醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)課ppt課件.ppt

臨床免疫學(xué)檢查,1,.,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：,乙型肝炎病毒(HBV)血清學(xué)標(biāo)志物檢查 HBsAg-乙型肝炎病毒表面抗原 HBsAb -乙型肝炎病毒表面抗體 HBeAg -乙型肝炎病毒e抗原 HBeAb -乙型肝炎病毒e抗體 HBcAb -乙型肝炎病毒核心抗體,2,實(shí)驗(yàn)要求：,掌握酶聯(lián)免疫的檢測(cè)原理 了解試劑盒的使用 掌握乙型肝炎病毒標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果的臨床意義,3,實(shí)驗(yàn)原理：,酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA） ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。 它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。 此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。,4,ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)， 抗原、抗體的反應(yīng)在固相載體聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行， 微孔對(duì)蛋白有很好的吸附作用，（試劑盒已經(jīng)包埋好相應(yīng)的抗原、抗體蛋白成分） 每加入一種試劑孵育反應(yīng)后，多余的游離反應(yīng)物可洗滌除去，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。,5,反應(yīng)過(guò)程：,包被：將已知抗體或抗原通過(guò)物理吸附結(jié)合到固相載體表面使其固相化 抗原抗體反應(yīng)：加入被檢標(biāo)本和酶標(biāo)記物，使之與固相抗體或抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定，經(jīng)洗滌除去游離的酶標(biāo)記物 酶促反應(yīng)：加入酶底物，使之發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色。,6,ELISA反應(yīng)材料：,固相載體：聚苯乙烯或聚氯乙烯 有較強(qiáng)的蛋白吸附性能 酶標(biāo)記物：標(biāo)記抗原或抗體的酶常選擇 辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 酶底物： 四甲基聯(lián)苯胺（TMB） 受酶作用后呈藍(lán)色,7,ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。 而另一方面又由于酶標(biāo)記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，使本法具有很高的敏感性。,8,反應(yīng)類型,夾心法 間接法 競(jìng)爭(zhēng)法 捕獲法 應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)的ELISA,包被抗原,抗體,酶標(biāo)記抗體,9,一)雙抗體夾心法,1.將已知抗體包被微量反應(yīng)板，和待檢抗原反應(yīng)，再加酶標(biāo)抗體和底物，根據(jù)顯色反應(yīng)對(duì)抗原進(jìn)行定性或定量。 2.是檢測(cè)抗原最常用的方法。,10,11,二）間接法,標(biāo)本中的待檢抗體與固相抗原結(jié)合后，利用酶標(biāo)記抗抗體（抗人Ig）進(jìn)行檢測(cè)。 是檢測(cè)抗體的最常用方法,12,13,三）競(jìng)爭(zhēng)法,將待檢抗原和酶標(biāo)抗原與相應(yīng)固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，標(biāo)本中抗原越多，與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原越少，與底物反應(yīng)生成的顏色越淺，根據(jù)顏色深淺可定性或定量測(cè)定。 可用于測(cè)抗原，也可用于測(cè)抗體,14,15,ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。,16,實(shí)驗(yàn)材料：,乙型肝炎病毒檢測(cè)試劑盒,17,試劑盒:,微孔反應(yīng)板（48人份） 酶結(jié)合物（6.2 mL *1瓶） 陽(yáng)性對(duì)照（1.0 mL *1瓶） 陰性對(duì)照（1.0 mL *1瓶） 洗滌液（40 mL *1瓶） 顯色劑A（8.0 mL *1瓶） 顯色劑B（8.0 mL *1瓶） 終止液（7.0 mL *1瓶） 封片（2張） 說(shuō)明書(shū)（1份）,18,定量加樣器 微量吸頭 濾紙 37恒溫水浴箱 洗板機(jī) 酶標(biāo)儀,器 材：,19,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：,取出試劑盒，室溫平衡30分鐘 配制洗滌液（1：25倍稀釋） 樣本血清制備：用真空采血管抽取空腹靜脈血5mL，靜置15分鐘后，以3500轉(zhuǎn)/分, 離心5分鐘, 分離血清備用。,20,實(shí)驗(yàn)第一步：,每盒試驗(yàn)需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照2孔， 空白對(duì)照1孔 每孔中加入待測(cè)標(biāo)本50微升 除空白孔外每孔加入酶結(jié)合物50微升 封板 置37 恒溫孵育30分鐘,21,實(shí)驗(yàn)第二步：,洗板 手工洗板：首先棄去孔內(nèi)液體，分別各孔注滿洗滌液，靜置2分鐘，甩干，重復(fù)5次后拍干。 每次洗板要甩干微孔里的殘液，避免殘余游離酶標(biāo)記物顯色干擾讀數(shù)。,22,實(shí)驗(yàn)第三步：,每孔先加入顯色劑A液1滴（50微升），再加入B液1滴（50微升），充分混勻 封板，置37水浴箱孵育15分鐘。,23,實(shí)驗(yàn)第四步：,每孔加入終止液1滴（50微升），混勻。 終止液為強(qiáng)酸溶液，使酶蛋白變性，終止酶促反應(yīng)，故加樣時(shí)應(yīng)注意。 目視讀數(shù)。,24,目視讀數(shù)：,TMB在酶的作用下呈藍(lán)色， 加入終止液（稀硫酸）后變黃， 反應(yīng)孔顏色深淺同陽(yáng)性對(duì)照孔顏色比較 顏色相同或接近判定為陽(yáng)性， 顏色相差區(qū)別大判定為陰性。,25,顯色系統(tǒng)：,在450nm波長(zhǎng)有最高吸收峰， 通過(guò)顏色變化及呈色深淺來(lái)推斷檢測(cè)對(duì)象的有（無(wú)）或含量（定量）。,26,光源,透光板,接收器,27,儀器讀數(shù)：,酶標(biāo)儀讀數(shù)：先用空白孔校零，再用波長(zhǎng)450nm（建議使用雙波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀比色，參考波長(zhǎng)630nm）讀取各孔OD值。,28,酶標(biāo)儀參數(shù)： OD值：樣本的吸光度 Cutoff值：廠家設(shè)定的此批試劑盒判定陽(yáng)性結(jié)果的最低OD值 COV：計(jì)算出的Cutoff值 S/CO：樣本吸光度/COV,儀器讀數(shù)：,29,Cutoff值計(jì)算： COV=陰性對(duì)照平均OD值2.1 標(biāo)本OD值COV為陽(yáng)性； 標(biāo)本OD值COV為陰性； 陰性對(duì)照OD值低于0.05作0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算,30,31,HBV標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的臨床意義：,32,33,患者，男，近一月乏力、腹脹，最近一周皮膚及眼睛發(fā)黃