課件：基因治療的原理.ppt

基因治療的原理,一、基因治療的策略,內(nèi)容提要,二、基因轉(zhuǎn)移技術,三、基因干預,一、基因治療的策略,（一）基因置換（gene replacement）,定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟毎?，通過定位重組，以導入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。,目的：將缺陷基因的異常序列進行橋正。,（二） 基因添加,基因添加或稱基因增補（gene augmentation）: 通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。,類型: 在有缺陷基因的細胞中導入相應的正?；?，而細胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導入正常基因的表達產(chǎn)物，補償缺陷基因的功能。 向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的。,（三）基因干預 基因干預（gene interference）: 采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結構而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。,（四）自殺基因治療 自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。 原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷毎?，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產(chǎn)生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。,（五）基因免疫治療,通過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應。,二、基因轉(zhuǎn)移技術,基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)技術,1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。 2.非病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。,1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。,(1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點,逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進入靶細胞。,逆轉(zhuǎn)錄病毒結構基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。,前病毒可以高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。,包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點,隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。,2019/9/1,15,可編輯,（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體 腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關聯(lián)。宿主細胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細胞，如神經(jīng)元等。,腺病毒載體的優(yōu)點,1.基因?qū)胄矢撸瑢θ祟惏踩?2.宿主范圍廣；,3.基因轉(zhuǎn)導與細胞分裂無關；,4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；,5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5 kb外源基因；,腺病毒載體的缺點,2.宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。,3.有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復制型腺病毒。,4.靶向性差。,1.不能整合到靶細胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細胞，導入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達時間相對較短。,2.非病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （1）脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術 脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術使用方便、成本低廉。 基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達。,（2）受體介導轉(zhuǎn)移技術,將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DNA結合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。,（3）基因直接注射技術 不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。,三、基因干預,基因干預的種類：,1.反義RNA (antisense RNA) 2.干擾RNA (RNA interference),（一）反義RNA 1. 反義RNA與基因表達調(diào)控 利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。 （2）構建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。,2.受體介導反義RNA技轉(zhuǎn)移術,基本原理：將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復合物，成為運載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復合物可以專一性地被肝細胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細胞中，反義RNA進入肝細胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。,借助受體介導DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA， 就可以實現(xiàn)受體介導的反義RNA的轉(zhuǎn)移。,（二）干擾RNA,1.RNA干擾現(xiàn)象,RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。,2.RNA干擾的機制,RNA干擾過程主要有2個步驟：,（1）小干擾性RNA（siRNA）,（2）siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。,該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。,長雙鏈RNA被細胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small int