真菌學(xué)總論2012.pdf

1 真菌學(xué)總論 2 3 The spores in Penicillium often contain blue or green pigments which give the colonies on foods and feeds their characteristic colour It is the spores in the blue cheese that give the colour to the cheese 4 真菌概述 1 真菌 fungus 也稱Eumycota 來源于拉丁文的 fungus 即蘑菇 真菌學(xué) mycology來源于myks 也是蘑菇的意思 開始真菌和植物同為一類 因此命名按照國際植物 學(xué)命名法命名 真菌屬于真核細(xì)胞型微生物 與原核細(xì)胞型微生物 有很多區(qū)別 5 真菌概述 2 真菌是一種具有真正細(xì)胞核和細(xì)胞器的真核生 物 不含葉綠素 以吸收為營養(yǎng)方式 具無性和有 性兩種繁殖方式 菌體基本結(jié)構(gòu)為絲狀的菌絲體和 孢子 其細(xì)胞 壁含有幾丁質(zhì) 甲殼質(zhì) chitin 和葡聚糖 真菌在自然界中廣泛存在 估計有150萬種以 上 其中對人類有致病性的僅有300余種 6 原核細(xì)胞型微生物與真核細(xì)胞型微生物比較原核細(xì)胞型微生物與真核細(xì)胞型微生物比較 原核細(xì)胞型微生物原核細(xì)胞型微生物 真核細(xì)胞型微生物真核細(xì)胞型微生物 細(xì)胞核結(jié)構(gòu)細(xì)胞核結(jié)構(gòu) 核膜核膜 無無 有有 核仁核仁 無無 有有 分裂方式分裂方式 主要以二分裂主要以二分裂 有絲分裂 減數(shù)分裂有絲分裂 減數(shù)分裂 細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu) 質(zhì)膜質(zhì)膜 常缺乏固醇常缺乏固醇 常有固醇常有固醇 內(nèi)膜內(nèi)膜 較簡單 有中介體較簡單 有中介體 復(fù)雜 有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體復(fù)雜 有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體 核糖體核糖體 70S 80S 呼吸系統(tǒng)呼吸系統(tǒng) 質(zhì)膜或中介體質(zhì)膜或中介體 線粒體線粒體 7 真菌分類 生物中的三大超界或域 domain 真核域 細(xì) 菌域 古菌域 真核域的五界 動物界 植物界 真菌界 藻物 界 原生生物界 特征 動物界 藻物界 真菌 界 植物 界 原生生物界 營養(yǎng) 異養(yǎng) 攝食 自養(yǎng) 光合吸收 異養(yǎng) 吸收 自養(yǎng) 光合 自 異養(yǎng) 吞噬光合 細(xì)胞壁 無 纖維素 甲殼 質(zhì) 纖維 素 無 8 真菌分類真菌分類 與醫(yī)學(xué)有關(guān)的真菌為真菌界中的四個門 壺菌門 Chytridiomycota 接合菌門 Zygomycotina 子囊菌門 Ascomycotina 擔(dān)子菌門 Basidiomycotina 半知菌門 deutermycotina 按形態(tài)學(xué)分類 分為酵母菌 霉菌 蕈類 9 真菌定義的五大特點(diǎn) 具有真正的細(xì)胞壁 通常為分枝繁茂的菌絲體 菌絲呈頂端生 長 有硬的細(xì)胞壁 大多數(shù)為幾丁質(zhì) 通過細(xì)胞壁吸收營養(yǎng)物質(zhì) 分泌胞外酶降 解不被吸收的多聚物為簡單化合物而吸收 屬于異養(yǎng) 通過有性或無性繁殖方式產(chǎn)生孢子延續(xù) 10 真菌形態(tài)學(xué) 屬于真核生物 形態(tài)多種多樣 可以有性生殖和 無性生殖 并可借此而鑒定 形態(tài)學(xué)在真菌鑒定方面有重要的作用 真菌孢子 的發(fā)生 菌絲頂端生長 產(chǎn)生孢子 有不同的形 態(tài) 還可以根據(jù)色素 大小 形態(tài) 多分隔等作 為鑒定依據(jù) 有的真菌不需要核絲分裂而產(chǎn)孢 為無性期 需 要核絲分裂而產(chǎn)孢 為有性期 11 真菌細(xì)胞 12 單細(xì)胞真菌單細(xì)胞真菌 酵母菌 孢子 無菌絲酵母菌 孢子 無菌絲 類酵母菌 芽生孢子 假菌絲類酵母菌 芽生孢子 假菌絲 多細(xì)胞真菌多細(xì)胞真菌 絲狀菌 霉菌 孢子和菌絲 絲狀細(xì)胞絲狀菌 霉菌 孢子和菌絲 絲狀細(xì)胞 絲狀體絲狀體 菌絲體菌絲體 形成絨毛狀菌落形成絨毛狀菌落 真菌形態(tài)特征真菌形態(tài)特征 13 雙相真菌 酵母菌 37 霉菌 25 14 雙相真菌 組織胞漿菌 Histoplasma capsulatum 皮炎芽生菌 Blastomyces dermatidis 巴西副球孢子菌 Paracoccidioides brasiliensis 粗球孢子菌 Coccidioides immitis 馬內(nèi)菲青霉 Penicillium marneffei 申克孢子絲菌 Sporothrix schenkii 15 19 真菌菌落形態(tài) 真菌菌絲和孢子經(jīng)過大量生長繁殖 后可形成真菌集團(tuán) 叫菌落 colony 分三類 酵母型菌落 類酵母型菌落 絲狀型菌落 20 真菌菌落形態(tài) 酵母型菌落 大而厚 圓形 柔軟 光滑 濕潤 粘性奶酪樣 光鏡下可見單細(xì)胞的 芽生孢子 無假菌絲 21 真菌菌落形態(tài) 類酵母型菌落 外觀與酵母型菌落相 同 但是有假菌絲 22 真菌菌落形態(tài) 絲狀型菌落 呈絨毛狀 棉毛狀 粉末狀 光鏡下可見 有或無分隔 分枝或 不分枝 有色或無色 的菌絲 23 霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu) 霉菌的菌體由分枝或不分枝的菌絲組成 菌絲是真菌的營養(yǎng)體的基本單位 菌絲是中空管狀結(jié)構(gòu) 直徑一般3 10um 有分枝 有隔膜或無隔膜 根據(jù)菌絲有無隔膜 將真菌分為低等真 菌 鞭毛菌門和接合菌門 和高等真菌 子囊菌門 擔(dān)子菌門和半知菌門 許多菌絲分枝連接 相互交織在一起所 構(gòu)成的形態(tài)叫菌絲體 mycelium 24 菌絲分類 營養(yǎng)菌絲 vegetatile hypha 在固體培養(yǎng)基上深入基內(nèi)的菌絲 行吸 收養(yǎng)料的功能 氣生菌絲 aerial hypha 向空氣中生長的菌絲 繁殖菌絲 reproductive hypha 氣生菌絲發(fā)育到一定階段分化成繁殖菌 絲 25 菌絲分類 無隔菌絲 1 為長管狀單細(xì)胞 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含多個核 2 生長表現(xiàn)為菌絲的延長和細(xì)胞核的增多 這是低等真菌所具有的菌絲類型 有隔菌絲 1 菌絲有隔膜 被隔膜隔開的一段菌絲就是 一個細(xì)胞 菌絲由多個細(xì)胞組成 每個細(xì)胞內(nèi) 含有一個或多個核 2 隔膜上有單孔或多孔 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核可 以自由流通 每個細(xì)胞功能相同 這是高等真 菌所具有的類型 26 27 菌絲菌絲 Spore Germinating Spore Food Source Mycelium 28 菌絲菌絲 有隔菌絲 無隔菌絲 29 菌絲類型 透明無隔菌絲 透明有隔菌絲 暗色有隔菌絲 30 菌絲類型 假根 鹿角樣菌絲 球拍狀菌絲 螺旋菌絲 31 真菌的繁殖 酵母的繁殖主要包括芽殖和裂殖兩個類 型 菌絲繁殖包括孢子囊孢子 發(fā)芽形成分 生孢子 隔膜斷離形成關(guān)節(jié)孢子三類 許多真菌繁殖 不止一種方式 如毛孢 子菌有出芽和關(guān)節(jié)孢子兩種繁殖方式 32 酵母菌繁殖方式 包括芽殖和裂殖 芽殖 從細(xì)胞壁的某一點(diǎn)發(fā)芽 母細(xì)胞進(jìn)行核 分裂 一部分核進(jìn)入子細(xì)胞 以后在母細(xì)胞和 子細(xì)胞之間產(chǎn)生橫隔 成熟后從母體分離 母 體上遺留一個瘢痕 芽殖的出芽方式 多邊出芽 兩端出芽 三邊出 芽 單邊出芽 環(huán)境適宜的時候出現(xiàn)假菌絲 裂殖 細(xì)胞首先加長 核一分為二 中央產(chǎn)生 橫隔 分成2個子細(xì)胞 進(jìn)行裂殖的酵母菌種類較少 33 霉 菌 繁 殖 方 式 繁殖方式 孢子 菌絲片斷 有性孢子 無性孢子 卵孢子 接合孢子 子囊孢子 擔(dān)孢子 孢囊孢子 分生孢子 節(jié)孢子 厚垣孢子 34 35 孢子囊孢子 形成特征 形成于菌 絲的特化結(jié)構(gòu) 孢子 囊內(nèi) 孢子形態(tài) 近圓形 根霉 毛霉 36 分生孢子 形成特征 由分生孢 子梗頂端細(xì)胞特化成 單個細(xì)胞或成簇的孢 子 曲霉 青霉 37 節(jié)孢子 由菌絲斷裂形成 常呈現(xiàn)串狀 短柱狀 白地霉 38 厚垣孢子 部分菌絲細(xì)胞質(zhì)濃縮 變圓 周圍生出厚壁 而成 總狀毛霉 39 有性繁殖 同宗配合和異宗配合 同宗配合 在同一純菌落里 不需要交 配 產(chǎn)生同宗真核細(xì)胞有性期 異宗配合需要交配株 才能產(chǎn)生有性期 孢子 有性繁殖三要素 胞質(zhì)融合 核融合 減數(shù) 分裂 40 子囊孢子 子囊 兩性細(xì)胞接觸后形成的囊狀結(jié)構(gòu) 兩個營養(yǎng)細(xì)胞直接交配而成 外面沒有 菌絲包裹 從一個特殊的成為產(chǎn)囊絲的結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生 子囊 多個子囊外面被菌絲包圍而成子 實(shí)體 成為子囊果 屬于子囊菌綱 41 子囊孢子 42 接合孢子 由菌絲生出的結(jié)構(gòu)大 小相似 形態(tài)相同的 或略有不同的兩個配 子囊接合后發(fā)育而成 屬于接合菌綱 43 44 真菌的生長特性真菌的生長特性 營養(yǎng)要求不高 常用沙保氏培養(yǎng)基 基本成分 葡萄糖 蛋白胨 瓊脂 生長條件 pH4 0 6 0 溫度22 28 深部 真菌37 較高的濕度 O2 45 臨床標(biāo)本的采集種類臨床標(biāo)本的采集種類 1 皮膚的角質(zhì)性物質(zhì) 毛發(fā) 指 趾 甲 皮屑等 2 各種分泌物和排泄物 生殖道分泌物 耳垢 痰 糞便 尿液等 3 血液和體液 體液包括胸水 腹水 腦 脊液 淋巴穿刺液等 4 膿汁及滲出物 46 采集標(biāo)本注意事項(xiàng)采集標(biāo)本注意事項(xiàng) 1 采集的標(biāo)本要適宜 不同真菌感染應(yīng)采 取不同的臨床標(biāo) 本 懷疑為淺部真菌感染 如體癬 應(yīng)刮取病變邊緣的痂 皮屑 發(fā) 癬應(yīng)取折斷了的病發(fā) 懷疑為深部真菌感 染應(yīng)取血液 腦脊液 痰 膿汁等 2 在用藥前采集標(biāo)本 一般真菌標(biāo)本須在 用藥前采集 對已用藥者則需停藥一段時 間后再采集標(biāo)本 47 采集標(biāo)本注意事項(xiàng)采集標(biāo)本注意事項(xiàng) 3 采集的標(biāo)本量要足 血液和腦脊液標(biāo)本5ml 胸腔液20ml 皮屑標(biāo)本兩塊 活體組織兩份 一 份送病理科檢查 一份作鏡檢和培養(yǎng) 4 嚴(yán)格無菌操作 在采集標(biāo)本時嚴(yán)格無菌操作 并進(jìn)行消毒處理 尤其是在采集血液和腦脊液標(biāo) 本時 要避免污染雜菌 5 采集的標(biāo)本立即送檢 對采集的標(biāo)本應(yīng)立即送 檢 特別是深部真菌標(biāo)本采集后最長不超過2h 48 真菌的檢驗(yàn)方法真菌的檢驗(yàn)方法 1 鏡檢真菌形態(tài) 2 真菌抗原檢測 3 真菌分離培養(yǎng)與鑒定 4 真菌核酸檢測 5 真菌毒素檢測 49 真菌標(biāo)本直接檢查真菌標(biāo)本直接檢查 1 直接鏡檢 方法簡便 快速 10 KOH 微加熱 低倍 高倍鏡檢查 有無菌絲 孢子 角質(zhì)標(biāo)本 皮膚癬菌 直接觀察直接觀察 染色后觀察染色后觀察 2 抗原檢測 采用免疫學(xué)方法檢測真菌抗原 常用的方法有膠 乳凝集試驗(yàn) ELISA 半定量放射免疫測定法 50 常用的染色方法常用的染色方法 常用的染色方法有革蘭染色 瑞氏染色 熒光染色 乳酸酚棉藍(lán)染色 還有墨汁負(fù)染色等 對檢測骨髓和外周血中的莢膜組織胞漿菌 需作瑞 氏染色或姬氏染色后鏡檢 檢測病人腦脊液標(biāo)本中新生隱球菌 需作墨汁負(fù)染 色后檢查 背景為黑色 新生隱球菌和莢膜不著色 51 直接鏡檢意義直接鏡檢意義 陽性結(jié)果意義 1 有診斷意義 如淺部真菌病 隱球菌病 皮膚粘膜假絲酵母菌病等 2 代表組織相 直接鏡檢看到的真菌形態(tài)就 是該真菌的組織形態(tài) 如假絲酵母的菌絲 淺部真菌的厚膜孢子等 確定某些致病性 真菌屬或種 如皮膚癬菌 曲霉等 3 判斷某些真菌種的致病性等 52 直接鏡檢意義直接鏡檢意義 直接鏡檢局限性 1 陰性結(jié)果不能排除真菌感染 直接鏡檢 不如培養(yǎng)敏感 其敏感性隨標(biāo)本類型 數(shù)量 采集時間和質(zhì)量等而有所不同 2 有假陽性結(jié)果 如溶解的淋巴細(xì)胞在腦 脊液印度墨汁濕片中易誤認(rèn)為新生隱球 菌 脂肪微滴也可與出芽酵母細(xì)胞混淆 53 分分 離離 培培 養(yǎng)養(yǎng) 真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的唯一方法 培養(yǎng)成功與否與采集的標(biāo)本是否適當(dāng) 是否新鮮 培養(yǎng)基的選擇 培養(yǎng)溫度與 時間等有關(guān) 大多數(shù)真菌培養(yǎng)的溫度為28 但深部 真菌為37 對二相性真菌培養(yǎng)時 28 培養(yǎng)真菌呈菌絲相 霉菌型 37 培 養(yǎng)為組織相 酵母型 54 真菌培養(yǎng)方法真菌培養(yǎng)方法 平皿培養(yǎng) 表面較大可使標(biāo)本散布 便于觀察 菌落形態(tài) 但水分易蒸發(fā) 只能培養(yǎng)生長繁 殖較快的真菌 如假絲酵母菌 隱球菌 大試管培養(yǎng) 水分不易蒸發(fā) 主要用于皮膚癬 菌的培養(yǎng)和真菌菌種的保存 玻片培養(yǎng) 微量培養(yǎng) 小培養(yǎng) 可用于真菌菌 種的鑒定 55 觀察菌落形態(tài)時注意觀察菌落形態(tài)時注意 1 菌落性質(zhì) 是酵母菌還是霉菌 2 菌落大小 一般病原性真菌菌落小 而條件致病性 真菌菌落大 3 菌落顏色 一般病原性真菌顏色淡 污染真菌顏 色深 4 致病性真菌菌落下沉 污染性真菌菌落不下沉 致 病性真菌有時使培養(yǎng)基開裂 但污染霉菌很少引 起培養(yǎng)基開裂 56 真真 菌菌 鑒鑒 定定 菌種鑒定是一個復(fù)雜過程 僅觀察菌落形態(tài)是 遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的 還需作生化反應(yīng) 分子生物學(xué)鑒 定 必要時將菌種送有關(guān)單位鑒定 檢驗(yàn)真菌常用的生化反應(yīng)有糖 醇 類發(fā)酵試驗(yàn) 同化碳源試驗(yàn) 同化氮源試驗(yàn)或利用硝酸鉀試 驗(yàn) 牛乳分解試驗(yàn) 酚氧化酶試驗(yàn) 明膠液化 試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)等 試驗(yàn)方法同細(xì)菌試驗(yàn) 主 要用于檢驗(yàn)深部感染真菌如假絲酵母菌 隱球 菌等 57 1 多烯類 如兩性霉素B 制霉菌素 2 咪唑類 包括咪康唑 酮康唑 3 三唑類 伊曲康唑 氟康唑 伏立康唑 4 嘧啶類 氟胞嘧啶 5 棘白菌素類 卡泊芬凈 抗真菌藥物分類抗真菌藥物分類 化學(xué)結(jié)構(gòu)分類化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 58 1 作用于真菌細(xì)胞膜 破壞細(xì)胞膜 兩性霉素B 制霉菌素 抑制麥角固醇合成 唑類 丙烯胺類 2 作用于真菌細(xì)胞壁 尼可霉素Z 卡泊芬凈等 3 作用于真菌核酸 干擾真菌DNA合成 5 氟尿嘧 啶 5 FC 等 4 其他 大蒜新素 allitridum 及冰醋酸等 抗真菌藥物分類抗真菌藥物分類 作用機(jī)理分類作用機(jī)理分類 59 抗真菌藥體外抗菌譜比較 真菌真菌 AMB FCZ ITZ VCZ PCZ RCZ CF MF AF 白色念珠菌 熱帶念珠菌 近平滑念珠菌 克柔念珠菌 光滑念珠菌 新生隱球菌 莢膜組織胞漿菌 皮炎芽生菌 粗球孢子菌 巴西副球孢子菌 卡氏肺孢子蟲 煙曲霉菌 毛霉菌 根霉菌 鐮刀菌 吡咯類吡咯類 棘白菌素類棘白菌素類 多烯多烯 60 1 兩性霉素B 兩性霉素對大多數(shù)深部致病真菌具有活性 如念珠菌 新型隱球菌 曲菌 組織胞漿菌 雙 相真菌等均有較強(qiáng)的抑制作用 但對皮膚和毛發(fā) 癬菌大多耐藥 2 酮康唑 ketoconazole 對念珠菌 著色真菌 屬 球孢子菌屬等有 抗菌活性 對毛發(fā)癬菌亦具抗菌活性 臨床常用抗真菌藥物 61 3 氟康唑 fluconazole 對念珠菌 隱球菌 具有較高抗菌性 4 氟胞嘧啶 為窄譜抗生素 對念珠菌 新型隱球菌和球擬酵母有較高抗菌活性 對其他真菌抗菌作用差 易產(chǎn)生耐藥性 故常和兩性霉素B聯(lián)合使用 臨床常用抗真菌藥物 62 5 伊曲康唑 itraconazole 伊曲康唑體外有廣譜抗真菌活性 對念 珠菌 隱球菌 曲霉菌 組織胞漿菌 馬內(nèi)非青霉均有效 6 伏立康唑 Voriconazole 伏立康唑適用于侵襲性曲霉病及嚴(yán)重真 菌感染不能耐受其他藥物或經(jīng)其他藥物 治療無效者 如足放線病菌屬 鐮刀菌 屬等感染 臨床常用抗真菌藥物 63 抗真菌藥物藥敏試驗(yàn)原則抗真菌藥物藥敏試驗(yàn)原則 1 提供兩種以上有相當(dāng)活性的抗真菌藥物的 可信測量方法 2 和體內(nèi)的活性具有相關(guān)性 可預(yù)測治療的 效果 3 可用來監(jiān)控敏感群體菌株的耐藥性發(fā)生 4 可預(yù)期研究新藥的潛在治療效能 64 真菌藥物敏感試驗(yàn)過程真菌藥物敏感試驗(yàn)過程 方法 肉湯稀釋法 包括常量稀釋法和微量稀 釋法 CLSI M27 M38 培養(yǎng)基 含谷氨酰胺和pH指示劑 不含碳酸 氫鈉RPMI 1640培養(yǎng)基 程序 藥物原液配制 接種菌液制備 藥液 稀釋 常量稀法 微量稀釋法 結(jié)果判斷 質(zhì)量控制 65 真菌非培養(yǎng)檢測技術(shù)真菌非培養(yǎng)檢測技術(shù) 動物試驗(yàn) 分離病原性真菌 確定真菌菌種 的致病性 研究藥物對真菌的作用等 核酸檢測 操作簡便 省時省工 敏感性和 特異性高的優(yōu)點(diǎn) 但要一定的實(shí)驗(yàn)條件 并大多仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段 故目前不可 能完全替代常規(guī)鑒定方法 真菌毒素的檢測 生物學(xué)方法 薄層層析法 高效液相色譜法和間接競爭ELISA法等 66 培養(yǎng) 鑒定用的培養(yǎng)基 沙氏葡萄糖培養(yǎng)基 SDA 主要用于菌 種的分離 儲存 葡萄糖 40g 蛋白胨 10g 瓊脂 12 15g 蒸餾水 1000ml 氯霉素 200mg 放線菌酮 250mg 121度10min高壓滅菌 67 培養(yǎng) 鑒定用的培養(yǎng)基 皮膚癬菌試驗(yàn)培養(yǎng)基 DTM 主要用于皮膚癬菌的篩選 80 的皮膚癬菌 能使DTM由酸變堿 培養(yǎng)基1周內(nèi)由黃色變 成紅色 菌落有深紅色色素產(chǎn)生判斷為陽性 表示為 紅色毛癬菌 玉米粉吐溫培養(yǎng)基 CMA 可以促進(jìn)白念產(chǎn)生假菌絲和厚壁孢子 促進(jìn)暗色孢科真菌孢子形成 尿素瓊脂 用于鑒別紅色毛癬菌和須癬毛癬菌 68 培養(yǎng) 鑒定用的培養(yǎng)基 米飯培養(yǎng)基 用于鑒別犬小孢子菌和奧杜昂小孢子菌 并促進(jìn)其他一些皮膚癬菌產(chǎn)生孢子 奧杜昂小孢子菌在米飯培養(yǎng)基生長不良 產(chǎn) 生棕色色素 犬小孢子菌生長快而茂盛 有較多典型的梭 形大分生孢子 并產(chǎn)生淡黃色色素 維生素試驗(yàn)瓊脂 又稱毛癬菌培養(yǎng)基 用于發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌的不同維生素需要 疣狀毛癬菌 需要維生素B1和肌醇 斷發(fā) 紫色和同心性毛癬菌需要維生素B1 69 培養(yǎng) 鑒定用的培養(yǎng)基 溴甲酚紫乳固體葡萄糖瓊脂 BCP MSG I類反應(yīng) 第一階段 14天 培養(yǎng)基顏色不變 菌落生長受限 第二階段 14天后 培養(yǎng)基顏色改變 由灰藍(lán)色變成紫 藍(lán)色 同時菌落生長加快 紅色 毛癬菌 II類反應(yīng) 培養(yǎng)基PH值快速升高 由藍(lán)色變成紫色 7 10天即有明 顯的堿化 變