（植物學(xué)專業(yè)論文）用mpcr檢測(cè)閩江流域表面水體中病原性大腸桿菌的毒素基因.pdf

摘要 摘要 大腸桿菌( e s c h e r i c h i ac o l l ) 是人和溫血?jiǎng)游锬c內(nèi)普遍存在的細(xì)菌，可分為病 原性大腸桿菌和非病原性大腸桿菌。本文在文獻(xiàn)綜述中介紹了大腸桿菌毒素基因檢 測(cè)的研究進(jìn)展以及多重p c r ( m u l t i p l e xp c r ) 技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。本研究以閩江流 域表體水面中分離出的大腸桿菌為材料，經(jīng)膜過(guò)濾法( m e m b r a n ef i l t r a t i o nm e t h o d ) 結(jié)合m f c - - b c i g 培養(yǎng)基的方法來(lái)分離糞大腸桿菌，并使用乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基和磷酸 鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基來(lái)對(duì)其進(jìn)行生化檢測(cè)，最終確定單位體積水樣中糞大腸桿菌的 數(shù)量，然后將糞大腸桿菌菌株制成p c r 模板同時(shí)甘油保存。 研究結(jié)果表明：對(duì)閩江流域從上游到下游7 個(gè)斷面進(jìn)行了大腸桿菌的分離、鑒 定和1 2 種毒素基因的多重p c r 檢測(cè)。在鑒定的1 2 3 1 株糞大腸桿菌中檢出1 0 種毒 素基因，其中具有擴(kuò)散性黏附素( a i d a j ) 毒素基因的大腸桿菌占總數(shù)的1 2 9 9 ， 熱不穩(wěn)定腸毒素( e l t ) 和熱穩(wěn)定腸毒素( a s t a ) 數(shù)量次之( 分別占總數(shù)的5 8 和5 4 ) ， 還檢測(cè)出了少數(shù)高危菌株的主要致病因子，例如志賀氏毒素( s t x 2 e ) 和耐藥性因子 ( s e p a ) 等。 分別于不同季節(jié)在閩江流域福州過(guò)境段的洪山橋和解放大橋斷面采取水樣，進(jìn) 行大腸桿菌的分離、鑒定。用多重p c r 方法對(duì)不同季節(jié)分離的大腸桿菌毒素基因的 時(shí)空分布進(jìn)行定性與定量分析。從分離的2 0 1 5 株糞大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)8 4 0 株潛在的致 病性大腸桿菌，分別屬于腸出血性大腸桿菌( e h e c ) 、腸聚集性大腸桿菌( e a e c ) 、腸 致病性大腸桿菌( e p e c ) 和腸產(chǎn)毒性大腸桿菌( e t e c ) 。檢出的1 0 種毒素基因中， 以 擴(kuò)散性黏附素基因( a i d a j ) 、熱穩(wěn)定性腸毒素基因( a s t a ) 和耐藥性因子( s e p a ) 為最多；細(xì)菌總量、大腸桿菌總數(shù)和致病性大腸桿菌總數(shù)在冬季較低，春季較多， 夏秋季節(jié)達(dá)到全年數(shù)量的高峰；潛在的致病性大腸桿菌的毒素基因的種類和數(shù)量也 是在冬季最少，春夏季上升，秋季最多。 使用多重p c r ( m u l t i p l e xp c r ) 的方法對(duì)糞大腸桿菌菌株中的毒素基因 ( v i r u l e n c eg e n e ) 進(jìn)行檢測(cè)，為閩江河的污染現(xiàn)狀和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù) 支撐。 關(guān)鍵詞：閩江流域；大腸桿菌；毒素基因；多重p c r 中文文摘 中文文摘 本研究以閩江流域表體自上游至下游水面中分離出的大腸桿菌為材料，使用膜 過(guò)濾法分離出了糞大腸桿菌，并對(duì)其1 2 種毒素基因使用多重p c r 的方法進(jìn)行檢測(cè)。 在水體糞大腸桿菌的分離、富集和生化鑒定中，1 3 葡萄糖醛酸酶是大腸桿菌產(chǎn) 生的一種特異性酶，研究發(fā)現(xiàn)，9 4 - - 9 6 的大腸桿菌均表達(dá)1 3 葡萄糖醛酸酶，而 其它腸道細(xì)菌表達(dá)1 3 葡萄糖醛酸酶的比例明顯低于大腸桿菌。它可水解不同的底物 生成有色或發(fā)光物質(zhì)，從而完成對(duì)大腸桿菌的快速檢測(cè)。用于檢測(cè)1 3 一葡萄糖醛酸酶 的底物有很多種，如4 甲基傘形酮一1 3 一d 葡萄糖醛酸苷( m u g ) ，5 一溴4 氯3 吲哚基 1 3 d 葡萄糖醛酸苷( b c i g ) 。本實(shí)驗(yàn)采用的底物為b c i g ，是將b c i g 添加到m f c 基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中。m f c 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨作為碳、氮源及維生素礦物質(zhì)來(lái)源，其中牛 膽鹽能夠抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)。在m f c b c i g 培養(yǎng)基上，具有1 3 葡萄糖醛酸 酶活性的微生物將在培養(yǎng)基上產(chǎn)生可見(jiàn)的藍(lán)色菌落。挑取藍(lán)色的菌落接種于l b 固 體培養(yǎng)基上，3 7 培養(yǎng)2 4h 后，接入l b 液體培養(yǎng)基中，再在3 7 下的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)2 4h 。 取培養(yǎng)的菌液，接種于乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，3 7 培養(yǎng)2 4h 后，觀察產(chǎn)酸，培養(yǎng) 基中添加了溴酚紫作為指示劑，若有產(chǎn)酸，培養(yǎng)基則由紫色變?yōu)辄S色，即培養(yǎng)基呈 黃色的為陽(yáng)性，顏色不變呈紫色的則為陰性；接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基，3 7 培養(yǎng)2 4h 后，加入1 0 l 甲基紅溶液，輕輕搖動(dòng)，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試 劑本色為陰性。一般2 4h 即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。吲哚是色氨酸的組成成分，大腸桿菌 能夠產(chǎn)生色氨酸酶分解色氨酸以提供營(yíng)養(yǎng)需要，色氨酸分解為吲哚后，可與甲基紅 溶液中的對(duì)二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)，生成玫瑰吲哚，呈玫瑰紅色。 雙重檢測(cè)后，將分離物保存于終濃度為1 5 的甘油中，放置一7 0 的超低溫冰 箱中待用。甘油保存的大腸桿菌可以2 的體積分別接種到含1 0 0p ll b 培養(yǎng)液的 9 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，3 7 過(guò)夜培養(yǎng)，在2 5 0 0r p m 的條件下離心2 5m i n ，然后去上 清，并將殘余的培養(yǎng)液晾干。最后加入1 0 0 9 l 的無(wú)菌水，輕輕震蕩至菌體重新懸浮， 作為p c r 反應(yīng)的模板，2 0 保存?zhèn)溆谩?本研究采用多重p c r 的方法，把引物分為3 組，每組四對(duì)引物，對(duì)閩江流域自 上游至下游表面水體中大腸桿菌的毒素基因的種類及數(shù)量，并對(duì)毒素基因的種類進(jìn) v 福建師范大學(xué)黃文文碩士學(xué)位論文 行分型。并采用同樣的方法，對(duì)閩江流域福州過(guò)境段洪山橋和解放大橋兩處表面水 體進(jìn)行5 次采樣且對(duì)水體中大腸桿菌的毒素基因進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)其中原因進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：閩江流域從上游到下游7 個(gè)斷面中，鑒定的1 2 3 1 株糞大腸桿菌 中檢出1 0 種毒素基因，其中具有擴(kuò)散性黏附素( a i d a 1 ) 毒素基因的大腸桿菌占總 數(shù)的1 2 9 9 ，熱不穩(wěn)定腸毒素( e l t ) 和熱穩(wěn)定腸毒素( a s t a ) 的數(shù)量次之( 分別占 總數(shù)5 8 和5 4 ) ，還檢測(cè)出了少數(shù)高危菌株的主要致病因子，例如志賀氏毒素 ( s t x 2 e ) 和耐藥性因子( s e p a ) 等，這1 0 種毒素基因分屬于腸出血性大腸桿菌 ( e h e c ) 、腸產(chǎn)毒大腸桿菌性( e t e c ) ，腸致病性大腸桿菌( e p e c ) ，腸聚集性大腸桿 菌( b 垣c ) 四個(gè)亞群。從上游勁下游致病性大腸桿菌毒性類型和毒素基因數(shù)量呈上 升趨勢(shì)。從處于閩江上游三大支流建溪、富屯溪和沙溪會(huì)合處的南平市毒性類型和 毒素基因數(shù)量明顯高于上游。這可能與上游的污染物排放和南平市人口密集，畜禽 養(yǎng)殖業(yè)和生活污水排放量大有關(guān)。福州過(guò)境段致病性大腸桿菌毒性類型和毒素基因 數(shù)量較高除了本地污染物排放外，也可能部分歸因于上中游水體的污染。 福州過(guò)境段檢出的1 0 種毒素基因中，以擴(kuò)散性黏附素基因( a i d a j ) 、熱穩(wěn)定 性腸毒素基因( a s t a ) 和耐藥性因子( s e p a ) 為最多；細(xì)菌總量、大腸桿菌總數(shù)和 致病性大腸桿菌總數(shù)在冬季較低，春季較多，夏秋季節(jié)達(dá)到全年數(shù)量的高峰；潛在 的致病性大腸桿菌的毒素基因的種類和數(shù)量也是在冬季最少，春夏季上升，秋季最 多。福州位于閩江下游，上游支流和干流各種污染物流經(jīng)洪山橋和解放大橋后注入 臺(tái)灣海峽，福州又是閩江流域排污量最大的城市，這與閩江沿岸和福州地區(qū)養(yǎng)殖業(yè) 和生活污水的排放不無(wú)關(guān)系。大腸桿菌種類、數(shù)量在春夏秋季逐漸增多，腸道病毒 性疾病在夏秋季是發(fā)病高峰。原因可能是較之春冬季節(jié)，大腸桿菌在夏秋季節(jié)的溫 度下存活時(shí)間更長(zhǎng)。 a b s t r a c t a b s t r a c t e s c h e r i c h i ac o l i ( e c o a ) ，ak i n do fc o m m o nb a c t e r i ai nt h ei n t e s t i n eo fh u m a n b e i n g sa n de n d o t h e r m i tc a nb ed i v i d e di n t ot w ot y p e s ：p a t h o g e n i ca n dn o n p a t h o g e n i c e s c h e r i c h i ac o h i nt h i st h e s i s ，t h er e s e a r c hp r o g r e s so ft h ed e t e c t i o no fv i r o g e n e si nt h e p a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ac o l ia n dt h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fm - p c rt e c h n o l o g y w e r ei n t r o d u c e di nt h el i t e r a t u r er e v i e w t h em a t e r i a lo ft h i ss t u d yw a st h ee s c h e r i c h i a c o l i t h a to r i g i n a t e df r o mm i n j i a n gr i v e r t h ee s c h e r i c h i ac o l iw a sd i v i d e dw i t h m e m b r a n ef i l t r a t i o nm e t h o da n dt h eu s i n go fm f cb r o t h t h eb i o c h e m i s t r yc h a r a c t e ro f t h ep a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ac o l iw a sd e t e c t e db yl a c t o s ef e r m e n t a t i o nb r o t ha n d t r y p t o n eb r o t h t h e nt h en u m b e ro ft h ee s c h e r i c h i ac o l iw a sa s c e r t a i n e d t h er e s e a r c hr e s u l t sr e v e a l e dt h a t12 3le s c h e r i c h i ac o l ii s o l a t e sf r o ms e v e n s a m p l i n gs i t e sc o v e t i n gu p s t r e a mt od o w n s t r e a mo fm i n j i a n gr i v e rw a t e r s h e dw e r e i n v e s t i g a t e du s i n gm u l t i p l e x p c rw i t h 12p a i r so fp r i m e r so fv i r u l e n c eg e n e s 10 v i r u l e n c eg e n e sw e r ef o u n di nt h ee c o l ii s o l a t e st e s t e d 1 2 9 9 i s o l a t e sc a r r i e dt h e a i d a - 1g e n e ，5 8 i s o l a t e sp o s s e s s e dt h ee l tg e n ea n d5 4 i s o l a t e sh a r b o r e dt h ea s t a g e n e t h e10v e r og e n e sf o u n di nt h i ss t u d yw e r eg r o u p e dt oe h e c ( e n t e r o h e m o r r h a g i c ec o l o ，e t e c ( e n t e r o t o x i g e n i cec o t i ) ，e p e c ( e n t e r o p a t h o g e n i cec o l i ) a n de a e c ( e n t e r o a g g r e g a t i v ee c o l i ) t h ed i s t r i b u t i o no ft h eg e n o t y p e sa n dq u a n t i t ya ts e v e n s a m p l i n g l o c a t i o n sw e r ed i f f e r e n tw i t hh i g h e s tl e v e l si nt h es i t en e a rn a n p i n gc i t y f o l l o w e db yf u z h o ua r e aw h e r es t x 2 eg e n ew i t ht h eh i g h e s tr i s kw e r ed e t e c t a b l e i n t o t a l l y , o n es t r a i nw h i c hc a r r i e sf o u rv e r og e n e s ，2 7s t r a i ni s o l a t e sw h i c hp o s s e s st h r e e v e r og e n e s ，a n d81s t r a i ni s o l a t e sw h i c hh a r b o rt w ov e r og e n e sw a sf o u n di nm i n j i a n g r i v e l q u a l i f i c a t i o n ，q u a n t i f i c a t i o na n ds e a s o n a lc h a n g e so f t h et o x i cg e n e so f p o t e n t i a l p a t h o g e n i ce c o l ii s o l a t e sr e c o v e r e df r o mf u z h o ur e g i o no fm i n r i v e rw a t e r s h e dw e r e c a r r i e do u ta n da n a l y z e du s i n gm u l t i p l e x - p c r 8 4 0o u to f2 015e c o l ii s o l a t e sw e r e i d e n t i f i e dt ob ep o t e n t i a lp a t h o g e n i ce c o l ii s o l a t e sw h i c h w e r ec l a s s i f i e dt oe h e c ，e a e c ， e p e ca n de t e cg r o u p s 10v e r u l e n c eg e n e sw e r ed e t e c t e d ，w i t ha i d a - 1 ，a s t aa n ds e p a a sd o m i n a n tg e n e s t h et o t a ln u m b e r so fb a c t e r i a li s o l a t e s ，e c o l ii s o l a t e sa n dt h ee c o l i i s o l a t e sc a r r y i n gv i r u l e n c eg e n e si n c r e a s e di ns p r i n ga n ds u m m e r , p e a k e di nf a l lb u t i i i 福建師范大學(xué)黃文文碩士學(xué)位論文 d e c r e a s e di nw i n t e r am u l t i p l e xp c rp r o t o c o l ，w h i c hs u i t a b l ef o rm i n j i a n gr i v e rs i t u a t i o n ，w a s o p t i m i z e da n de s t a b l i s h e d ，p r o v i d i n gar a p i da n dm a s s i v ed e t e c t i o no fv i r o t y p i n go f p a t h o g e n i ce c o l ia n dat e c h n i q u es u p p o r tf o rr e a l t i m em o n i t o r i n ga n dr i s ka s s e s s m e n t o ft h ew a t e rq u a l i t y k e y w o r d s ：m i n j i a n gr i v e r ；e s c h e r i c h i ac o l i ；v i r u l e n c eg e n e s ；m u l t i p l e x - p c r i v 福建師范大學(xué)碩士學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性和使用授權(quán)聲明 福建師范大學(xué)碩士學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性和使用授權(quán)聲明 本人( 姓名)黃塞塞學(xué)號(hào)至q q 魚q 魚壘壘專業(yè)植物堂所 呈交的學(xué)位論文( 論文題目：用m - p c r 檢測(cè)閩江流域水體中病原性大腸 桿菌的毒素基因) 是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行的研究工作及取得的 研究成果。盡我所知，除論文中已特別標(biāo)明引用和致謝的內(nèi)容外，本論 文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果。對(duì)本論文 的研究工作做出貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均已在論文中作了明確說(shuō)明并表示 謝意，由此產(chǎn)生的一切法律結(jié)果均由本人承擔(dān)。 本人完全了解福建師范大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即： 福建師范大學(xué)有權(quán)保留學(xué)位論文( 含紙質(zhì)版和電子版) ，并允許論文被 查閱和借閱；本人授權(quán)福建師范大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi) 容采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文，并按國(guó)家 有關(guān)規(guī)定，向有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)( 如國(guó)家圖書館、中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究 所等) 送交學(xué)位論文( 含紙質(zhì)版和電子版) 。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后亦遵守本聲明) 學(xué)位論文作者簽名：芬丸乏指導(dǎo)教師簽名： 簽字日期：h 1 年易月8 日 簽字日期：年如月踮 緒論 緒論 一、研究背景 閩江是福建省第一大河流，流經(jīng)3 8 個(gè)縣市，是福建人民的母親河，即閩江流域 一千多萬(wàn)人民生產(chǎn)生活用水的主要來(lái)源【l 】。改革開放以來(lái)，隨著集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè) 的迅速發(fā)展，閩江水環(huán)境問(wèn)題日益突出。閩江流域的水體中大腸桿菌等項(xiàng)指標(biāo)超標(biāo) 問(wèn)題受到公眾的廣泛關(guān)注。其中福州過(guò)境段位于閩江下游，是福州市區(qū)以及相鄰地 區(qū)飲用、灌溉、養(yǎng)殖用水的水源。近年來(lái)，隨著沿江地帶經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，閩江水 環(huán)境已受到嚴(yán)重污染，主要污染源為未經(jīng)處理的生活污水、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的廢水等【2 1 。 糞大腸桿菌是衡量水質(zhì)的重要指標(biāo)，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。目前我國(guó)環(huán)保部 門在檢測(cè)水中大腸菌群時(shí)多采用傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法。該法以最可能數(shù)來(lái)表示試驗(yàn)結(jié) 果，但未能區(qū)分大腸桿菌中致病性和非致病性的菌株，無(wú)法鑒定大腸桿菌攜帶的毒 素基因【3 胡。分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為大腸桿菌的檢測(cè)提供了強(qiáng)大的工具。p c r 技術(shù)、d n a 探針、基因芯片、脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)、e l i s a 等技術(shù)已先后被用于大腸桿 菌的檢測(cè)與鑒定【5 羽。而具有高特異性、高敏感度、高效率、低成本特點(diǎn)的多元p c r 技術(shù)則更適合于大批量樣品在分子水平的快速檢測(cè)【_ 7 1 。該法是以8 種或1 1 種不同的基 因?yàn)槟繕?biāo)進(jìn)行3 4 個(gè)不同的多重p c r 反應(yīng)。可同時(shí)檢測(cè)大批量樣品中大腸桿菌的不同 毒素基因，適宜于水環(huán)境生物性水質(zhì)的評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理【7 9 1 。 大腸桿菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 在1 8 8 5 年由e s e h e r i c 發(fā)現(xiàn)，在很長(zhǎng)一段時(shí)間，其被 認(rèn)為是正常腸道菌群的組成部分。至2 0 世紀(jì)中葉，研究發(fā)現(xiàn)某些血清型的大腸桿菌 可引起人、畜不同癥狀的腹瀉【l 們。至此，大腸桿菌分為病原性大腸桿菌和非病原性 大腸桿菌。根據(jù)致病性大腸桿菌中毒素因子引發(fā)的病癥，可將其分為6 個(gè)病原型【7 】： 1 ) 腸致病性大腸桿菌( e n t e r o p a t h o g e n i ee p e c ) ，其主要的致病因素是細(xì)菌的附著因 子，使腸黏膜表皮細(xì)胞破壞，但不產(chǎn)生毒素。束狀菌毛( b t p ，b u n d l ef o r m i n gp i l i ) 介導(dǎo)細(xì)菌與細(xì)胞疏松黏附；細(xì)菌主動(dòng)分泌的緊密素與宿主細(xì)胞膜上相應(yīng)受體緊密結(jié) 合；細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白重排，微絨毛破壞，并干擾腸道對(duì)液體的吸收功能。該侵染癥 常發(fā)生于年齡小于兩歲的小孩，可導(dǎo)致嬰兒嚴(yán)重腹瀉。是嬰幼兒腹瀉的主要病原體， 因直接接觸傳染，有較高死亡率。2 ) 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌( e n t e r t o x i g e n i ce t e c ) ，毒 力因子包括黏附素，腸毒素，水腫病毒素，內(nèi)毒素，溶血素等?？煞譃閮煞N腸毒素 福建師范大學(xué)黃文文碩士學(xué)位論文 ( e n t e r o t o x i n s ) ，對(duì)熱不穩(wěn)定( h e a t l a b i l e ：l t - i 和l t - i i ) 或?qū)岱€(wěn)定( h e a t s t a b l e ；s 哳口s t b ) 腸毒素。其中前者與霍亂毒素的核酸序列有8 0 的相似性且其作用位置與霍亂毒素 相同，常引起小孩和旅行者腹瀉，傳染途徑為污染的水和食物，是人畜共患病原菌， 為引起仔豬腹瀉的主要病原之一。3 ) 腸侵襲性大腸桿菌( e n t e r o i n v a s i v ee r e c ) ，其毒 素基因編碼產(chǎn)生i p a a ，b ，c ，d4 種蛋白，其中i p ab ，c ，d 三種蛋白是細(xì)菌侵入上皮細(xì)胞 所必需的，其侵襲腸粘膜細(xì)胞。破壞結(jié)腸上皮細(xì)胞造成大便帶血，引起類似痢疾 ( d y s e n t e r y - l i k e ) 的癥狀，糞便含血液和黏液，黏液中含有很多白血球。4 ) 腸出血性 大腸桿菌( e n t e r o h e m o r r h a g i ee h e c ) ，毒素基因編碼產(chǎn)生志賀氏毒素i 和?；虍a(chǎn)物 是一種吸附蛋白緊密素( i n t i m i n ) 為人畜共患病原菌。主要由水和食物污染引起， 特劇是受牛等排泄物污染【l 。人受感染后易并發(fā)溶血性尿毒癥候群( h e m o l y t i cu r e m i c s y n d r o m e ；h u s ) ，十歲以下孩童以及免疫力差的老人易受感染。5 ) 腸聚集性大腸 桿菌( e n t e r o a g g r e g a t i v ee a g g e c ) ，具有與h e p 一2 細(xì)胞( 人喉上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系) 粘附 的能力。該菌經(jīng)由質(zhì)粒介導(dǎo)集聚性黏附于上皮細(xì)胞質(zhì)膜( p l a s m am e m b r a n e ) 上，損壞 并導(dǎo)致臨近微茸毛細(xì)胞，使之喪失吸附特性而引起腹瀉。 綜上所述，對(duì)閩江流域表面水體大腸桿菌毒素基因進(jìn)行檢測(cè)并分型對(duì)政府以及 相關(guān)部門有指導(dǎo)性的意義。 二、文獻(xiàn)綜述 1 大腸桿菌的生物學(xué)特性 大腸桿菌分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。其不同菌株間d n a 相關(guān)性為 8 0 ，而與同科的志賀氏菌屬的d n a 相關(guān)性可達(dá)8 0 8 7 。大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道 中的常居菌，一般不致病，在一定條件下可引起腸道外感染【1 2 】。 大腸桿菌大小為0 4 0 7 1 - 3 哪，無(wú)芽孢，大多菌株有動(dòng)力。為革蘭氏陰性菌， 有普通菌毛與性菌毛，有些菌株有糖類包膜。 大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良 好。最適生長(zhǎng)溫度是3 7 ，在4 2 4 4 條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍為1 5 4 6 。此菌兼性厭氧，在有氧條件下生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)p h 值為6 8 8 0 ，所有培養(yǎng) 基p h 值為7 0 7 5 ，若p h 值低于6 0 或高于8 0 則生長(zhǎng)緩慢。 大腸桿菌的大部分菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、 木膠糖、阿拉伯膠等，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。其抗原構(gòu)造比較復(fù)雜，主要由菌體o 抗原、鞭毛h 抗原、莢膜k 抗原組成【1 3 】。 緒論 2 糞大腸桿菌的毒素基因 ( 1 ) e s t a 、e s t b 、e l t 、f a e g 、f a n a 、f a s a 、f e d a 基因 這5 種毒素基因皆屬于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌，群i e t e c 。其中e s m 和e s t b 兩種毒素基 因編碼產(chǎn)生熱穩(wěn)定腸毒素；礎(chǔ)編碼產(chǎn)生熱不穩(wěn)定腸毒素【1 4 j - 屈p g 編碼f 4 k 8 8 菌毛亞 單位基因【1 5 】：屈剃編碼k 9 9 f 5 菌毛亞單位基因【1 6 - t 7 ；f a s a 編碼菌毛9 8 7 p 腰6 亞單位【1 8 】； f e d a 編碼f 1 8 菌毛亞單位基因【1 9 】。e t e c 的毒力因子包括黏附素、腸毒素、水腫病毒 素、內(nèi)毒素、溶血素等。熱不穩(wěn)定性腸毒素與霍亂毒素的核酸序列有8 0 相似且其 作用位置與霍亂毒素也相同。屬于人畜共患病原菌，是引起仔豬腹瀉的主要病原之 一，常引起小孩和旅行者腹瀉，傳染途徑為污染的水和食物。 ( 2 ) 口鰣基因 屬于腸致病性大腸桿菌，i l o e p e c 2 0 1 。a s t a 基因編碼產(chǎn)生熱穩(wěn)定腸毒素，其最主 要的致病因素是細(xì)菌的附著使腸粘膜表皮細(xì)胞受到破壞，但不具有侵犯性和不產(chǎn)生 毒素。常發(fā)生于年齡小于2 歲的小孩，可導(dǎo)致嬰兒嚴(yán)重腹瀉。其傳染途徑是因?yàn)橹苯?接觸傳染，常發(fā)生在醫(yī)院和護(hù)理之家，有高死亡率【2 1 2 2 1 ( 3 ) p a a 和s e p a 基因 這兩種毒素基因分屬于腸聚集性大腸桿菌，即e a e c 。其中p a a 編碼一種黏附與 消除相關(guān)蛋白【2 3 1 ，s e p a 是一種多耐藥性基因，能編碼一種使藥物外流的蛋白【2 4 1 。二 者具多重耐藥性，故對(duì)多種抗菌素不敏感。因細(xì)菌附著在腸細(xì)胞的質(zhì)膜上，損壞并 導(dǎo)致臨近微絨毛細(xì)胞喪失吸附特性而引起腹瀉，對(duì)人畜的危害大，存在高風(fēng)險(xiǎn)。 ( 4 ) a i d a - 1 和s 白c 2 e 基因 二者屬于腸出血性大腸桿菌，即e h e c 。a i d a j 基因編碼擴(kuò)散性附著的黏附素 【2 5 】s t x 2 e 編碼產(chǎn)生志賀氏毒素，基因產(chǎn)物是一種吸附蛋白緊密素，屬于人畜共患病 原菌，它們能夠產(chǎn)生導(dǎo)致患者死亡或其他癥狀的細(xì)胞毒素，并增加其在人體腸道的 吸附能力。主要由水和食物污染引起，特別是受牛排泄物污染、感染后易并發(fā)溶血 性尿毒素綜合癥，l o 歲以下的孩童和免疫力差的老人易受感染，死亡率高【2 6 1 。 3 致病性大腸桿菌的分子檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展 傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定等檢測(cè)方法對(duì)致病性大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)的特異性不 高、靈敏度低，且操作繁瑣費(fèi)時(shí)，不能實(shí)現(xiàn)有效的檢測(cè)。因此，發(fā)展新的快速檢測(cè) 與鑒定致病性大腸桿菌的方法是及時(shí)和有效控制和預(yù)防致病性大腸桿菌引起的疾病 的前提。 福建師范大學(xué)黃文文碩士學(xué)位論文 隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，研究人員已經(jīng)創(chuàng)建不少快速、特異、敏感的致病性大 腸桿菌的檢測(cè)方法。 a 免疫學(xué)檢測(cè)方法 ( 1 ) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)( e l i s a ) 2 0 世紀(jì)8 0 年代p a d h y e 2 7 1 和p a r k 2 8 】分別用單克隆或多克隆抗體的e l i s a 檢測(cè)大 腸桿菌0 1 5 7 ：h 7 。e l i s a 方法是e n g v a l l 創(chuàng)建于1 9 7 1 年【2 9 1 。它以酶或者輔酶作為標(biāo) 記物，標(biāo)記抗原或者抗體，用酶促反應(yīng)的放大作用來(lái)顯示初級(jí)免疫學(xué)反應(yīng)，并用聚 苯乙烯微量反應(yīng)板吸附抗原或者抗體，使其固相化，從而進(jìn)行免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)。 此法選擇性好，結(jié)果判斷準(zhǔn)確，樣品處理量大。彌補(bǔ)了經(jīng)典化學(xué)方法和其他儀器測(cè) 試手段的不足。但由于e l i s a 對(duì)試劑的選擇性高，很難同時(shí)分析多種成分，對(duì)分析 分子量小的化合物或不穩(wěn)定的化合物時(shí)存在一定困難。 ( 2 ) 免疫磁性分離技術(shù) 即將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病菌發(fā)生特異性的結(jié)合， 載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液， 使致病菌不斷得到分離濃縮【3 0 1 。在英國(guó)此法主要用于牛奶中大腸桿菌0 1 5 7 ：h 7 的監(jiān) 測(cè)。在實(shí)際應(yīng)用中，此法還可以與直接鏡檢技術(shù)、p c r 技術(shù)等相結(jié)合應(yīng)用。 ( 3 ) 免疫膠體金技術(shù) 此法是2 0 世紀(jì)8 0 年代后發(fā)展起來(lái)的固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)，其基本原理是以 微孔濾膜為載體包被己知抗體抗原，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用或滲透 作用使標(biāo)本中的抗原或者抗體與質(zhì)膜上包被的抗體或抗原結(jié)合，再用膠體金結(jié)合物 標(biāo)記而達(dá)到檢測(cè)目的，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單快速、特特異敏感、不需任何儀器設(shè)備和試劑， 幾分鐘就可以用肉眼觀察到顏色對(duì)比鮮明的試驗(yàn)結(jié)果。2 0 世紀(jì)9 0 年代，楊晉川【3 u 等用0 1 5 7 大腸桿菌免疫膠體金快速診斷卡，對(duì)腹瀉患者糞便樣品中的e c o l i0 1 5 7 進(jìn)行初篩，然后再用免疫磁珠捕獲，集菌的分離和鑒定于一體，減少了工作量。 b 分子生物學(xué)檢測(cè)方法 ( 1 ) 基因芯片技術(shù) 基因芯片是指按照預(yù)定位置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬(wàn)個(gè)核酸分子所 組成的微點(diǎn)陣列。其檢測(cè)致病菌原理為選擇細(xì)菌的共有基因，( 1 6 s r d n a 、2 3 r d n a 、 e i u c ) 作為靶基因，用一對(duì)通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，再利用芯片上的探針檢測(cè)不同細(xì)菌 在該共有基因上的獨(dú)特堿基，從而區(qū)分不同的細(xì)菌。唐曉敏【3 2 1 等利用此法檢測(cè)水中 緒論 常見(jiàn)致病菌，與傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果一致性為9 5 。 ( 2 ) 多重p c r 檢測(cè)技術(shù) 也就是本實(shí)驗(yàn)中要用到的方法。 a 多重p c r 的原理及特點(diǎn) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是一種由引物介導(dǎo)的特異性 體外酶促d n a 擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)f l 了k a r ym u l l i s 等人于1 9 8 5 年首創(chuàng)【3 3 瑚】，其原理是將 待擴(kuò)增的模板d n a j j i 熱變性，由人工設(shè)計(jì)合成的兩條特異性掛聚核苷酸引物與模板 d n a 中兩條鏈特異性結(jié)合即復(fù)性，在適宜的溫度條件下，t a qd n a 聚合酶催化d n t p 沿著寡聚核苷酸引物5 3 方向相向合成互補(bǔ)的兩條新鏈。不斷復(fù)述上述過(guò)程，使得 d n a 片段以幾何級(jí)數(shù)方式擴(kuò)增與積累，經(jīng)過(guò)3 0 4 0 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物增加百萬(wàn)倍，從 而可通過(guò)電泳加以檢測(cè)。因此，p c r 技術(shù)具有敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便和易于操作 等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，使得原本診斷困難的疾病在分 子水平上得到確診【3 5 】，隨著p c r 技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，由基本的p c r 原理衍生出許多 新方法，譬如內(nèi)標(biāo)定量p c r 、實(shí)時(shí)熒光定量p c r 、多重p c r 等。 多重p c r 技術(shù)的原理與單基因p c r 相似，不過(guò)它是單基因p c r 的發(fā)展與完善， 即在同一p c r 反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，針對(duì)多個(gè)d n a 模板或者同一模板 的不同區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的過(guò)程，可一次擴(kuò)增多個(gè)靶基因，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因型鑒別或多種 病原體的同時(shí)檢出【3 6 1 。多重p c r 技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增兩條以上的靶基因片斷，出現(xiàn)假陽(yáng)性 的概率比常規(guī)p c r 小的多，有效地排除了假陽(yáng)性現(xiàn)象。單基因p c r 技術(shù)一次只能 檢測(cè)一種病原體或一個(gè)基因類型，基因分型或混合感染檢測(cè)操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力成 本較高。而多重p c r 能有效地解決單基因p c r 技術(shù)中出現(xiàn)的問(wèn)題，減少了漏診率， 提高了檢驗(yàn)效率。多重p c r 最大的優(yōu)點(diǎn)就是省時(shí)省力，能夠在和單基因p c r 相近 的時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)出多個(gè)目的的d n a 。因此，多重p c r 技術(shù)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于 各類病原的檢測(cè)與鑒別【3 7 】、遺傳疾病診斷以及基因缺失【3 引、突變和多態(tài)性分析等方 面【3 9 】尤其是對(duì)混合感染的鑒別診斷與病原微生物的毒力基因檢測(cè)更具有臨床應(yīng)用價(jià) 值【4 0 】。 b 多重p c r 技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌毒素基因的研究現(xiàn)狀 e t e c 、e p e c 、e a e c 、e h e c 的致病作用并非由單一毒力因子因子引起，而是 多因子共同作用的結(jié)果，且毒素相關(guān)基因在不同菌株中的數(shù)量和種類存在差異。p c r 技術(shù)，尤其是多重p c r 技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于e t e c 、e p e c 、e a e c 、e h e c 一個(gè) 福建師范大學(xué)黃文文碩士學(xué)位論文 菌株中多個(gè)毒素基因的檢測(cè)。 毒素基因與其致病性有著密切的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查的相關(guān) 研究。腸毒素性大腸桿菌( e n t e r o t o t x i g e n i ee s c h e r i c h i ac o l i ，e t e c ) 是動(dòng)物腹瀉的重要 病原之一，腸毒素是其致病的重要毒力因子。e t e c 產(chǎn)生的主要外毒素有不耐熱腸毒 素( h e a t l a b i l e1 ) 和耐熱腸毒素( h e a t - - s t a b l es t ) 兩種。l 1 7 有l(wèi) ti 和l t i i 之分，i i 型 i 在自然界十分罕見(jiàn)，對(duì)其研究不多，通常所指的i 是i 型；s t 根據(jù)其生物學(xué)特性及 致病性可分為s ti ( s t a ) 和s t i i ( s t b ) 兩類。s t i 溶于甲醇，引起乳鼠和乳豬腸腔積液； s t i i 不溶于甲醇，只能引起斷乳豬腸腔積涮4 1 1 。檢測(cè)腸毒素對(duì)大腸桿菌腹瀉病的診 斷有著重要意義。目前檢測(cè)e t e c 腸毒素的方法主要有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、組織培養(yǎng)、免疫學(xué) 方法( r i a 、e l i s a ) 等等，這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，具有一定的局限性。張雪寒等【4 0 建立 了多重p c r 的方法來(lái)檢；! 貝! e t e c 腸毒素基因，提高了檢測(cè)的速率。 i 芻k a u f f m a n n 在半個(gè)世紀(jì)前建立大腸桿菌血清型分類系統(tǒng)以來(lái)，血清型一直被用 作致瀉性大腸桿菌的鑒定依據(jù)及流行病學(xué)調(diào)查的標(biāo)志。而大腸桿菌的致瀉性主要取 決于是否攜有相應(yīng)的毒力因子。因此毒力因子的檢測(cè)成為鑒別致瀉性大腸桿菌的重 要依據(jù)【4 3 1 。腸出血性大腸桿菌( e n t e r o h e m o m m g i ce s c h e r i c h i ac o l i e h e c ) ，如e h e c 0 1 5 7 ：h 7 和0 1 5 7 ：h 一等引起人腹瀉、出血性腸炎( h e m o 玎h a g i co o l i t i c h c ) ， 嚴(yán)重者可并發(fā)死亡率極高的溶血性尿毒綜合征( h e m o l y t i cu r e m i cs y n d r o m e ，h u s ) 等， 曾在國(guó)外引起多次暴發(fā)流行，受到廣泛重視。研究表明：e h e c 的主要毒力因子有志 賀毒素( s h i g a t o x i n ，s t x ) 、l e e ( l o c u so f e n t e r o e y t ee f f a c e m e n t ) 毒力島、6 0 m d a 的大質(zhì) 粒等，其致病性與這些毒力因子有關(guān)。s t x 以前稱為v e r o 毒素或志賀樣毒素，目前認(rèn) 為該毒素作用于血管上皮細(xì)胞引發(fā)系統(tǒng)反應(yīng)導(dǎo)致h u s 的產(chǎn)生：s t x 主要有二種，即 s t x l 和s t x 2 ，分別由噬菌體攜帶的s t x l 和s t x 2 基因編碼：s t x 陽(yáng)性的大腸桿菌又稱為 s t e c ( s h i g at o x i n - p r o d u c i n ge c o l i ) 。l e e 編碼一系列與致腸上皮細(xì)胞粘附和抹平 ( a t t a c h i n ga n de f f a c i n g ，a e ) 效應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)，其中e a e a 基因編碼一種稱為緊密素 ( i n t i m i n ) 的菌膜蛋白，介導(dǎo)細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞膜的緊密粘附。腸致病性大腸埃希菌 ( e p e c ) 亦有l(wèi) e e 毒力島，也可引起的腸上皮細(xì)胞的a e 效應(yīng)。序列分析表明，e h e c 和e p e c 的e a e a 基因的5 端前22 0 0 堿基序列高度同源( 9 7 ) ，而3 端同源性僅為5 9 畔】可根據(jù)二者的不同設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，以p c r 鑒另u e h e c 和e p e c 的e a e a 基因。為此， 潘勁草等建立了檢測(cè)e 眥c 和e p e c 毒素基因的多重p c r 方法【4 5 】。 三、本研究的目的和意義 緒論 本研究通過(guò)對(duì)閩江流域七個(gè)取樣點(diǎn)和閩江流域福州段的解放大橋和洪山橋水域 不同季節(jié)糞大腸桿菌毒素基因的檢測(cè)以及毒素基因的分型，分析閩江流域自上游至 下游1 2 種毒素基因的數(shù)量與分布狀況，建立適合本省實(shí)際對(duì)閩江流域含毒素基因大 腸桿菌大批量和快速的檢測(cè)方法，為閩江流域病原性大腸桿菌的實(shí)地監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng) 估提供技術(shù)支撐。 四、本研究的技術(shù)路線 2 0 毫升水樣通過(guò)0 2 2 微米濾膜過(guò)濾，再將濾膜置 于m f c 培養(yǎng)基上，4 4 5 恒溫箱中培養(yǎng)1 2h l 挑取藍(lán)色單菌藩，接種到n f c 培養(yǎng)基上， l4 4 5 匣溫箱中培養(yǎng)1 2h 挑取藍(lán)色單菌藩，接種到l b 固體培養(yǎng)基 上，3 7 恒溫箱中培養(yǎng)1 2h 挑取單菌落，接種到盛有1 0 0 微升l b 液 體搖弈基的9 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，3 7 叵 溫箱中培養(yǎng)1 2 h 用槍頭吸取2 微升菌 液接入盛有1 0 0 微升 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基的9 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，3 7 恒溫箱中培養(yǎng)1 2 h 用槍頭吸取2 微升菌 液接八盛有1 0 0 微升 磷酸鹽葡萄糖胨水培 養(yǎng)基的9 6 孔細(xì)胞培 養(yǎng)板中，3 7 恒溫箱 中培養(yǎng)1 2h 福建師范大學(xué)黃文文碩士學(xué)位論文 用槍頭吸取2 微升菌；璐入盛有1 0 0 微升 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基的9 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 3 7 l 匣溫箱中培養(yǎng)1 2h 8 第一章水體中糞大腸桿菌的分離、富集及生化分析 第一章水體中糞大腸桿菌的分離、富集及生化分析 1 1 前言 水體中糞大腸桿菌的分離主要是根據(jù)選擇性b c i g i n f c 培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行初步分 離，在此選擇性培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落的初步判定為糞大腸桿菌。然后再使用乳糖 發(fā)酵培養(yǎng)基和磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基相結(jié)合的方法進(jìn)行雙重檢測(cè)。經(jīng)過(guò)乳糖發(fā)酵 培養(yǎng)基和磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基鑒定均為陽(yáng)性的菌株即確定為糞大腸桿菌。 1 2 實(shí)驗(yàn)材料 1 2 1 水樣以及水體中的大腸桿菌 糞大腸桿菌( e c o l i ) 于2 0 0 7 - - 2 0 0 8 年間采自閩江流域建陽(yáng)、順昌、沙縣、南 平、閩清、洪山、解放七個(gè)過(guò)境段的水樣中分離所得。 1 2 2 培養(yǎng)基以及常規(guī)試劑 1 2 2 1 分離糞大腸桿菌用的m f c 培養(yǎng)基 m f c 粉末 3 9 5g 5 溴一4 - 氯一3 一吲哚基p d 葡萄糖醛酸苷( b c i g ) o 0 1g 加蒸餾水至1 0 0m l ，然后將攪拌子放入盛有培養(yǎng)液的三角瓶，再將三角瓶放在 7 8 1 磁力加熱攪拌器上進(jìn)行攪拌至溶液完全溶解，再將其放入微波爐加熱至溶液純 清狀，在水中冷卻至常溫即可倒平板。 1 2 2 2 培養(yǎng)糞大腸桿菌用的l b 液體培養(yǎng)基， 蛋白胨 1 0g 酵母5g 氯化鈉 1 0 9 p i - i 7 0 7 2 加水至1 0 0 0m l ，1 2 1 滅菌1 5m i n 。 1 2 2 3 培養(yǎng)分大腸桿菌用的l b 固體培養(yǎng)基 在1 2 2 2 的配方中加入1 5 也的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，加水至1 0 0 0m l ，1 2 1 滅菌1 5 - - , 2 0 m i n 。 福建師范大學(xué)黃文文碩士學(xué)位論文 1 2 2 4 對(duì)糞大腸桿菌進(jìn)行生化鑒定的乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 蛋白胨 1 0g 酵母提取物 3g 氯化鈉 5g 乳糖 1 0g 溴甲酚紫 o 0 2g p h 6 6 7 0 加水至1 0 0 0m l ，1 2 1 滅菌1 5m i n 。 1 2 2 5 對(duì)糞大腸桿菌進(jìn)行生化鑒定的磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基 蛋白胨 7g 磷酸氫二鉀 5g 葡萄糖 5g p h 6 7 - z l 加水至1 0 0 0m l ，1 2 1 滅菌1 5m i n 。 1 2 2 6 甲基紅溶液 甲基紅 o 1g 9 5 乙醇3 0 0 m l 加水至5 0 0m l ，放入攪拌子，在7 8 1 磁力加熱攪拌器上攪拌至溶質(zhì)完全溶解。實(shí) 驗(yàn)用水為滅菌超純水。 1 2 3 主要儀器 1 ，砂心過(guò)濾器：是由無(wú)油真空泵和過(guò)濾瓶設(shè)備而組成的，整體分為漏斗式過(guò)濾 杯、中間砂心過(guò)濾頭( 燒結(jié)濾頭) 、三角集液瓶以及不銹鋼制固定夾。過(guò)濾采用的濾 膜為孔徑o 2 2l a r n 的微孔濾膜，水中的顆粒物質(zhì)和微生物的直徑都大于0 2 2l a i n ，經(jīng) 過(guò)濾后留在濾膜上。 2 ，取樣瓶； 3 ，冷凍離心機(jī)：5 4 1 5 r 型，e p p e n d o r f i 4 ，電子精密天平：p b 3 0 3 一e ； 5 ，p h 計(jì)：p h s ( p h s 2 5 a 型) ； 6 ，微量