siRNA對胃腺癌細胞株SGC-7901血管內(nèi)皮生長因子基因表達的作用.doc

siRNA對胃腺癌細胞株SGC-7901血管內(nèi)皮生長因子基因表達的作用【關鍵詞】RNA干擾；胃腫瘤；血管內(nèi)皮生長因子類；基因表達摘要目的研究siRNA對人胃腺癌細胞株SGC-7901血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因表達的影響。方法利用體外合成帶有T7啟動子的VEGF基因DNA片段，轉錄針對VEGFmRNA的siRNA，通過脂質體2000將合成的siRNA轉染入SGC-7901細胞，設置轉染VEGF錯義序列組、脂質體組、空白對照組作為對照，用MTT法檢測細胞抑制率，流式細胞儀檢測細胞周期的改變，RT-PCR檢測轉染后VEGFmRNA表達水平的變化，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中VEGF蛋白分泌量的變化。結果所設計的兩個靶位點siRNA均能有效抑制胃腺癌細胞的生長，并使細胞周期阻滯于G0/G1期；VEGFmRNA的表達也受到有效抑制，明顯減少；同時，對應的VEGF蛋白水平也顯著降低，作為陰性對照的錯義序列組siRNA則沒有出現(xiàn)這種變化。結論體外轉錄合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901細胞VEGF基因的表達。關鍵詞RNA干擾；胃腫瘤；血管內(nèi)皮生長因子類；基因表達ABSTRACTObjectiveToevaluatethegeneexpressionofVEGFbyRNAinterferenceinhumangastriccancer.MethodssiRNAstargetingVEGFmRNAwasobtainedbyinvitrotranscription，whichwastransfectedintohumangastriccancercelllinesSGC-7901withLipofectamine2000.Thenon-transfectedcells，cellstreatedwithLipofectimineandcellstreatedwithSCRweretakenascontrols.MTTwasusedtodetecttheinhibitiverateofcellgrowth.Flowcytometrywasusedtodetectthechangesofcyc-lingofthecell.TheinhibitiveeffectofsiRNAonmRNAlevelwasdetectedbyRT-PCR，thesecretionofVEGFproteininthesu-pernatantbyELISA.ResultsThesmallinterferingRNA（siRNA）targetinghumanVEGFeffectivelyinhibitedtheproliferationofgastriccancerSGC-7901.Itaffectedthedistributionofcellcycle，increasedcellpopulationinG0/G1phaseanddecreaseditinSphase.TheexpressionofVEGFmRNAwassignificantlyinhibitedinSGC-7901；otherwise，VEGFproteinnotablydecreased，buttheeffectsdidnotappearincontrolscramblesiRNA.ConclusionThelevelofVEGFgeneexpressionofSGC-7901cellscanbedeclinedbytransfectedwithsiRNA.KEYWORDSRNAinterference；gastricneoplasms；vascularendothelialgrowthfactor；geneexpression腫瘤血管的形成受多種因子的調(diào)節(jié)，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是作用最強、特異性最高的一種能刺激細胞運動和腫瘤血管生成的因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。將外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA（dsRNA）導入細胞后引起與該段RNA同源的mRNA產(chǎn)生特異性降解，其相應的基因受到抑制，這種發(fā)生在轉錄后的基因靜寂現(xiàn)象被稱為RNA干擾（RNAi）13。體內(nèi)外實驗證實，2123bp的siRNA（smallinterferenceRNA）可特異性地發(fā)揮RNAi作用4。胃癌是我國最常見的消化道腫瘤，其病死率居各種惡性腫瘤之首57。探索治療胃腺癌的新方法具有重要臨床價值。本實驗以VEGF基因為靶標，設計合成siRNA，通過脂質體轉染的方法將其轉入胃腺癌細胞株SGC-7901，研究其靜寂VEGF基因表達的效應，為臨床進一步應用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結果報告如下。1材料和方法1.1材料及其來源SGC-7901細胞購自中國協(xié)和基礎學院細胞中心。DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000、TRIzolReagent、RPMI1640購自Invitrogen公司。T7Ri-boMAXTMExpressRNAiSystem試劑盒、AccessRT-PCRIntroductorySystem購自Promega公司。四唑氮藍（MTT）購自Sigma公司。人VEGFELISAKit購自武漢博士德生物工程有限公司。1.2siRNA的制備從GenBank中獲取已知的人VEGFmRNA序列（ACCESSION:AB021221）。依據(jù)Promega公司提供的設計軟件和試劑盒設計合成siRNA序列，見表1。表1設計合成的siRNA序列（略）1.3細胞培養(yǎng)SGC-7901細胞用含體積分數(shù)0.10新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37、體積分數(shù)為0.05CO2條件下培養(yǎng)。1.4MTT法檢測細胞抑制率取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，配制6107/L濃度的細胞懸液，加到96孔板內(nèi)（Corning，美國），每孔加100L。設空白對照組、脂質體組、錯義序列組（錯義序列組SCR序列與siRNA2序列有相同的GC組成，但是和人的mRNA沒有明顯的同源性，以此作為陰性對照8）、siRNA各劑量組，每組5孔，接種24h后棄去上清，采用脂質體包裹的方式轉染siRNA。siRNA1和siRNA2兩組分別設立4個濃度，分別為100、200、400、1000nmol/L，分別定義為低、中、高、極高劑量組；siRNASCR組只設200nmol/L，加含各濃度的siRNAOpti-MEM培養(yǎng)基100L；脂質體組只加脂質體，空白對照組只加Opti-MEM培養(yǎng)基100L，置于37、含體積分數(shù)0.05CO2、無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6h，每孔補加新生牛血清10L，繼續(xù)培養(yǎng)。脂質體組Lipo-fectamineTM2000用量為每孔0.5L，按Lipo-fectamineTM2000使用說明書操作。于24h后分別加入MTT10L，振蕩15min，酶標儀讀出吸光度（A）值。計算細胞抑制率。1.5流式細胞儀觀察轉染siRNA后細胞的凋亡各組細胞以1.5105/L密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶，以1.4方法轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48h，胰酶消化離心收集并懸于PBS中，4、體積分數(shù)0.70的乙醇固定30min，用含RNase及碘化丙錠（PI）的染色液染色30min。應用流式細胞儀（EPICS-ELITE-ESP）進行細胞周期分析，每個樣本約檢測11000個細胞，計算各期細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分率。1.6RT-PCR檢測轉染細胞VEGFmRNA表達水平各組細胞以1.0105/L密度接種于6孔板，24h后棄去上清，加入siRNA1、siRNA2、siRNASCR200nmol/L，按1.4方法轉染24h后胰酶消化，離心收集。TRIzol提取各組細胞總RNA，取1g總RNA進行RT-PCR擴增。VEGF引物:上游引物:5-TCCGGGCCTCCGAAACC-3，下游引物:5-CCTGGTGAGATCTGG-3，擴增產(chǎn)物為421bp；內(nèi)參照GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）引物:上游:5-ACTGCCACCCAGAAGACT-3，下游:5-GCT-CAGTGTAGCCCAGGAT-3，擴增產(chǎn)物為292bp。將PCR擴增產(chǎn)物在20g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳觀察并照相，然后應用天能分析軟件對條帶進行掃描，檢測各組VEGFmRNA與其對應的內(nèi)參GAPDHmRNART-PCR產(chǎn)物的吸光度（A）值，計算AVEGF/AGAPDH的比值。1.7VEGF蛋白分泌量分析收取轉染24h后細胞上清用于檢測VEGF蛋白分泌量。嚴格按試劑盒說明操作，將不同濃度的VEGF標準品（7.8、15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0ng/L）以及不同組細胞上清液于Rayto2100C酶標儀中檢測450nm吸光度（A）值。讀板后儀器自動繪制標準曲線并計算出各待測樣本的VEGF含量。2結果2.1siRNA對SGC-7901細胞生長的抑制siRNA1、siRNA2的低、中、高劑量組的吸光度值與空白對照組比較，差異均有極顯著意義（F=12.264，q=9.82710.260，P<；0.01）；極高劑量組的吸光度值與脂質體組比較差異有顯著意義（q=7.231，P<；0.05）。錯義序列組、脂質體組與正常對照組比較差異無顯著性（P>；0.05）。不同劑量各組之間比較，中劑量組吸光度值最低，抑制率最高（q=10.19810.260，P<；0.001）。見表2。2.2細胞轉染siRNA后對細胞周期的影響與空白對照組比較，siRNA作用的細胞G0/G1期（細胞靜止期和DNA合成前期）比例升高，S期（DNA合成期）比例降低；錯義序列組、脂質體組與空白對照組比較無明顯差異。見表3。2.3細胞轉染siRNA后各組VEGFmRNA表達水平電泳結果顯示，空白對照組、脂質體組、錯義序列組421bp處均見清晰條帶，siRNA各組條帶均明顯減弱（見圖1），各組內(nèi)參照GAPDH條帶一致。空白對照組、脂質體組、siRNASCR組、siRNA1組、siRNA2組AVEGF/AGAPDH比值分別為0.8560.009、0.8340.020、0.8150.017、0.4560.030、0.4680.019，siRNA1、siRNA2與空白對照組、脂質體組、錯義序列組比較，差異均有極顯著意義（F=244.945，q=27.42730.560，P<；0.01），其他各組比較差異無顯著性。2.4siRNA轉染后24h各組VEGF蛋白分泌量的變化siRNA1和siRNA2組的VEGF蛋白分泌量明顯低于其他3組，差異均有顯著性（F=33.131，q=9.03612.154，P<；0.01）。見表4。表2轉染siRNA各組SGC-7901細胞24h抑制率（略）表3流式細胞儀檢測細胞周期變化（略）圖1轉染siRNA后SGC-7901細胞VEGFmRNA表達水平（略）DNAMarker；siRNA1；siRNA2；脂質體組表4各組SGC-7901細胞上清VEGF蛋白分泌量的比較（略）3討論胃腺癌是人類常見的癌癥之一，嚴重威脅人類的健康和生命，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。手術治療可以使其中一部分病人得到治愈，但更多的病人面臨錯失手術時機以及術后腫瘤復發(fā)的局面。在分子生物學迅速發(fā)展的今天，尋找一條有效的胃腺癌基因水平的治療方法具有重要的臨床價值。微血管的生成與腫瘤的生長、發(fā)展與轉移密不可分，抑制血管生成已成為近年來抗腫瘤治療研究的重要課題和熱點問題。腫瘤血管的形成受多種因子調(diào)節(jié)，其中最重要的一種是VEGF，它不僅促進血管生成，還增加血管通透性，促進轉移，改變宿主免疫功能。VEGF基因位于染色體的6p21.3，全長28kb，編碼VEGF的基因長約14kb，由8個外顯子和7個內(nèi)含子交替構成。其mRNA的不同剪接可以產(chǎn)生5種異構體，即VEGF121、145、165、189及2069。其中VEGF165是最為常見的形式，在包括胃腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中有表達10，11，在腫瘤微血管生成過程中扮演重要角色。通過抑制VEGF的表達抑制腫瘤微血管形成是當前抗腫瘤研究的熱點之一。RNAi作為生命科學領域的新技術，其應用非常廣泛，從單細胞生物一直到人，作為基因表達干預的理想方法，可應用于病毒和腫瘤的基因治療12，13。本研究以人胃腺癌細胞系SGC-7901為對象，利用分子生物學技術設計、體外轉錄針對VEGF基因的兩組siRNA，轉染體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞，遏制VEGF基因的表達，研究胃腺癌的防治方法。結果表明，siRNA對VEGF基因從mRNA轉錄到蛋白質表達均具有明顯的抑制效果，抑制了胃腺癌細胞SGC-7901的增殖，促進細胞凋亡，改變細胞周期，降低VEGFmRNA表達水平及蛋白表達水平。由此可見，在胃腺癌的抗血管生成基因治療中，VEGF可以成為有效的靶位點。本文實驗所用體外轉錄試劑盒所轉錄出來的siRNA純度高，可直接應用于體外培養(yǎng)細胞的轉染。脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合RNA形成RNA-陽離子脂質體復合物，同時又吸附在帶負電的細胞膜表面。因此，脂質體轉染法在短期應用的基因治療中具有明顯優(yōu)點?？傊疚臑镽NAi應用于腫瘤的基因治療提供了一些實驗基礎，驗證了應用RNA干擾技術可以有效抑制腫瘤相關基因的表達，從而抑制瘤細胞的增殖、防治腫瘤的基因治療思路，為下一步動物實驗奠定了基礎。當然，針對VEGF的RNAi技術臨床應用于胃腺癌治療尚需要進一步的細胞實驗以及動物實驗。參考文獻1FIREA.RNA-triggeredgenesilencingJ.TIG，1999，15（9）:358-363.2FIREA.Potentandgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegansJ.Nature，1998，391:806-811.3項鋒鋼，馬桂馨.肺癌組織中血管內(nèi)皮生長因子受體Flt1及KDR的表達及其與腫瘤轉移和預后的關系J.青島大學醫(yī)學院學報，2004，40（1）:8-10.4楊光，曹國軍，李潔，等.SiRNA抑制SARS冠狀病毒感染Ve-roE6細胞J.醫(yī)學分子生物學雜志，2004，1:270-273.5吳漢平，吳開春，李玲，等.人環(huán)氧合酶-2（hCOX-2）編碼基因的克隆及其反義核酸轉染胃癌細