次黃嘌呤核苷的提取及鑒定.ppt

次黃嘌呤核苷的制備及初步提取,制藥11301班第2組 成員：江呈風(fēng) 陳俊 周麗 許欣 朱贏,一背景介紹,定義 次黃嘌呤核苷（inosine）也稱肌苷。是以次黃嘌呤為堿基部分的核糖核苷的一種。次黃嘌呤核苷為白色結(jié)晶性粉末或類白色結(jié)晶性粉末，無臭；味微苦；在水中略溶，在氯仿、乙醇中不溶，在稀鹽酸或氫氧化鈉等堿溶液中易溶。肌肉中含量最多，酵母、尿液中也存在。從腺苷與亞硝酸作用或酶解脫氨后得到。紫外線最大吸收248納米。在核苷磷酸化酶的作用下主成次黃嘌呤。 分子結(jié)構(gòu),分子式：C10H12N4O5 分子量：268.23,次黃嘌呤核苷,次黃嘌呤核苷的作用,次黃嘌呤核苷的用途十分廣泛，是食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要中間體。在醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域，肌苷可以直接透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)參與人體代謝，促進(jìn)體內(nèi)能量代謝和蛋白質(zhì)合成，提高丙酮酸氧化酶活力，使低能、缺氧狀態(tài)細(xì)胞的腺三磷水平提高。在醫(yī)療上廣泛用于治療心臟病、肝病及由放射線和抗癌藥物所引起的白血球減少癥、血小板減少癥、視神經(jīng)萎縮、中心性視網(wǎng)膜炎、并能預(yù)防和解除由血防藥物引起的對(duì)心臟或肝臟的副作用；另外還是作為合成利巴韋林、阿昔洛韋等核苷類抗病毒藥物的重要中間體；在食品工業(yè)領(lǐng)域，次黃嘌呤核苷是作為呈味核苷酸肌苷酸二鈉的主要原料，與鳥苷酸二鈉混合簡稱I+G，添加到味精中即是第二代、第三代味精，具有十分廣闊的市場(chǎng)。目前，I+G需求量以每年10-20的速度增加。,二.制備工藝,方法介紹,次黃嘌呤核苷的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、菌體自溶法、發(fā)酵法。由于化學(xué)合成法需要大量有機(jī)溶劑，存在原料來源及環(huán)境污染等問題在生產(chǎn)中極少使用；菌體自溶法由于其效率太低目前也基本不用；發(fā)酵法生產(chǎn)次黃嘌呤核苷由于其產(chǎn)率高、周期短、控制容易等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為工業(yè)化生產(chǎn)次黃嘌呤核苷的重要方法。以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為發(fā)酵菌種制備核苷具有產(chǎn)量高、產(chǎn)物中副產(chǎn)物少、便于產(chǎn)物分離提取等優(yōu)點(diǎn)，因而，枯草芽孢桿菌成為核苷發(fā)酵工業(yè)最重要的生產(chǎn)菌。,制備步驟,選用枯草芽孢菌GDIR-1005為保藏菌種； 將葡萄糖磷酸氫二鉀硫酸鎂蘋果酸鈉酵母粉瓊脂水按10.20.10.22294.5的重量百分比，配制成初級(jí)菌種培養(yǎng)基并裝入茄瓶； 將步驟中的初級(jí)培養(yǎng)基接入保藏菌種，接種量為0.1，在溫度370.5條件下靜置培養(yǎng)20h2h后獲得初級(jí)種； 將步驟得到的初級(jí)菌種，放入按葡萄糖磷酸氫二鉀硫酸鎂蘋果酸鈉酵母粉水30.20.10.21.595重量百分比配制成的搖瓶培養(yǎng)基中，并在往復(fù)式搖床上培養(yǎng)，16010轉(zhuǎn)/分，溫度370.5，時(shí)間周期1012h，當(dāng)菌種鏡檢及OD等各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)標(biāo)后即獲得搖瓶液體菌種。,將葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘋果酸鈉、酵母粉、水按50.20.10.21.093.5的重量百分比配制成二級(jí)菌種培養(yǎng)基，并經(jīng)121115min1min蒸汽滅菌后泵入二級(jí)種子罐，后降溫至370.5接入搖瓶菌種，接種量為0.10.02；同時(shí)將經(jīng)過0.250.3Mpa壓縮、過濾后的無菌空氣輸入二級(jí)種子罐；此時(shí)通風(fēng)10.20.4v/V.min，pH68，壓力0.030.1MPa，培10h12h，經(jīng)菌種鏡檢及OD等各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)標(biāo)后即獲得二級(jí)菌種；,將葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘋果酸鈉、酵母粉、水按150.20.10.10.883.8的重量百分比配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)1211、15min1min蒸汽滅菌后泵入發(fā)酵罐，后降溫370.5接入二級(jí)菌種，接種量為100.5；同時(shí)在上述步驟中保壓、無菌空氣輸入的條件下，將經(jīng)1201、8min蒸汽滅菌后5070g/dL的葡萄糖液與0.20.02蘋果酸鈉同時(shí)進(jìn)行連續(xù)流加；此時(shí)通風(fēng)比為10.30.6v/V.min，pH 68，壓力0.04MPa0.1MPa，發(fā)酵50h60h進(jìn)行培養(yǎng)；當(dāng)產(chǎn)苷達(dá)到552g/L時(shí)，即獲得次黃嘌呤核苷發(fā)酵液。,三.提取含次黃嘌呤核苷的RNA,1從枯草芽孢桿菌GDIR-1005中提取含次黃嘌呤核苷RNA（Trizol法處理） Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶.Trizol在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性，因此對(duì)純化DNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生產(chǎn)十分有用。 勻漿處理 發(fā)酵菌液經(jīng)離心（3000r/min,5min）后，收集下層物，加入Trizol試液，反復(fù)吸打，用勻漿儀處理。,將勻漿液在室溫（1530）放置5min ，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min . 28,10000r/min離心15min.樣品分三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無水相，中層為。RNA主要在水相中。 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA，每使用1mlTrizol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10min 。 28,10000r/min離心10min.離心前看不見RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。 用75%乙醇洗滌RNA 沉淀，每使用1mlTrizol加入1ml75%乙醇，28不超過7500r/min離心5min，棄上清。,室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾510min,加入25ul200ul無RNase的水或0.5%SDS,用基因槍吸打幾次，5560放置10min使RNA溶解。,2.免疫親和層析法分離純化含次黃嘌呤核苷 mRNA,2.1原理：采用免疫親和層析法分離純化含次黃嘌呤核苷的mRNA(I-mRNA)。將Poly-I與BSA交聯(lián)，并用Poly-I-BSA交聯(lián)體免疫家兔，獲取抗次黃嘌呤核苷抗血清。將抗次黃嘌呤核苷抗體與蛋白A Sepharose交聯(lián)，并制備抗體親和層析柱。將小鼠肺mRNA上樣于層析柱，淋洗層析柱后，用洗脫液洗脫I-mRNA。 2.2制備次黃嘌呤核苷抗原與免疫動(dòng)物 取 0.2g次黃嘌呤核苷酸 加入碘酸鈉10ml室溫下氧化反應(yīng)40min,然后加16mol/L乙二醇0.2ml終止反應(yīng)氧化反應(yīng)。將 0.5g牛血清白蛋白（BSA）溶于10ml100mmol/l NaHCO3中(PH=9.5)，與氧化后的次黃嘌呤核苷酸混合，室溫下水平搖動(dòng)反應(yīng)12h 。每10ml反應(yīng)體積中加入四硼酸150mg ，靜置18h ，本步驟使次黃嘌呤核苷酸與BSA 的交聯(lián)變得牢固和穩(wěn)定。將次黃嘌呤核苷酸-BSA 交聯(lián)物在流水中透析8h ，然后再在10倍體積的PBS中透析12h.最終收集透析后所得次黃嘌呤核苷酸-BSA。免疫家兔，收集抗血清檢測(cè)抗體滴度和特異性。,2.3制備抗次黃嘌呤核苷抗體與蛋白A Sepharose 交聯(lián)體 將70% 體積的蛋白A Sepharose 與25% 體積的 Tris緩沖 液 ,混勻加入 5%體積的抗次黃嘌呤核苷抗體 ,室溫下緩慢搖動(dòng) 1h，然后裝柱。用 10倍體積0.2mol/l 四硼酸鈉 離心法洗柱(3000g,5min) 。再將抗次黃嘌呤核苷抗體與蛋白A Sepharose 交聯(lián)體懸于10倍體積0.2mol/l 四硼酸鈉中，然后加入固體 dime.，使之終濃度為 20nmol/l。上述混合物在室溫下?lián)u動(dòng)30min離心棄上清后， 5倍體積氨基乙醇（0.2mol/l,ph=8.0）洗交聯(lián)體一次 然后將交聯(lián)體再懸于 氨基乙醇液中室溫下緩慢搖動(dòng)2h, 以終止反應(yīng)離心后棄上清。將交聯(lián)體懸于含有0.01% Methiote的PBS 中，置4 保存.,2.4分離純化I-mRNA 取由小鼠肺組織分離的mRNA50mg,70 加熱3min迅速置冰上冷卻將變性后 重復(fù)上樣于抗次黃嘌呤核苷抗體親和柱3 次柱體積為 2ml。用10 倍體積洗柱緩沖液（1nmol/lATP,1nmol/LCTP,1nmol/LUTP,5nmol/LEDTA的PBS ，PH7.0 ）洗柱，并收集流出液。用洗脫緩沖液（1nmol/lATP,1nmol/LCTP,1nmol/LUTP,5nmol/LEDTA的PBS,PH7.5 ）洗脫結(jié)合的 I-mRNA每次200ul，洗脫總體積為 5倍柱體積。乙醇沉淀I-mRNA最后將其溶于10ul 水中。,次黃嘌呤核苷的鑒定,次黃嘌呤核苷的THz光譜 THz波是位于微波和紅外之間的電磁輻射，太赫茲時(shí)域光譜(terahertz timedomainspectroscopy，簡稱TI-hTDS)是基于飛秒超快激光技術(shù)發(fā)展的遠(yuǎn)紅外波段光譜測(cè)量新技術(shù)利用太赫茲時(shí)域(簡稱THzTDs)技術(shù)研究了次黃嘌呤核苷在03一16THz波段的光譜特性結(jié)果顯示THz渡對(duì)該堿基及核苷的結(jié)構(gòu)變化有靈敏響應(yīng)。,圖2,液相色譜檢測(cè),將樣品制成每1ml中含0.2mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，取對(duì)照溶液20l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度