溶菌酶的提取純化及純度測(cè)定.docx

溶菌酶的提取純化以及純度鑒定實(shí)驗(yàn)者：鐘吳宇豪 綠藥1501班 201530360127 同組者：連學(xué)帆 韓家鑫 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：東配302 實(shí)驗(yàn)日期：2017年5月26日-5月27日 報(bào)告完成日期：2017年5月28日 指導(dǎo)老師：易 喻【摘要】溶菌酶是一種具有水解細(xì)菌細(xì)胞壁能力的蛋白質(zhì)，工業(yè)上通常以蛋清為原料，在pH6.5條件下用弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂732吸附后，再用硫酸銨洗脫，經(jīng)透析后冷凍干燥得到，在醫(yī)學(xué)及食品商具有廣泛應(yīng)用。本文中我們通過(guò)等電點(diǎn)沉淀法對(duì)溶菌酶進(jìn)行粗提取，然后通過(guò)離子交換層析進(jìn)一步除去雜蛋白，提純所得的溶菌酶粗品，并且通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)溶液吸光度來(lái)對(duì)最后的產(chǎn)品進(jìn)行純度及產(chǎn)率鑒定，確認(rèn)得到了純化倍數(shù)較高但產(chǎn)率較低的溶菌酶產(chǎn)品。Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.【關(guān)鍵詞】溶菌酶，等電點(diǎn)沉淀法，離子交換層析，酶活，提純【引 言】對(duì)溶菌酶的研究始于20 世紀(jì)初,人們發(fā)現(xiàn)人的唾液、眼淚中存在有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名為溶菌酶。1937年Abraham和Robinson從卵蛋白中分離出溶菌酶晶體,揭開(kāi)了研究溶菌酶的歷史篇章。它廣泛存在于鳥(niǎo)類、家禽的蛋清中和哺乳動(dòng)物的淚液、唾液、血漿、乳汁、胎盤(pán)以及體液、組織細(xì)胞內(nèi),其中在蛋清中含量最豐富(約0.13% )在一些植物體如卷心菜、蘿卜、無(wú)花果和微生物體內(nèi)也存在溶菌酶,只是含量差異較大。溶菌酶(1ysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶、 N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。它能水解細(xì)菌細(xì)胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡葡糖之間的-1,4糖苷鍵,破壞肽聚糖支架,低滲溶液中細(xì)胞在內(nèi)部滲透壓的作用下脹裂開(kāi),引起細(xì)菌裂解。溶菌酶主要溶解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁。溶菌酶是一種無(wú)毒、無(wú)副作用的蛋白質(zhì),又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐劑。目前已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐,溶菌酶屬于冷殺菌,在殺菌防腐過(guò)程中不需加熱,因而避免了高溫殺菌對(duì)食品風(fēng)味的破壞作用,尤其對(duì)熱敏感的物質(zhì)更具有重要意義。還可以添加到乳粉中,使牛乳人乳化,以抑制腸道中腐敗微生物的生存,同時(shí)直接或間接地促進(jìn)腸道中雙歧桿菌的增殖。此外,還能利用溶菌酶生產(chǎn)酵母浸膏和核酸類調(diào)味品。在生物工程研究上，隨著生物科學(xué)的發(fā)展,溶菌酶已成為基因工程及酶工程中必不可少的工具酶。在醫(yī)療中，溶菌酶對(duì)G+ 、枯草桿菌等有很好的殺滅作用,對(duì)大腸桿菌、普通變球菌等G- 也具有一定程度溶解。此外,溶菌酶與抗菌素合用效果更佳,因而,溶菌酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè),如利用溶菌酶治療各種五官科炎癥,尤其對(duì)急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明顯。溶菌酶在畜禽飼料中，由于溶菌酶本身是一種天然蛋白質(zhì),無(wú)毒性,是一種安全性高的飼料酶,它能專一性的作用于目的微生物的細(xì)胞壁,而不能作用于其它物質(zhì)。該酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、枯草桿菌、耐輻射微球菌有很強(qiáng)分解作用。為了從雞蛋清中提取并提純得到的溶菌酶，我們分別采用了等電點(diǎn)沉淀法得到了溶菌酶粗品，然后通過(guò)離子交換層析提純得到的樣品，最后測(cè)定了所制的溶菌酶活性及蛋白質(zhì)含量。【實(shí)驗(yàn)部分】1.1 試劑與儀器1.1.1 試劑250mL燒杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速濾紙、50mL量筒、50mL離心管、雞蛋1只、0.02mo1/LPBS(pH7.0、 pH8.0、), lmLEp管, pH計(jì),移液管1m1、冰醋酸、5mo1/L NaOH,滴管,離心管，樣品 S1、 S2、 S-2, CM一纖維素高子交換介質(zhì)., 0.02mo1/LpH8.0的 PBS, 0.6mo1/LNaC1, 燒杯(50mL, 250mL)、桔草芽胞桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物(37,18h,160r/min,100/250mL)、 0.02mo1/L pH8.0的 PBS(測(cè)活緩沖液,含50mmo1/LNaC1), 0.2mo1/LpH8.0的 PBS。1.1.2 儀器 分光光度計(jì)、揺床、高速離心機(jī)，分部收集器,核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀,記錄儀,高速離心機(jī)(可用50mL離心管),冰箱, 可見(jiàn)光分光光度計(jì)、揺床、燒杯、玻璃棒、漏斗、濾紙等。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶是一種葡萄糖苷酶,其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定, 干燥條件下在室溫可長(zhǎng)期保存而活性不喪失。在自然界中廣泛存在,其中以禽類蛋清中含量較高,雞蛋中占蛋白總量的3.5%,所以我們選擇使用雞蛋清來(lái)提取溶菌酶。雞蛋清中溶菌酶由18種129個(gè)気基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質(zhì), 分子中含有4個(gè)二硫鍵, 等電點(diǎn)為10.8,對(duì)溫度和酸不敏感,在弱堿性條件下穩(wěn)定。雞蛋清中含13%15%的蛋自質(zhì),除溶菌酶以外,還有其他的的蛋白質(zhì), 其主要特點(diǎn)分別如下:由此可見(jiàn)，其中大部分的雜蛋白與溶菌酶的等電點(diǎn)都具有很大的不同，所以我們使用等電點(diǎn)沉淀法來(lái)對(duì)溶菌酶進(jìn)行粗提取。等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低而各種蛋白質(zhì)又具有不同等電點(diǎn)的特點(diǎn)進(jìn)行分離的方法。在等電點(diǎn)時(shí), 蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在, 其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等), 此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒(méi)有相同電荷的相互排斥, 分子相互之間的作用力減弱, 其顆粒極易碰撞、 凝聚而產(chǎn)生沉淀, 所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí), 其溶解度最小, 最易形成沉淀物。等電點(diǎn)時(shí)的許多物理性質(zhì)如黏度、 膨脹性、 滲透壓等都變小, 從而有利于懸浮液的過(guò)濾。為了提純得到的溶菌酶粗品，我們選擇了離子交換層析，離子交換層析 (簡(jiǎn)稱為 IEc)是依據(jù)各種離子或離子化合物與高子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。目前廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。離子交換劑是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過(guò)一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的, 可以分為三部分: 高分子聚合物基質(zhì)、 電荷基團(tuán)和平衡離子。 電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合, 形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行高子交換的基團(tuán) 。 平衡高子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子, 它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng) 。 平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用, 稱為陽(yáng)離子交換劑; 平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用,稱為陰離子交換劑。離子交換過(guò)程如下反應(yīng)方程: 其中 R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì), X-和 M+分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰高子交換劑中與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán), Y+ 和 N- 分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子, A+和 B-分別代表溶液中的離子基團(tuán)。從上面的反應(yīng)式中可以看出,如果A離子與離子交換劑的結(jié)合力強(qiáng)于 Y離子,或者提高 A離子的濃度, 或者通過(guò)改變其它一些條件,可以使A離子將 Y離子從離子交換劑上置換出來(lái)。也就是說(shuō),在一定條件下,溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來(lái),并通過(guò)電荷基團(tuán)結(jié)合到固定相上,而平衡離子則進(jìn)入流動(dòng)相,這就是離子交換層析的基本置換反應(yīng)。通過(guò)在不同條件下的多次置換反應(yīng), 就可以對(duì)溶液中不同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。比如說(shuō)，陽(yáng)離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電, 裝柱平衡后, 與緩沖溶液中的帶正電的平衡離子結(jié)合。待分離溶液中可能有正電基團(tuán)、負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)。加樣后,正電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng),而結(jié)合到離子交換劑上。而負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交換劑結(jié)合,隨流動(dòng)相流出而被去除。通過(guò)選擇合適的洗脫方式和洗脫液,如增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫。 隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加, 洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種正電基團(tuán)進(jìn)行交換, 而將各種正電基團(tuán)置換出來(lái), 隨洗脫液流出。與離子交換劑結(jié)合力小的正電基團(tuán)先被置換出來(lái), 而與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的需要較高的離子強(qiáng)度才能被置換出來(lái),這樣各種正電基團(tuán)就會(huì)按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來(lái),從面達(dá)到分離目的。在本試驗(yàn)中我們通過(guò)離子交換劑將雜質(zhì)蛋白洗脫出來(lái)從而提純所得的溶菌酶樣品。并且通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法來(lái)鑒別蛋白質(zhì)的含量，考馬斯亮藍(lán) G_250比色法是常用的一種蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。 1976年由 Bradford建立,用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。考馬斯亮藍(lán) G-250是一種染料,在酸性溶液中為棕紅色,最大光吸收波長(zhǎng)為465nm。 它能與蛋白質(zhì)通過(guò)疏水作用結(jié)合, 形成蛋白質(zhì)一染料的復(fù)合物, 顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色, 在595nm波長(zhǎng)下有最大吸收值,并且在低濃度范圍內(nèi)(0.01-1.0mg/m1),與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系服從比爾定律 。該法操作簡(jiǎn)単,反應(yīng)迅速, 2min左右即達(dá)到平衡,而且靈敏度很高,可測(cè)微克級(jí)的蛋白質(zhì)含量,所生成的染料一蛋白質(zhì)顏色穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,抗干擾性也強(qiáng),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 。被測(cè)蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成差異較大時(shí), 有一定誤差, 因?yàn)榕c染料結(jié)合量不同。之后通過(guò)測(cè)定枯草芽孢桿菌的吸光度降低來(lái)得到樣品的酶活，對(duì)所得樣品的純度和收率進(jìn)行了客觀的分析。1.2.2 數(shù)據(jù)處理注意事項(xiàng)根據(jù)酶的動(dòng)力學(xué)特性可知, 在特定的時(shí)間段,酶促反應(yīng)的速度是相等的, 即產(chǎn)物濃度隨時(shí)間成線性變化。根據(jù)此特性,將所得數(shù)據(jù)在坐標(biāo)紙上作圖,以時(shí)間為橫軸, 0D（595）值為縱軸,將數(shù)據(jù)定位后,根據(jù)擬合直線的斜率,即為單位時(shí)間內(nèi) 0D值的下降值,然后再除以0.001,即可得到所取測(cè)量酶液的活力單位。除以酶液體積,即可得到酶濃度(u/mL)。溶菌酶活力單位(u)=0D/0.001其中0D為一分鐘內(nèi) 0D值的下降值。1.3 操作步驟1.3.1 溶菌酶的粗提取拿一只雞蛋破殼取蛋清置于250mL燒杯中,記錄其體積V1 (實(shí)驗(yàn)中取15ml)，加入1.0倍體積的 pH7.0PBS緩沖液,攪拌均勻,取1.0mL蛋清于1mLEp管,制備2管,4備用(樣品S1) 用冰酷酸調(diào) pH4.7左右, 充分?jǐn)嚢?4000rpm,離心10min 棄沉淀, 轉(zhuǎn)移上清至燒杯中 加入1.0倍體積的 0.02M, pH8.0PBS緩沖液,攪拌均勻,并用5mo1/LNaOH調(diào) pH8.0 濾紙過(guò)濾,取清液,測(cè)量并記錄體積 v2 取1.0mL清液于1mLEp管,制備2管, 4備用(樣品S2) 余下的清液放在100mL燒杯中4保存?zhèn)溆? (樣品s2)1.3.2 溶菌酶的分離純化1、裝柱取20mL CM-纖維素離子交換介質(zhì), 1.0x40cm層析柱, 以 0.02M PBS,pH8.0為緩沖液裝柱。 注意不能使介質(zhì)露出水面, 因?yàn)榻橘|(zhì)露于空氣中, 當(dāng)加入溶液時(shí), 介質(zhì)間隙中會(huì)產(chǎn)生氣泡,而使交換不完全。對(duì)子重復(fù)使用的填料,需要先沖3倍柱床體積蒸餾水,將保存用的乙醇洗脫出來(lái)。2、平衡用泵將3倍于柱床體積的 0.02M PBS pH8.0過(guò)柱。這一步的作用是使得柱床體系的內(nèi)外達(dá)到平衡與均一, 以利后續(xù)目的蛋白的結(jié)合。3、上樣用泵將 S-2樣品泵入層析柱,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后,蛋白將通過(guò)離子交換的方式, 與介質(zhì)相互作用而掛柱。注意觀察并記錄280nm下吸收值的變化。4、淋洗用34cv 0.02mo1/LpH8.0的 PBS洗滌離子交換柱至無(wú)穿透峰為止,收集穿透峰 S3, 流速約1.5mL/min。取約1mL于 Ep管4C保存?zhèn)溆?。5、洗脫分別用34cv含 0.2mo1/LNaC1的 PBS(0.02mo1/L、 pH8.0)緩沖液和34cv含 0.6mo1/L NaC1的PBS (0.02mo1/LpH8.0)進(jìn)行階段稅度洗脫。收集洗脫峰 S4,記錄洗脫時(shí)間和洗脫峰體積V4。取1.0mL清液于1mLEp管中,制備2管, 4備用(留樣S4)。（洗脫時(shí)得到兩個(gè)峰，所以最后還得到了S5）6、再生用泵將2倍柱體積的2mo1/LNaC1過(guò)柱, 然后水洗4倍柱體積。洗脫完成后, 需要進(jìn)行高子交換填料的再生處理。離子交換基團(tuán)為一些鹽所覆蓋,影響下次的重復(fù)使用。因此,先用高濃度的鹽將與介質(zhì)結(jié)合緊密的雜質(zhì)洗脫下來(lái), 然后再恢復(fù)其離子交換功能。 對(duì)于 CM-纖維素而言, 只需要用水過(guò)柱即可以使其離子交換功能得到恢復(fù) 。7、保存用泵將2倍柱體積的20%乙醇過(guò)柱 。介質(zhì)回收用于蛋白質(zhì)分離純化的介質(zhì)多保存于液體中。保存時(shí)需加入一些抑菌劑,如疊氮化鈉等。對(duì)于本介質(zhì),只需采用20%乙醇保存即可。對(duì)于洗脫下來(lái)的樣品,我們無(wú)法確證是否含有溶菌酶。因此需要進(jìn)行監(jiān)測(cè)。一般采取活性監(jiān)測(cè)的方式。本實(shí)驗(yàn)中利用溶菌酶水解枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁,使得枯草芽孢桿菌裂解,以595 nm下光吸收值的變化來(lái)確定溶菌酶所在的吸收峰 。1.3.3 溶菌酶活性測(cè)定取6mL 枯草芽孢桿菌的過(guò)夜培養(yǎng)物, 3500rpm常溫離心5分鐘,棄上清,沉淀用6mL 0.02mo1/L PBS緩沖液懸浮,利用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其 0D5g5并記錄(吸光度在 0.51.0 范圍,如果讀數(shù)過(guò)高可適當(dāng)稀釋)。比色皿編號(hào)見(jiàn)下表,其中1只加入PBS作為儀器調(diào)零空白, 2作為對(duì)照, 3、4用于平行測(cè)定然后取平均值), 30s測(cè)定一次吸光度值,約3min內(nèi)至吸光度達(dá)到穩(wěn)定 。比色皿1234PBS緩沖液/mL3/細(xì)胞 PBS懸液/mL/32.92.9分別用酶液 S1 S4/mL/0.10.1 在室溫,以1號(hào)管為對(duì)照,每隔30s分別測(cè)定2、3、4在595nm的吸光度。時(shí)間(s)03060901201501802號(hào)3號(hào)4號(hào)1.3.4 溶菌酶蛋白質(zhì)含量測(cè)定1.3.4.1 利用考馬斯亮藍(lán)制備蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 在6支試管中,分別精確吸取牛血清蛋白原液 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 m1,用蒸餾水全部稀釋至1.0m1,然后分別加入5.00m1考馬斯亮藍(lán)溶液,混合均勻,于(25士1 )的恒溫水浴中保溫10min,冷水浴中冷卻后,立即于595nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定。以1.00m1 蒸餾水代替樣品液,加入5.00m1考馬斯亮藍(lán)溶液,其余操作同上,做空白對(duì)照。以試管中標(biāo)準(zhǔn)蛋白的總量(ug)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)群曲線圖,并作線性回歸, 求線性方程。1.3.4.2 未知樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定將S1，S2,S3，S4，S5作適當(dāng)稀釋(使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)),取1.00m1稀釋液于試管中, 按上述相同方法加入考馬斯亮藍(lán)溶液并比色測(cè)定。根據(jù)所測(cè)定的OD值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程,計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/m1)?！窘Y(jié)果與討論】1. 離子交換層析譜圖 圖1.離子交換層析圖譜第一個(gè)峰為S3.第二個(gè)峰為S4，第三個(gè)峰為S5.（由于出現(xiàn)了斷電的意外情況，譜圖受到了些許影響，萬(wàn)幸時(shí)間較短，沒(méi)有對(duì)譜圖走向形成大的影響）2. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 表1.蛋白質(zhì)含量與吸光度關(guān)系表 蛋白質(zhì)含量/g20406080100吸光度0.1380.2400.3360.4260.526 圖2.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線3. 未知樣品蛋白質(zhì)測(cè)定 表2.未知樣品吸光度與蛋白質(zhì)含量記錄表樣品名稀釋倍數(shù)吸光度蛋白質(zhì)含量 /g/mLS12000.84633391.7S22000.38414141.7S3200.7582972.5S410.52399.6S520.461173.54. 通過(guò)酶促反應(yīng)的速度得到酶液活力單位及酶濃度 表3. S1溶菌酶活性測(cè)定表時(shí)間/s3060901201501802號(hào)6306276266256266253號(hào)6266276266246216194號(hào)630624614602593585 表4. S2溶菌酶活性測(cè)定表時(shí)間/s3060901201501802號(hào)5475465475485485493號(hào)5885705565425335224號(hào)566553538525515504 表5. S3溶菌酶活性測(cè)定表時(shí)間/s3060901201501802號(hào)0.6260.6270.6260.6260.6260.6263號(hào)0.6040.6030.6040.6040.6040.6044號(hào)0.6000.5590.6000.6000.6010.600 表6. S4溶菌酶活性測(cè)定表時(shí)間/s3060901201501802號(hào)0.6140.6150.6140.6140.6140.6153號(hào)0.6010.6020.6020.6020.6020.6024號(hào)0.6190.6180.6180.6180.6180.618 表7. S5溶菌酶活性測(cè)定表時(shí)間/s3060901201501802號(hào)0.6120.6110.6100.6110.6100.6113號(hào)0.5950.5830.5730.5630.5530.5444號(hào)0.5840.5730.5630.5510.5400.529顯而易見(jiàn)，S3,S4沒(méi)有酶活性，因此不做下一部分處理。 圖3.S1樣品的酶活性曲線 圖4.S2樣品的酶活性曲線 圖5.S5樣品的酶活性曲線統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可得到表： 表8.樣品與參數(shù)分析表樣品及參數(shù)體積/ml蛋白含量/mg/ml酶活/U/ml比活/u/mg雞蛋蛋清V1=25mL33391.710.9980.0033S11mL沉淀上清V2=14141.725.4880.0180S21mL淋洗液V3=2972.500S31mL洗脫液V4=S4ml99.600S5ml173.521.1471.2188純化倍數(shù)369.3純化收率隨著實(shí)驗(yàn)過(guò)程的進(jìn)行，蛋白質(zhì)含量不斷降低，酶活性則是在提高，