（蔬菜學專業(yè)論文）番茄APX、AOBP、AO等Vc代謝相關基因的功能初步鑒定與分析.pdf

華中農(nóng)業(yè)大學2 0 0 6 屆碩上學位論文 中文摘要 抗壞血酸即維生素c ，是植物和大多數(shù)動物體內合成的一類含量豐富的己糖內 酯化合物。它在生物體中具有重要的代謝功能和抗氧化作用，是保證人類健康所必 需的營養(yǎng)物質；同時還與植物細胞的分裂、伸長和植株生長有關。少數(shù)動物f 包括人 類) 自身已經(jīng)喪失了合成能力，必須從食物中攝取，而植物是提供抗壞血酸的主要來 源?？箟难峒捌浯x相關酶類在清除活性氧方面的作用使得抗壞血酸在植物抵抗 環(huán)境脅迫中也起著重要作用。r n a i 技術作為基因功能研究的一種非常有效手段得 到了廣泛的應用。通過r n a i 技術調控植物抗壞血酸生物代謝相關酶基因的表達， 改變某些代謝酶類的活性，獲得具有應用潛力的高含量抗壞血酸的番茄材料，從而 增加植物產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，增強植物對逆境的抗性是可行的。 番茄是一種世界上廣為栽培的高營養(yǎng)、高價值的蔬菜作物，然而，目前番茄抗 壞血酸生物代謝途徑中大部分基因的功能都不太明確，對其進行轉基因調控的報道 幾乎沒有。因此，本研究以番茄這一重要的蔬菜作物為材料，鑒定抗壞血酸生物代 謝相關酶基因，即抗壞血酸氧化酶啟動子結合蛋白、抗壞血酸氧化酶和2 個抗壞血 酸過氧化酶基因，將其構建到植物r n a i 研究載體p h g r v 中，通過農(nóng)桿菌介導法 獲得轉基因植株，分析轉基因番茄的植株生長、生理生化及抗氧化逆境等特性，以 期獲得具有應用價值的抗壞血酸含量增加的番茄材料。獲得的主要結果如下： 1 - 分別構建了抗壞血酸氧化酶a o ( a s c o r b a t eo x i d a s e ，a y 9 7 1 8 7 6 ) 和抗壞血酸過氧 化物酶t 4 p x ( a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ，a f 4 1 3 5 7 3 ) 這兩個基因的r n a i 植物研究載 體；利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法將它們成功導入番茄品種z s 5 # 中。 2 獲得卡那霉素抗性轉化植株1 1 棵，p c r 檢測和s o u t h e r nb l o t 結果表明，外源基 因已整合到番茄基因組中，其拷貝數(shù)1 5 個不等。 3 測定了抗壞血酸氧化酶a o ( a s c o r b a t eo x i d a s e ，a y 9 7 1 8 7 6 ) 和抗壞血酸過氧化物 酶t a p x ( a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ，a f 4 1 3 5 7 3 ) t 1 代r n a i 植株抗壞血酸含量以及抗 壞血酸氧化酶、抗壞血酸過氧化酶的活性，發(fā)現(xiàn)t 1 代轉基因植株果實抗壞血酸 含量大部分得到提高，最高分別增加了0 5 9 倍、1 1 6 倍；相應的抗壞血酸氧化 酶，抗壞血酸過氧化酶的活性大部分降低，最低分別減少了5 3 5 9 、5 5 2 3 。 且各轉基因株系間存在一定差異。 4 測定了抗壞血酸氧化酶啟動子結合蛋白a o b p ( a s c o r b a t eo x i d a s e p r o m o t e r - b i n d i n gp r o t e i n ，t c l 5 5 6 0 2 ) 和抗壞血酸過氧化物酶c a p x ( a s c o r b a t e p e r o x i d a s e ，t c l 5 4 6 7 5 ) t 2 代r n a i 植株抗壞血酸含量以及抗壞血酸氧化酶、抗壞 血酸過氧化酶的活性，發(fā)現(xiàn)t 2 代轉基因植株果實抗壞血酸含量大部分得到提 高，最高分別增加了2 2 1 倍、1 4 倍；相應的抗壞血酸氧化酶，抗壞血酸過氧化 酶的活性大部分有所降低，最低分別減少了7 4 3 9 、9 2 5 5 。且各株系間存在 一定差異。 番茄v c 代謝相關的a p x 、a o b p 、a o 基因功能初步鑒定與分析 5 利用r t - p c r 技術測定不同單株葉片表達量，結果各基因的表達量與酶活一致； 利用番茄表達數(shù)據(jù)庫( t o m a t oe x p r e s s i o nd a t a b a s e ，t e d ) 分析了番茄抗壞血酸 生物代謝相關基因的數(shù)字表達譜，初步證明有3 個基因在果實中高效表達。而 t a p x 基因沒有在果實中發(fā)現(xiàn)表達。 6 對4 個轉基因植株后代的抗氧化逆境特性進行了初步觀察，結果表明a o b p 基 因和2 個a p x 基因的r n a i 的轉基因植株后代的抗旱性、耐鹽性和對除草劑( 百 草枯) 的抗性有一定程度的降低，但a o 基因的r n a i 轉基因植株后代抗性卻上 升。 關鍵詞：番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ；抗壞血酸；r n a 干涉；基因表達； 遺傳轉化；基因調控 l l a b s t r a c t l - a s c o r b i ca c i d ( a s a ) ，a l s on a m e dv i t a m i nc ，ah e x o s el a c t o n e ，p l a y sa l le x t e n s i v e r o l ei np l a n ta n dm o s ta n i m a l s i th a sam u l t i t u d eo ff u n c t i o n si no r g a n i s m s ，a n di s a l l e s s e n t i a lc o m p o n e n to fh u m a nn u t r i t i o n ；m o r e o v e r , i si n v o l v e di nt h ep r o c e s so fc e l l d i v i s i o n ，c e l le x p a n s i o na n dp l a n tg r o w t h b u ts o m ea n i m a l si n c l u d i n gh u m a n sl a c kt h e a b i l i t vt os y n t h e s i z ea s aa sar e s u l to fam u t a t i o ni nt h el a s te n z y m er e q u i r e df o ra s a b i o s y n t h e s i s a at h e r e f o r e ，m u s tb ea c q u i r e dr e g u l a r l yf r o md i e t a r ys o u r c e s ，p r i m a r i l y f r o mp l a n t sr i c hi na s a a s aa l s op l a y sa ni m p o r t a n tr o l ea sa na n t i o x i d a n ta n dp r o t e c t s t h ep l a n td u r i n go x i d a t i v ed a m a g eb ys c a v e n g i n gf r e er a d i c a l s a n dr e a c t i v eo x y g e n s p e c i e st h a t a r eg e n e r a t e dd u r i n gp h o t o s y n t h e s i s ，o x i d a t i v em e t a b o l i s ma n dv a r i o u s s t r e s s e s t h et e c h n i q u eo fr n a ih a sa l r e a d yb e e ne x t e n s i v e l ya p p l i e di ng e n ef u n c t i o n r e s e a r c h t h i ss t u d yi n t e n d st oi d e n t i f yt h ef u n c t i o no fg e n e sa s s o c i a t e dw i t h 舡a m e t a b o l i s mp r e l i m i n a r i l y b yr e g u l a t i n g t h ee x p r e s s i o no fg e n e si n v o l v e di np l a n t m e t a b o l i s mu s i n gt h er n a it e c h n i q u ea n de x p e c t st oo b t a i nt o m a t om a t e r i a l sw i t hh i g h c o n t e n to fv i t a m i nca n dt h er e s i s t a n c et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s t o m a t oi saw o r l d w i d ev e g e t a b l ew i t hh i g hn u t r i t i v ev a l u e s h o w e v e r ，m o s tg e n e s i n v o l v e di nt o m a t oa s c o r b i ca c i dm e t a b o l i s mh a v en o tb e e nc l o n e da n dt h e r ea r en e a r l y n or e p o r t sa b o u tt h eg e n er e g u l a t i o n t h e r e f o r e ，t h i ss t u d ya i m st or e g u l a t et h ee x p r e s s i o n o fg e n e si n v o l v e di nt o m a t o 舡am e t a b o l i s mi n c l u d i n ga s c o r b a t eo x i d a s e ( a d ) 、a s c o r b a t e o x i d a s ep r o m o t e r - b i n d i n gp r o t e i n 似o b p ) a n dt w oa s c o r b a t ep e r o x i d a s e s t h e n ， t h e yw e r ei n s e r t e di n t or n a iv e c t o r sf o rp h g r v a n dt r a n s g e n i cp l a n t sw e r eo b t a i n e dv i a a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o nm e t h o d w ea n a l y z e dp l a n tg r o w t h 、 t h e p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h er e s i s t a n c e ，a n de x p e c t st oo b t a i n t o m a t om a t e r i a l sw i t hh i g hc o n t e n to fa s ab yt r a n s g e n i ct e c h n i q u e s t h em a i nr e s u l t s w e r ea sf c i l l o w s ： 1 r n a ip l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e dw i t hc d n af r a g m e n t sb yr t - p c r a n dt r a n s g e n i ct o m a t op l a n t sw e r eo b t a i n e df r o mg e n o t y p eo fz s 5 # u s i n gt h e a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d 2 at o t a lo f1 1p u t a t i v et r a n s g e n i ct o m a t op l a n t sw e r eo b t a i n e d t h ep c r a n ds o u t h e r n b l o ta n a l y s i so ft h ep u t a t i v et r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e dt h a tt h et - d n a w a si n t e g r a t e d i n t ot h et o m a t og e n o m e ，w i t hv a r i o u sc o p yn u m b e r s 3 m e a s u r e m e n t so ft h ec o n t e n to fa s p bt h ea c t i v i t i e so fa o ( a y 9 7 1 8 7 6 ) a n dt a p x ( a f 4 1 3 5 7 3 ) o ft 1t r a n s g e n i cp l a n t sw e r ep e r f o r m e da n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ef m i ta s ac o n t e n t so fm o s tr n a it r a n s g e n i cl i n e sw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o la n d t h eh i g h e s tt r a n s g e n i cl i n ei n c r e a s e d0 5 9 f o l d 、1 1 6 一f o l dr e s p e c t i v e l y t h ea c t i v i t i e so f m o s tr n a it r a n s g e n i cp l a n t sw e r el o w e rt h a nt h ec o n t r o la n dt h el o w e s tt r a n s g e n i c l i n ed e c r e a s e du pt o5 3 5 9 、5 5 2 3 r e s p e c t i v e l y a n dt h e r ew e r es i g n i f i c a n t i i i v a r i a t i o n sa m o n g t r a n s g e n i cp l a n t s 4 m e a s u r e m e n t so ft h ec o n t e n to fa s a , t h ea c t i v i t i e so f a o b p ( t c l 5 5 6 0 2 ) 鋤d c a p ) ( ( t c l 5 4 6 7 5 ) o ft 2 t r a n s g e n i cp l a n t sw e r ep e r f o r m e da n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ef r u i ta s ac o n t e n t so fm o s tr n a it r a n s g e n i cl i n e sw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o la n d t h eh i 【g h e s tt r a n s g e n i cl i n ei n c r e a s e d2 2 1 - f o l d 、1 4 f o l dr e s p e c t i v e l y t h ea c t i v i t i e so f m o s tr n a it r a n s g e n i cp l a n t sw e r el o w e rt h a nt h ec o n t r o la n dt h el o w e s tt r a n s g e n i c l i n ed e c r e a s e du pt o 7 4 3 9 、9 2 5 5 r e s p e c t i v e l y a n dt h e r ew e r es i g n i f i c a n t v a r i a t i o n sa m o n g t r a n s g e n i cp l a n t s 5 r t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ea c t i v i t i e so fd i f f e r e n t t r a n s g e n i cp l a n t sw e r e c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e di nl e a v e sa n df r u i t so ft o m a t o ，w h e r e a st h ee x p r e s s i o nl e v e l s w e r ed i f f e r e n t t h ed i g i t a le x p r e s s i o np r o f i l e so ft h eg e n e si n v o l v e di na s c o r b i ca c i d m e t a b o l i s mw e r ea n a l y z e du s i n gt o m a t oe x p r e s s i o nd a t a b a s e ( t e d ) m o s to ft h et a r g e t g e n ei nf r u i te x p r e s s e dg r e a t e rt h a nt h ec o n t r o li nl e a v e s ，b u tt 4 p xi sn o t h i n gi nf r u i t 6 t h er e s i s t a n c e st oo x i d a t i v es t r e s s e so ff o u rg e n e st r a n s g e n i cp l a n t sw e r ei n v e s t i g a t e d p r e l i m i n a r i l ya n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea o r n a it r a n s g e n i cp l a n t si n c r e a s e d d r o u g h tf a s t n e s s 、s a l tt o l e r a n c ea n dr e s i s t a n c et op a r a q u a t ，i nt h eo t h e rh a n d ，a oa n d a o b pd e c r e a s e di nt h e m k e yw o r d s ：t o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ；l - a s c o r b i ca c i d ；r n a i ；g e n e e x p r e s s i o n ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ；g e n er e g u l a t i o n ； i v 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 0 6 屆碩+ 學位論文 v 華中農(nóng)業(yè)大學學位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權書 學位論文 如需保密，解密時間 厶7 年月伽日 是否保密舫一軍 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成 果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng) 發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學或其他教育機構的學位或 證書而使用過的材料，指導教師對此進行了審定。與我一同工作的同志對本研究所 做的任何貢獻均已在論文中做了明確的說明，并表示了謝意。 研究生簽名研3 2 塢 時間：厶g 年月鉑日 學位論文使用授權書 本人完全了解“華中農(nóng)業(yè)大學關于保存、使用學位論文的規(guī)定”，即學生必須按 照學校要求提交學位論文的印刷本和電子版本；學校有權保存提交論文的印刷版和 電子版，并提供目錄檢索和閱覽服務，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、 匯編學位論文。本人同意華中農(nóng)業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學 位論文的全部或部分內容。 注：保密學位論文在解密后適用于本授權書。 學位論文作槲嘶拍 鈉張鶘 簽名日期：z 年月伽日 簽名日期：莎砷多年鄉(xiāng)月盤刃日 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 0 6 屆碩士學位論文 1 前言 1 1 課題的提出 維生素c ( v c ) 即抗壞血酸( a s c o r b i c a c i d ，a s a ) ，在生物體中不僅具有抗氧 化作用而且具有重要的代謝功能。人們研究發(fā)現(xiàn)，植物中，抗壞血酸與植物的抗逆 性表現(xiàn)為正相關性，提高植物細胞內的抗壞血酸的含量，能使植物耐炎熱、寒冷和 鹽堿等逆境的能力得到增強?？箟难崾侨祟惡蛣游锞S持生長、繁殖和保證健康所 必需的營養(yǎng)物質。膠原質對于人體的組織細胞、牙齦、血管、骨骼、牙齒的發(fā)育和 修復是一種重要的物質，而抗壞血酸在膠原質的形成上扮演很重要的角色。抗壞血 酸能幫助人體內鐵的吸收；降低血液中的膽固醇；預防病毒和細菌的感染，增強機 體的免疫系統(tǒng)功能；防止亞硝基胺( 致癌物質) 的形成：減少靜脈中血栓的發(fā)生； 使蛋白質細胞互相牢聚，從而能延長壽命。缺乏抗壞血酸會導致壞血病。抗壞血酸 還與植物細胞的分裂、伸長和植株生長有關。植物、微生物和大多數(shù)動物體內可自 行合成維生素c ，但是人類、猿猴、天竺鼠等自身已經(jīng)喪失了合成能力，必須從食 物中攝取，而新鮮蔬菜和水果是抗壞血酸最好的來源。 抗壞血酸濃度在不同的植物種類、不同的植物組織中是有差異的。葉片抗壞血 酸含量通常在2 5 比m o l g ，有些高山植物中的含量可在1 0 倍以上；繁殖器官和分生 組織抗壞血酸含量也很高，果實也富含抗壞血酸。然而我們對造成這種差異的原因， 或控制的機理知之甚少。如果我們能有目的地控制不同組織和器官的抗壞血酸代 謝，將有利于增加植物產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，同時增強植物本身對逆境的抗性。 番茄系茄科番茄屬一年生或多年生草本植物，是一種高營養(yǎng)、高價值的食用作 物，現(xiàn)已成為世界上主要的栽培蔬菜。番茄中含有豐富的檸檬酸、蘋果酸所以呈酸 性，而抗壞血酸有較強的還原性，極易受溫度、p h 值、光等因素的影響，在堿性條 件下易破壞，在酸性條件下較穩(wěn)定，故在同樣條件下，番茄中維生素c 的保存率比 其它蔬菜要高許多( 馮彥博，2 0 0 4 ) 。 盡管抗壞血酸具有重要的功能，且早在1 9 3 3 年就已鑒定出抗壞血酸的分子結 構，但到目前為止，人們對其生物合成途徑的認識仍不完全。動物、微生物和植物 中，抗壞血酸生物合成途徑是存在差異的。動物和微生物中抗壞血酸生物合成途徑 揭示的較早，并成功的應用于生物發(fā)酵生產(chǎn)抗壞血酸。雖然l s h e r w o o d 在1 9 5 4 年就 提出植物中存在類似于動物的抗壞血酸代謝途徑，但由于沒有找到轉化的中間產(chǎn)物 而最終沒有得到驗證。直到2 0 世紀9 0 年代中期，c o n k l i n 和l a s t 從擬南芥突變體 中分離到抗壞血酸缺陷型，才使人們重新對植物抗壞血酸生物合成途徑高度重視。 1 9 9 8 年，w h e e l e r 等根據(jù)自己的研究工作，結合已有的知識積累，提出了植物抗壞 血酸生物合成的甘露糖l 一半乳糖途徑。以后，a g i u s 等( 2 0 0 3 ) 、w o l u c k a 等( 2 0 0 3 ) 、 l o r e n c e 等( 2 0 0 4 ) 相繼證實和提出了植物抗壞血酸生物合成的半乳糖醛酸途徑、 番茄v c 代謝相關的a p x 、a o b p 、a o 基因功能初步鑒定與分析 古洛糖途徑及肌醇途徑。 新近發(fā)現(xiàn)的植物抗壞血酸的生物合成及代謝途徑具有極為重要的理論研究意 義和實際應用價值，意味著我們可以通過基因工程手段調控植物抗壞血酸合成和代 謝，從而增加其產(chǎn)品的營養(yǎng)品質，提高植物本身對逆境的抗性。即利用植物遺傳轉 化對目的基因進行功能鑒定，從表型和生理生化等方面對轉基因植株進行比較全面 的分析，獲得高含抗壞血酸、高抗逆境的轉基因番茄品系。但目前對其進行調控的 研究報道還不是很多。 1 2 抗壞血酸在植物體內的生理功能 抗壞血酸是一種普遍存在于植物組織的高豐度小分子抗氧化物質，所有綠色植 物都能合成抗壞血酸，可以很方便的為人類提供豐富的維生素c 源。抗壞血酸也是 植物體自身代謝過程中必不可少的物質，在植物的生長發(fā)育、光合作用以及抗氧化 作用等方面具有非常重要的生理功能。 1 2 1 抗壞血酸在植物細胞分裂中的作用 抗壞血酸介導細胞分裂的作用在動物和植物細胞中都曾觀察到，但其直接證據(jù) 還很少。在分生組織中抗壞血酸含量一般較高，而在分裂不活躍的區(qū)域不活動中心 抗壞血酸含量則很低。外源抗壞血酸能促進洋蔥根系分生組織和中柱鞘細胞從g 1 期到s 期的分裂，使不活動中心細胞數(shù)量大大減少( 1 r m o c e n t ie ta l ，1 9 9 0 ) ，且不活 動中心細胞比周圍的分生組織細胞含有更高的抗壞血酸氧化酶m r n a 水平( k e r k a n df e l d m a n ，1 9 9 5 ) 。p o t t e r s 等( 2 0 0 0 ) 對煙草懸浮培養(yǎng)細胞的研究表明，a s a 和 d h a 可對細胞分裂進程產(chǎn)生重要影響。在1 9 9 4 年，a r r i g o n i 用石蒜堿( 1 y c o r i n e ，抗 壞血酸的抑制劑) 處理則抑制細胞的分裂，重新補充抗壞血酸，細胞分裂得以恢復。 對擬南芥突變體( v e l j o v i c j o v a n o v i ce ta 1 ，2 0 0 1 ) 和轉基因煙草細胞( t a b a t ae ta 1 ， 2 0 0 1 ) 的研究發(fā)現(xiàn)，內源抗壞血酸的降低可導致植株嫩枝生長速率降低和細胞的分 裂及生長受到抑制。p a s t o r i 等( 2 0 0 3 ) 的研究表明，葉片抗壞血酸含量可以通過植 物激素介導來調節(jié)植株生長。 1 2 2 抗壞血酸在細胞壁代謝和細胞膨大中的作用 p i g n o c c h i 等( 2 0 0 3 ) 提出了抗壞血酸和抗壞血酸氧化酶( a s c o r b a t eo x i d a s e ，a o ) 與細胞膨大和分裂有著密切的聯(lián)系?？箟难嵫趸钢饕嬖谟谥参锏募毎谥?， 特別是在快速生長的細胞內有更高的表達活性；a o 氧化抗壞血酸所形成的m d h a 可通過質膜上的細胞色素b 還原，該過程有電子的跨膜運輸從而促進細胞生長 ( s m i m o f f , 1 9 9 6 ) 。此外，抗壞血酸可作為賴氨酸羥化酶和脯氨酸的輔基，催化羥脯 氨酸和羥賴氨酸的合成( p a d h ，1 9 9 0 ) ，而富含羥脯氨酸的糖蛋白( h r g p s ) 是胞壁 2 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 0 6 屆碩上學位論文 的結構蛋白。胞壁內的抗壞血酸和脫氫抗壞血酸( d h a ) 能夠影響胞壁蛋白和多糖 的交聯(lián)而導致胞壁的疏松；d h a 還能轉變?yōu)榘诓菟猁}，由于該鹽可以通過結合c a 2 + 形成結晶從而能間接調節(jié)胞壁c a 2 + 的水平( l i na n dv a m e r , 1 9 9 1 ) 。同時，抗壞血酸 和h 2 0 2 的平衡能夠控制木質素單體的聚合作用從而調節(jié)胞壁的木質化 ( l i g n i f i c a t i o n ) 過程( d a v e ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 抗壞血酸在光合作用和光保護中的作用 葉綠體中有高濃度的抗壞血酸而缺乏過氧化氫酶( c a t ) ，光系統(tǒng)i ( p si ) 中氧 的光還原所形成的過氧化氫可以通過抗壞血酸過氧化物酶( a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ， a p x ) 清除( y a b u t ae ta 1 2 0 0 2 ) ：同時舡a 氧化產(chǎn)物單脫氫抗壞血酸( m d h a ) 可 作為p si 的直接電子受體( m i y a k ea n da s a d a ，1 9 9 2 ) 。另外，抗壞血酸也是紫黃質 脫環(huán)氧酶的輔助因子，該酶是通過類囊體膜將紫黃質轉變成玉米黃質的葉黃素循環(huán) ( x a n t h o p h y l lc y c l e ) 中的重要酶類，對于保護光合作用和消耗過剩光能的正常進行 具有重要意義( p a t r i c i ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 l 2 4 抗壞血酸在植物抗氧化系統(tǒng)中的作用 植物體內一定濃度的r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 是植物正常的生理過程 中必需的，故在植物正常代謝過程中不可避免地會產(chǎn)生活性氧，但r o s 生成過多 會造成細胞損傷，引起植物未成熟衰老和死亡。r o s 是指化學性質活躍的含氧原子 或原子團，包括單線態(tài)氧、烷過氧化自由基、超氧陰離子自由基、脂過氧化自由基、 過氧化氫( h 2 0 2 ) 、羥自由基等。各種逆境會引起植物體內r o s 大量上升，造成 r o s 傷害。它可以破壞脂類、核酸和蛋白質，造成氧逆境損傷，導致正常的生理過 程遭到破壞( w a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) ?？箟难峥梢灾苯忧宄参矬w內包括單線念氧、 超氧陰離子及羥自由基在內的活性氧( p a d h ，1 9 9 0 ) 。其次，抗壞血酸能維持另一重 要抗氧化劑維生素e 的還原態(tài)，并通過抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)( a s a g s hc y c l e ) 清除h 2 0 2 ( a s a d a ，1 9 9 2 ) ，從而保護植物有機體及其正常代謝免于氧化脅迫 ( o x i d a t i v es t r e s s ) 造成的傷害?？箟难徇€可能在植物逆境反應中起著信號分子的 作用( k a r p i n s k ie ta 1 ，1 9 9 7 ；p i g n o c c h ia n df o y e r , 2 0 0 3 ) 。c o n k l i n 等( 1 9 9 6 ) 從擬南 芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 獲得的突變體v t c l 由于缺乏合成足夠a s a 的能力( 約為 野生型的2 5 ) 而對0 3 異常敏感，外施a s a 則可提高其抗性。 1 3 抗壞血酸的轉運 不同的植物組織抗壞血酸含量存在差異，抗壞血酸的含量還受植株的生理狀態(tài) 和環(huán)境因素影響( s m i m o f f , 1 9 9 6 ) 。a s a 在果實和其他的一些貯藏器官含量較高 ( l o e w u sa n dl o e w u s 1 9 8 7 ) 。幼嫩組織中抗壞血酸的含量比衰老組織高，舡a 一般 積累在活躍生長的組織如分生組織中( l u w ee ta 1 ，1 9 9 3 ) ?？箟难岽嬖谟诖蠖鄶?shù) 3 番茄v c 代謝相關的a p x 、a o b p 、a o 基目功能初步鑒定分析 的細胞區(qū)室中，例立u 葉綠體可積累濃度很高的抗壞血酸，達到葉片總抗壞血酸含量 的1 2 - 3 0 ( f o y e ra n d l e l a n d a i s 1 9 9 6 ) 。a s a 也存在于胞質、液泡( r a u t e n k r a n ze t a 1 ，1 9 9 4 ) 和質外體( v a n a c k e re ta l ，1 9 9 8 ) 中。據(jù)估計，胞質抗壞血酸庫的大小為2 0 m m o l l ( f o y e ra n dl e l a n d a i s ，1 9 9 6 ) 。因為催化其生物合成的最后一步酶g l d h 就 存在于線粒體中，所以線粒體中也存在大量抗壞血酸( b a r t o l ie la 1 2 0 0 0 ) ?？箟难?酸在植物細胞中的分布見圖1 。一旦在線粒體中合成，抗壞l 蟣酸就需要被轉運到其他 細胞區(qū)室?？箟难嵩谥参镏械霓D運主要分兩部分：通過質膜向質外體轉運和胞內 業(yè)細胞區(qū)m 轉運( h o r e m a n se ta l ，2 0 0 0 ) ，調節(jié)性轉運系統(tǒng)的存在，使抗壞血酸能 夠根據(jù)生理、發(fā)育和代酣的需要在不同細胞區(qū)間迅速轉移。 目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在植物細胞內，抗壞皿酸的轉運可以在葉綠體、類囊體、 液泡和質膜上發(fā)生，而通過線粒體和過氧化物酶體轉運則很少見。不同抗壞血酸轉 運系統(tǒng)見圖l 。凼為抗壞血酸臺成的最后一步發(fā)生在線粒體內膜，所以人們認為抗 壞血酸由線粒體內膜向胞質的轉移是簡單擴散的結果。然而，抗壞血酸由胞質向葉 綠體基質的轉運是一個載體介導的過程，可能受易化交換擴散驅動。相比較，抗壞 血酸通過內囊體膜的轉運不受載體介導，是一個p h 值和濃度梯度依賴的簡單擴散 過程( f o y e ra n dl e l a n d a i s 1 9 9 6 ) 。 抗壞血酸通過植物質膜轉運最初的證據(jù)是m o z a f a r 等( 1 9 9 3 ) 從人絲葉1 發(fā)現(xiàn)的， 隨后人們對從大麥葉( r a u t e n k r a n z ，1 9 9 4 ) 、豌豆葉( f o y e r a n dl e l a n d a i s ，1 9 9 6 ) 和 煙草b y 2 細胞系( h o r e m a n se ta l ，1 9 9 8 ) 中分離的原啦質體的更詳細的研究充分證 實了質膜a s a 肅i d h a 轉運體的存在。與葉綠體膜相比，質膜相關載體對a s a 和d h a 鼴d i 出很高的親和力。目前認為在植物質膜中至少存在3 種a s a d h a 轉運驅動機制： a s a i d h a 、易化擴散和質子電化學梯度轉運變換轉運。 a p o p l a 竹 5 一1 0 0 0 i ) i i a d h a a s a 圖1 植物細胞內抗壞血酸的分布與轉運( 引自h o r e m a n s 等，2 0 0 0 ) f i g 1d i s t r i b u t i o na n dt r a n s p o r to f a s c o r b i ca c i di np l a n tc e l l s ( c i t e df r o mh o r e m a n se ta 1 ，2 0 0 0 ) v 渣+ m 線粒體：c 辣體：p ：過氧化物酶體 4 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 0 6 屆碩士學位論文 質外體抗壞血酸含量可達葉片總抗壞血酸含量的1 0 ( v a n a c k e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 有證據(jù)顯示，a s d h a 也需要從質外體向胞質轉運( l u w e ，1 9 9 6 ) 。由于質外體抗 壞血酸參與一系列重要的生理過程，包括細胞分裂、伸長和脅迫抵抗，因此抗壞血 酸通過植物質膜的轉運具有重要的生理作用。 1 4 抗壞血酸的代謝 植物體內，抗壞血酸在抗壞血酸過氧化物酶和抗壞血酸氧化酶的作用下，氧化成 單脫氫抗壞血酸。單脫氫抗壞血酸不穩(wěn)定，在單脫氫抗壞血酸還原酶( m d h a r ) 的作用下重新轉變成抗壞血酸，或者在沒有酶的作用下代謝成脫氫抗壞血酸。脫氫 抗壞血酸可自發(fā)水解成2 ，3 二酮古洛酸，或者利用還原型谷胱甘肽( g s h ) 作為還 原劑，在脫氫抗壞血酸還原酶( d m 堰) 的作用下，重新生成抗壞血酸，而還原型 谷胱甘肽由氧化型谷胱甘肽( g s s g ) 在谷胱甘肽還原酶( g r ) 的作用下產(chǎn)生( 圖2 ) 。 這個代謝過程被稱為a s a - g s h 循環(huán)( n o c t o ra n df o y e r 1 9 9 8 ) ，該循環(huán)由一系列酶促 反應組成，通過依賴n a d p h 的氧化而與h 2 0 2 的清除密切相關。a s a - g s h 循環(huán)中的 酶類高活性地存在于葉綠體，但在其他細胞區(qū)室如胞質、過氧化物酶體和線粒體中 也具有相當高的活性以驅動h 2 0 2 的清除過程( n o c t o ra n df o y e r , 1 9 9 8 ) 。 m d 自發(fā)水解 i i 2 , 3 二酮古洛酸 圖2 植物體內抗壞血酸的代謝 f i g 2m e t a b o l i s mo fa s c o r b i ca c i di np l a n t a p x ：抗壞血酸過氧化物酶；a o ：抗壞血酸氧化酶；m d h a r ：單脫氫抗壞血酸還原酶； d h a r ：脫氫抗壞血酸還原酶；g s h ：還原型谷胱甘肽；g s s g ：氧化型谷胱甘肽 a p x ：a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ；a o ：a s c o r b a t eo x i d a s e ；m d h a r ：m o n o d e h y d r o a s c o r b a t e r e d u t a s e ；d h a r ：d e h y d r o a s c o r b a t er e d u t a s e ；g s h ：g l u t a t h i o n e ；g s s g ：o x i d i z e dg l u t a t h i o n e 抗壞血酸在植物細胞中的降解位點還不清楚，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸參與了 酒石酸和草酸的合成( l o e w u sa n dl o e w u s ，1 9 8 7 ；d cg a r aa n dt o m m a s i ，1 9 9 9 ) ?？?壞血酸在氧化型和還原型之間循環(huán)的效率很高，因而很少有d h a 被降解掉，并因此 降低了對抗壞血酸高速從頭合成的需求。 5 番茄v c 代謝相關的a p x 、a o b p 、a o 基岡功能初步鑒定與分析 1 5 抗壞血酸生物代謝相關酶及其基因調控研究進展 因為抗壞血酸在植物抗氧化系統(tǒng)中作為許多氧化反應的底物，所以a s a 在氧脅 迫的研究一直都是研究的熱點。目前對植物抗壞血酸生物代謝途徑中相關酶的研究 已有一些報道，研究進展也很不一致，如抗壞血酸過氧化物酶研究得較深入，而其 他酶則由于發(fā)現(xiàn)較晚，對它們的研究還不夠深入。隨著分子生物學和基因工程技術 的發(fā)展，對抗壞血酸生物代謝相關酶基因進行調控的研究報道也日漸增多。對a s a 氧化代謝的關鍵酶的研究可以調控a s a 含量，調控植物抵抗逆境的能力。 1 5 1 抗壞血酸氧化酶的研究 抗壞血酸氧化酶( a o ) 是一種屬于銅氧化酶家族的酶，包括漆酶和血漿銅藍蛋 8 ( 0 m a l l e ye ta 1 ，1 9 9 3 ) 。它是由糖蛋白和一個大的活性區(qū)域組成，其活性的大部 分位于細胞壁上，因此它是一種細胞壁酶( m o s e ra n dk a n e l l i s ，1 9 9 4 ) 。g e o r g ed i a l l i n a s 等( 1 9 9 6 ) 發(fā)現(xiàn)瓜的a o 由4 個基因編碼，而且已經(jīng)克隆了其中3 個基因。a o 存在于 所有高等植物中，在快速生長的植物組織和正在萌發(fā)的植物種子中具有高水平的a o 活性。在快速擴展的葫蘆科果實中也觀察到很高的a o 活性，當果實完成快速擴展的 階段時，a o 活性、蛋白質及m r n a 水平也隨之下降( l i na n dv a m e r ，1 9 9 1 ；e s a k ae ta 1 ， 1 9 9 2 ) 。該酶催化a s a 氧化為m d h a ，同時伴隨著分子態(tài)氧被還原為水( s m i r n o f f , 1 9 9 6 ) 。 目前，已從黃瓜( o h k a w ae ta 1 ，1 9 8 9 ，1 9 9 4 ) 、南瓜( e s a k ae ta 1 ，1 9 9 0 ；k i s ue ta 1 ， 1 9 9 7 ) 、甜瓜( d i a l l i n a se ta 1 ，1 9 9 7 ；s a n m a r t i n ，2 0 0 2 ) 、煙草( k a t oa n de s a k a ，1 9 9 6 ) 等植物中克隆出了編碼a o 的基因。a o 基因表達受復雜的轉錄和翻譯調控，同時光 和生長素對它的發(fā)育調控也有影響( e s a k ae ta 1 ，1 9 9 2 ) 。l m c h e n ( 1 9 9 9 ) 報道 了用c u s 0 4 處理離體水稻葉片能增加a o 活性。l a d i s l a vt a m a s 等發(fā)現(xiàn)用過量的鎘處理 大麥的根，明顯抑制其a o 活性，同時能激活a o 的同工酶。p i g n o c c h i 等( 2