高效液相色譜法測定甲硝唑的含量.ppt

藥劑綜合實驗須知,實驗項目,一 高效液相色譜法測定甲硝唑的含量 二 氨茶堿加樣回收率實驗 三 氨茶堿溶液穩(wěn)定性實驗 四 紫外分光光度計法測定氨茶堿含量 五 氨茶堿原料藥穩(wěn)定性實驗 六 五味子散劑的制備 七 SOD的含量測定 八 蘆丁的提取和鑒別,實驗要求,1課前認真預(yù)習(xí)，明確本次實驗的目的、要求、內(nèi)容、方法及步驟 2提前5-10min進入實驗室，檢查實驗所需物品是否齊全，做好實驗準備工作。 3實驗時嚴肅認真，根據(jù)實驗指導(dǎo)要求進行操作，仔細觀察和記錄，并進行獨立思考，按時完成實驗內(nèi)容和實驗報告。 4保持實驗室安靜，實驗時不得隨意走動和談笑。室內(nèi)嚴禁吸煙、不允許在實驗室內(nèi)接聽手機.,5保持實驗室清潔整齊，書包、衣帽等應(yīng)放在指定位置，不能置于實驗臺上；一切實驗用具用完后擦洗干凈，放回原處。 6愛護實驗室一切儀器設(shè)備，珍惜藥品及一切消耗用品(如紗布、拭鏡紙、載玻片等)，節(jié)約水、電。按操作規(guī)程使用顯微鏡、解剖鏡等，使用前要檢查，使用后要擦拭整理，如發(fā)現(xiàn)損壞或故障應(yīng)及時報告指導(dǎo)教師。 7實驗完畢后，值日生值日。值日工作范圍包括：關(guān)閉水、電、門、窗；檢查儀器，顯微鏡是否完好；查看水池，實驗臺，桌椅，地面是否干凈整齊；最后在值日生記錄本上登記值日情況，再交于老師簽字后方可離開。,考核辦法,實驗習(xí)慣10： 遲到1次扣1分，曠課一次扣3分，值日生必須最后走，早走者扣1分。 預(yù)習(xí)報告10%： 不能簡單抄書，要學(xué)會總結(jié)歸納。 實驗報告20： 當(dāng)堂繪圖，當(dāng)堂交報告，遲交報告者要扣分。 實驗操作30%： 要能獨立完成實驗；實驗結(jié)果必須交老師檢查；出現(xiàn)重大失誤者要扣分 實驗考試成績30： 操作10%，筆試20% 遲到、早退、缺一次實驗以上者或考試不及格者均不能得優(yōu)秀，缺兩次實驗的不能得良好，缺該課程1/3以上者或不參加實驗考試者，均沒有實驗成績。,實驗報告的書寫格式：,（1）實驗名稱 （2）實驗?zāi)康?（3）實驗內(nèi)容及步驟 （4）實驗結(jié)果,實驗一 高效液相色譜法測定 甲硝唑的含量,高效液相色譜儀的主要結(jié)構(gòu)及功能簡介,1.高壓輸液泵 2.進樣器 3.高效分離柱 4.液相色譜檢測器 5.記錄儀,(1) 高壓輸液泵,主要部件之一，壓力：150350105 Pa。 注意排氣泡：purge 流速設(shè)置,（2）進樣器,樣品液吸取方法：上下反復(fù)抽取液體，速度稍快，直到肉眼看不見氣泡為止，水平持進樣針（液體吸取數(shù)量可多余20L），注入進樣器。 進樣器存在的兩個位置：load（右上）和inject。,(2) 高效分離柱,柱體為直型不銹鋼管，C18柱標準內(nèi)徑及柱長為4.6*150mm或4.6*250mm，填料顆粒粒度5m。 色譜柱pH值范圍不同：酸性柱、堿性柱、中性柱。 安裝方向 柱溫箱：保持溫度穩(wěn)定。,(3) 液相色譜檢測器,a.紫外檢測器 b.光電二極管陣列檢測器 c.示差折光檢測器 d.熒光檢測器 e.電導(dǎo)檢測器,紫外檢測器,紫外檢測器對占物質(zhì)總數(shù)約80%的物質(zhì)（有機和部分無機物質(zhì)）均可檢測，既可測190-350 nm范圍的光吸收變化，也可向可見光范圍350-700 nm 延伸。 優(yōu)點：應(yīng)用最廣，靈敏度高，線性范圍寬。是高效液相色譜儀的標準配置。它的最重要特征是對流動相的流速（脈沖）和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫。 缺點：對無紫外吸收的組分不響應(yīng)，而對紫外吸收較大的溶劑如苯不能作流動相使用。,高效液相色譜的主要分離方法,液相色譜根據(jù)固定相性質(zhì)可分為以下幾種： 吸附色譜 (Adsorption Chromatography) 鍵合相色譜（Bonded phase chromatography） 離子交換色譜（Ion Exchanger Chromatogr.） 空間排阻色譜（Size Exclusion Chromatogr.） 親合色譜（Affinity Chromatography）,在以上五種分離方式中，反相鍵合相色譜應(yīng)用最廣，因為它采用醇水或腈水體系作流動相。純水易得廉價，它的紫外吸收極小。在純水中添加各種物質(zhì)可改變流動相選擇性。使用最廣的反相鍵合相是十八烷基鍵合相，即讓十八烷基（C18H37）鍵合到硅膠表面。這種鍵合相又稱ODS（Octadecylsilyl）鍵合相，如國外的partisil5-ODS、Zorbax-ODS、Shim-pack CLC-ODS，國產(chǎn)的YWG-C18等。,實驗?zāi)康?熟悉高效液相色譜儀主要結(jié)構(gòu)組成及功能； 了解反相色譜法的原理、優(yōu)點和應(yīng)用。 了解流動相的選擇依據(jù)及配制方法； 掌握高效液相色譜法進行定性和定量分析的基 本方法。,實驗原理,高效液相色譜法是采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。本實驗以甲硝唑為測定對象，以反相HPLC來分離檢測未知樣中甲硝唑的含量。以甲硝唑標準系列溶液的色譜峰面積對其濃度進行線性回歸，再根據(jù)樣品中甲硝唑的峰面積，由線性方程計算其濃度。,實驗器材與材料,實驗器材：高效液相色譜儀、精密天平、50ml燒杯、玻璃棒、稱量紙、10ml容量瓶、50ml容量瓶、注射器、洗瓶、EP管、濾膜。 實驗材料：甲硝唑原料、蒸餾水、HCl、乙腈、三氟乙酸、超純水。 0.1M HCl溶液配制：準確量取HCl溶液 8.3ml,用蒸餾水定容至1000ml，即得。,實驗步驟,色譜操作條件; 標準溶液配制； 標準曲線的建立； 樣品溶液的配制； 甲硝唑樣品含量測定。,色譜柱：C18柱（1504.6mm,5m）； 流動相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 檢測波長：277nm 柱溫：35 進樣量：20L,1.色譜操作條件：,2. 標準溶液配制,精密稱取在105條件下干燥至恒重的甲硝唑?qū)φ掌?0mg，置于50mL容量瓶中，用0.1M HCl溶液溶解并定容至刻度，即得濃度為0.2mg/mL的甲硝唑標準儲備液，備用。,3、標準曲線的建立,精密量取甲硝唑標準儲備液分別為0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml、1.1ml置于10ml的容量瓶中，然后用0.1M HCl溶液定容至刻度，得到濃度梯度為6g/mL、10g/mL、14g/mL、18g/mL和22g/mL的標準溶液，分別過0.22m的微孔濾膜過濾，濾液置于1.5ml的EP管中并標號，各進樣20L檢測，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸。,線性要求：,色譜峰分離度大于1.5，濃度點n5。用濃度c對峰面積A作線性回歸處理，得一直線方程，r應(yīng)大于0.999，方程的截距應(yīng)近于零。,4. 樣品溶液的配制,精密稱取甲硝唑原料藥10mg，置于50ml容量瓶中，用0.1M HCl溶液溶解并定容至刻度，搖勻，再從中取出0.7ml定容至10ml，即得甲硝唑樣品溶液。,5.甲硝唑樣品含量測