá)5 6 一激酶可以提高c o p 9 信號(hào)體 的c s n 5 亞基的含量 s u n 等 2 0 0 2 c o p 9 信號(hào)體最初是美國(guó)耶魯大學(xué)的鄧興旺實(shí)驗(yàn)室在研究光 形態(tài)建成突變體過程中發(fā)現(xiàn)的 w e i 等 1 9 9 4 c o p 9 復(fù)合物在哺乳動(dòng)物和高等植物中是高度保 守的 w e i 等 1 9 9 8 5 6 一激酶可能在哺乳動(dòng)物中通過和c 0 p 9 信號(hào)體相互作用參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過 程 但目前仍不清楚植物的5 6 一激酶是否同哺乳動(dòng)物一樣與c o p 9 信號(hào)體相互作用 1 1 2 45 6 激酶參與生物對(duì)逆境脅迫的反應(yīng) 原生蟲的5 6 一激酶基因的表達(dá)受熱誘導(dǎo) v e r b s k y 等 2 0 0 2 表明原生蟲的5 6 一激酶參與 了逆境脅迫反應(yīng) 陳其軍等對(duì)擬南芥3 個(gè)5 6 一激酶類似物基因在正常和脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行了 n o r t h e r nb l o t 分析 結(jié)果表明 其中的2 個(gè)基因可能分別以依賴于a b a 和不依賴于a b a 的方式 參與對(duì)逆境脅迫的反應(yīng) 陳其軍等 2 0 0 3 在鹽處理的鹽生植物冰草中也發(fā)現(xiàn)5 6 激酶類似物 的存在 在g e n b a n k 上的登錄號(hào)為b e 0 3 7 0 4 0 哺乳動(dòng)物的5 6 一激酶可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子c j u n 和a t f 一2 而后者還可被脅迫激活的 l a p k 蛋白激酶所磷酸化 稱為依賴于2 a c u a p k 的磷酸化途 徑 該j n k m a p k 蛋白激酶屬于三個(gè)m a p k s 亞類中的一類 受滲透脅迫 u 射線和其它的脅迫條 件誘導(dǎo)而激活 d a v i s 2 0 0 0 p e a r s o n 等 2 0 0 1 因此 在哺乳動(dòng)物中5 1 6 一激酶和j n k i d a p k 蛋白激酶共同調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c j u n 和a t f 2 的活性 參與脅迫反應(yīng) 1 2 植物光受體的研究進(jìn)展 光是植物和其它一切生物賴以生存的能量來源 同時(shí) 光也是最重要的環(huán)境因子之一 在植 物發(fā)育的整個(gè)過程中扮演著重要的角色 它可以作為一種環(huán)境信號(hào)參與調(diào)控植物的整個(gè)發(fā)育過 程 即從種子萌發(fā) 幼苗生長(zhǎng)到植物的生殖 衰老和體眠的各個(gè)階段 從基因表達(dá)的分子水平到 器官建成 光無所不在地起著信號(hào)開關(guān)的作用 使植物獲得最大的生存和繁衍的優(yōu)勢(shì) 黑暗中生長(zhǎng)的雙子葉植物的幼苗下胚軸伸長(zhǎng) 莖細(xì)長(zhǎng)柔弱 頂端彎鈞不伸直 葉片小且不擴(kuò) 展 缺乏叫綠素呈白色或黃色 葉綠體發(fā)育不正常 許多酶的活性也低 黑暗中生長(zhǎng)的單子葉植 物上胚軸或第一節(jié)間特別長(zhǎng) 葉片卷緊不伸展 這就是所謂的暗形態(tài)建成 或稱黃化現(xiàn)象 而在 光下生長(zhǎng)的植物 下胚軸彎鉤伸直 葉片展開 葉綠體發(fā)育完善 表現(xiàn)出組織和器官建成等形態(tài) 變化 即植物的光形態(tài)建成 p a n k h a u s e ra n dc h o r y 1 9 9 7 張蜀秋 2 0 0 3 圖1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 o n u 水 暗形態(tài)建成光形態(tài)建成 圖1 擬南芥幼苗在光下和黑暗中生長(zhǎng)的表型比較 w a n ga n dd e n g 2 0 0 4 進(jìn)化過程中 高等植物發(fā)展了一套極其精細(xì)的光信號(hào)接受系統(tǒng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) 它能對(duì)光的 有無 光的波長(zhǎng) 強(qiáng)度的變化等作出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng) f a n k h a u s e ra n dc h o r y 1 9 9 7 目前 己知的 植物光受體有三類 光敏色素 接收紅光和遠(yuǎn)紅光信號(hào) b u t l e r 等 1 9 5 9 q u a i l 等 1 9 9 5 f a n k h a u s e ra n dc h o r y 1 9 9 7 隱花色素或藍(lán)光 紫外光 a 受體 接收藍(lán)光和3 3 0 3 9 0 n m 的紫外 光 a h m a da n dc a s h m o r e 1 9 9 3 f a n k h a u s e ra n dc h o r y 1 9 9 7 紫外光一b 受體 接收2 8 0 3 2 0 n m 的紫外光 f a n k h a u s e ra n dc h o r y 1 9 9 7 1 2 1 光敏色素 早在4 0 多年前 美國(guó)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)了植物中的光信號(hào)受體 為第1 個(gè)發(fā)現(xiàn)的光受體分 子 他們把這種含有色素的分子稱為光敏色素 b u t l e r 等 1 9 5 9 這樣 一門以研究光對(duì)植物的 影響的學(xué)科一光形態(tài)發(fā)生學(xué) p h o t o m o r p h o g e n e s i s 就迅速成為植物生理學(xué)的主要分支 章東方 等 2 0 0 3 1 9 8 3 年 有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分離并純化出光敏色素蛋白 1 9 8 7 年 第1 個(gè)光敏色素基困得 到報(bào)道 1 9 8 9 年 植物中的光敏色素基因得到分離 如從擬南芥中分離出5 個(gè)光敏色素基因 而 從豌豆中則分離出2 個(gè)光敏色索基因 q u a i l 等 1 9 9 5 植物生物化學(xué)和分子遺傳學(xué)研究的不斷 發(fā)展 使得人們對(duì)植物光敏色素本質(zhì)的認(rèn)識(shí)也不斷地深入 植物光敏色素是對(duì)不同波長(zhǎng)光反應(yīng)產(chǎn) 生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的光受體 它可以在無活性和有活性形式之間轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 使植物發(fā)育與光 環(huán)境相協(xié)調(diào) 章東方等 2 0 0 3 在模式植物擬南芥中 編碼光敏色素脫輔基酶的基因有5 個(gè) 它們分別是光敏色素a p h y a 光敏色素b p h y b 光敏色素c p h y c 光敏色素d p h y d 和光敏色素e p h y e 不同植物中發(fā)現(xiàn)的 光敏色素基因的命名不完全一致 s m i t h 2 0 0 0 其中 光敏色素a 基因編碼一個(gè)光不穩(wěn)定的脫 輔基蛋白 p h y a 它在白化苗中含量相對(duì)商一些 當(dāng)它轉(zhuǎn)變成p f r 形式后便會(huì)很快消失掉 o u a i l 等 1 9 9 5 其它四個(gè)基因編碼的光敏色素蛋白含量則更低 但它們是光穩(wěn)定的 f a n k h a u s e ra n d c h o r y 1 9 9 7 不同類型的光敏色素在不同光條件下行使特定的功能 如p h y a 主要在遠(yuǎn)紅光控制 幼苗下胚軸的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)中起作用 而p h y b 主要在紅光抑制幼蓖下胚軸生長(zhǎng)中起作用 f a n k h a u s e r a n dc h o r y 1 9 9 7 張蜀秋 2 0 0 3 現(xiàn)在已經(jīng)從藍(lán)藻 羊齒植物 裸子植物和許多被子植物中分 4 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文第一霉文獻(xiàn)綜述 離鑒定出光敏色素基因和相關(guān)蛋白 p r a t t 1 9 9 5 光敏色素脫輔基酶蛋白是一個(gè)分子量約為1 2 0 k d 的可溶性蛋白 f a n k h a u s e ra n d c h o r y 1 9 9 7 溶液中 它以二聚體的形式存在 即每個(gè)單體有2 個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域 它們中間通過 1 個(gè)易被蛋白酶降解的鉸鏈區(qū)連接 f a n k h a u s e ra n dc h o r y 1 9 9 7 章東方等 2 0 0 3 圖2 光敏 色素的n 一端結(jié)構(gòu)域結(jié)合生色團(tuán) 它的作用是感應(yīng)接受光 其c 一端結(jié)構(gòu)域含有形成二聚體和其它生 物活性所需的位點(diǎn) j o n e sa n de d g e r t o n 1 9 9 4 q u a i l 等 1 9 9 5 光敏色素分子中 每個(gè)單體 通過n 一端結(jié)構(gòu)域上的半胱氮酸結(jié)合一個(gè)生色團(tuán) 該生色團(tuán)為線形的四吡略 t e t r a p y r r o l e 分子 它可以與半胱氨酸形成硫酯鍵 f a n k h a u s e ra n dc h o r y 1 9 9 7 每個(gè)光敏色素單體蛋白可以以兩 種穩(wěn)定的形式存在 吸收紅光的形式 p r 是一種沒有生物活性或生物活性不明確的形式 和 吸收遠(yuǎn)紅光的形式 p f r 是一種在生物體內(nèi)發(fā)揮功能的活性形式 a n d e l 等 1 9 9 6 f a n k h a u s e r a n dc h o r y 1 9 9 7 p r 和p f r 兩種形式之間的光轉(zhuǎn)化牽涉到四毗咯生色團(tuán)的可逆異構(gòu)化作用 異構(gòu) 化作用使蛋白質(zhì)發(fā)生可逆的構(gòu)型變化 l j t 土r 惱r o 1 c l i g i l t 囂品 h 一 一 1 如 u c b 雌r l i s y a m c i m c y s t i s 俺o i 一 i l 囂餮 掣i i i i i l g l l f u r y i i i i 圍2植物光敏色素的結(jié)構(gòu)和相關(guān)結(jié)構(gòu)域的功能 章東方等 2 0 0 3 光轉(zhuǎn)換反應(yīng)有不同的中間體 p r 和p f r 形式之問的平衡在日光照射條件下需要幾分鐘時(shí)間 p r 形式的光敏色素最大吸收光譜為6 6 5 n m 接近葉綠素的最大吸收光譜 紅光 但p f r 形式的光 敏色素吸收光譜的波長(zhǎng)則更長(zhǎng) 為7 3 0 n m 遠(yuǎn)紅光 兩種形式的光敏色素吸收光譜重疊 所以 7 0 0 n m 以下的光也能激活光敏色素的這兩種形式 f a n k h a u s e ra n dc h o r y 1 9 9 7 日光條件下 o f t 形式占全部光敏色素的6 0 由于植物體內(nèi)光合色素對(duì)紅光豹吸收而使樹冠下群體中的p f r 形 式的光敏色素可低到僅占全部光敏色素的1 0 章東方等 2 0 0 3 圖3 使遠(yuǎn)紅光和紅光兩者之間 的比例下降 植物用光敏色素作為周圍的感應(yīng)器 改變自己的生長(zhǎng) 發(fā)育 形成避免蔭蔽癥 s h a d e a v o i d a n c er e s p o n s e s m i t h 1 9 9 5 p a r k s 等 1 9 9 6 r o b s o na n ds m i t h 1 9 9 6 感應(yīng) 到低的遠(yuǎn)紅光 紅光比率后