農(nóng)林學(xué)類論文-利用木糖發(fā)酵高產(chǎn)酒精菌株的誘變育種和馴化研究.doc

農(nóng)林學(xué)類論文-利用木糖發(fā)酵高產(chǎn)酒精菌株的誘變育種和馴化研究摘要:本文以熱帶假絲酵母作為出發(fā)菌株,進(jìn)行了紫外誘變和馴化,利用木糖生產(chǎn)燃料酒精,以獲得高產(chǎn)菌株。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出:紫外誘變時(shí)最佳的菌液稀釋倍數(shù)為10-4,最佳紫外照射時(shí)間為35s,通過(guò)三輪的紫外誘變育種進(jìn)行篩選,獲得酒精產(chǎn)量較高的菌株,其中突變株Y27,酒精產(chǎn)率達(dá)到了6.78%,木糖利用率為71.1%。對(duì)突變株27進(jìn)行了馴化,馴化后的菌株,酒精產(chǎn)率提高到9.6%,木糖利用率達(dá)到了90.3%。關(guān)鍵詞:熱帶假絲酵母；誘變；木糖在全球環(huán)境惡化和能源危機(jī)日益嚴(yán)峻的今天,燃料乙醇作為一種可利用的綠色能源正逐漸成為各國(guó)能源發(fā)展的戰(zhàn)略方向。采用傳統(tǒng)的以玉米、小麥等糧食為原料的發(fā)酵方法對(duì)糧食的需求量很大和成本高的缺點(diǎn)逐漸顯現(xiàn)出來(lái),己不能滿足市場(chǎng)的需要。尤其我國(guó)是個(gè)人口大國(guó),糧食安全是關(guān)系到人民生活和社會(huì)穩(wěn)定的重大問(wèn)題。所以我國(guó)在“十一五”計(jì)劃中大力提倡用非糧原料生產(chǎn)燃料乙醇1。我國(guó)以農(nóng)作物秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源十分豐富,年產(chǎn)量高達(dá)6億多噸,大部分未能被有效利用,造成資源嚴(yán)重浪費(fèi)。木質(zhì)纖維素的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素混合在一起的材料。在植物纖維素中,纖維素、半纖維素占木質(zhì)纖維素質(zhì)量的70%,纖維素和半纖維素必須經(jīng)過(guò)水解分別形成六碳糖和五碳糖后,才能被微生物利用,發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。天然半纖維素水解產(chǎn)物的85-90%是木糖。以植物纖維素原料中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,能使木質(zhì)纖維素原料的乙醇發(fā)酵的產(chǎn)量在原有的基礎(chǔ)上增加25%。因此,實(shí)現(xiàn)木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是決定植物纖維資源生產(chǎn)乙醇經(jīng)濟(jì)可行的關(guān)鍵因素。木糖過(guò)去一直被認(rèn)為不能被微生物發(fā)酵成乙醇,Karczewska2第一次提出用木糖發(fā)酵乙醇,但這個(gè)發(fā)現(xiàn)未引起足夠重視,直到1980年,wang等人提出木糖可被一些微生物發(fā)酵成乙醇。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一百多種微生物能夠利用木糖,其中酵母菌的發(fā)酵能力是最強(qiáng)的,也利于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。本文以中科院微生物所購(gòu)買的熱帶假絲酵母為出發(fā)菌株,進(jìn)行了誘變和馴化,該菌顯現(xiàn)出良好的改造及應(yīng)用前景。1.材料與方法1.1材料1.1.1菌種熱帶假絲酵母(G.tropicalis)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理中心1.1.2培養(yǎng)基木糖固體培養(yǎng)基:木糖20g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l,瓊脂20g/l。木糖液體培養(yǎng)基:木糖20g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l。酵母木糖發(fā)酵培養(yǎng)基:木糖50g/l,KH2PO42g/l,酵母粉1g/l,MgPO41g/l。酵母木糖馴化培養(yǎng)基:木糖20g/l-70g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l。1.1.3試劑和儀器滅菌器,空氣搖床,超凈工作臺(tái),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,2100分光光度計(jì),試管、平皿,三角瓶,比色皿、酵母浸粉,蛋白胨,木糖,瓊脂粉,試劑a(0.32085g高碘酸鈉溶于100mL的1%稀鹽酸溶液中),試劑b(1.11g/L的鼠李糖溶液),Nash試劑(現(xiàn)配現(xiàn)用,150g/L乙酸鈉100mL溶液中加入0.2mL乙酸和0.2mL乙酰丙酮)等。1.2試驗(yàn)方法1.2.1乙醇含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線重鉻酸鉀比色法3吸取1ml無(wú)水乙醇于100ml容量瓶中,稀釋至刻度,混勻。分別吸取此稀釋液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50ml容量瓶中,各加15.0ml重鉻酸鉀溶液,加水至刻度,混勻。此標(biāo)準(zhǔn)系列相當(dāng)于試樣中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00(V/V)的酒精。以空白標(biāo)準(zhǔn)作參比,在波長(zhǎng)600nm,用1cm比色皿測(cè)定其余各標(biāo)準(zhǔn)的吸光度。用吸光度對(duì)酒精濃度作圖,繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.2木糖含量的測(cè)定將1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)木糖母液用去離子水按不同比例稀釋成含糖量為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)木糖液。取有刻度試管,加入1ml標(biāo)準(zhǔn)糖液+1mlDNS混勻于沸水浴5min后,冷卻,用蒸餾水補(bǔ)充至10ml,于490nm處測(cè)吸光值。1.2.3生長(zhǎng)曲線的測(cè)定(1)挑取一環(huán)4下保存的菌落于200mLYEPD液體培養(yǎng)基中,在30和l00r/min的條件下培養(yǎng)18-24h進(jìn)行活化培養(yǎng),即得液體種子。(2)配制YEPD液體培養(yǎng)基3200mL,分裝于三角瓶中,每個(gè)三角瓶中準(zhǔn)確加入100mL。于115下高壓蒸汽滅菌30min。(3)將活化好的液體種子接種于每個(gè)三角瓶中,接種量為6%。(4)將三角瓶在100r/min的搖床中30下培養(yǎng)。每間隔2h取一次樣,測(cè)其600nm處的吸光值。由圖3可知,1號(hào)菌株在2h之后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在48h的時(shí)候OD值達(dá)到最大,然后進(jìn)入平穩(wěn)期。1.2.4紫外誘變方法4挑取一環(huán)對(duì)數(shù)期的原菌于9mL的蒸餾水中,振蕩均勻后吸取1mL的菌懸液于9mL的蒸餾水中,這樣依次稀釋至10-7的濃度,依次吸取10-110-7菌濃度的菌懸液100L于50個(gè)裝有完全培養(yǎng)基凝固平板中,每個(gè)稀釋度各10個(gè)平板,均勻涂布,取兩組10-110-5稀釋度平板作對(duì)照,后八組分別于紫外線下誘變20s,30s,35s,40s。將誘變后的平板和對(duì)照平板在無(wú)光條件下30培養(yǎng)2d,觀察并查菌落數(shù)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)結(jié)果得出致死率最佳稀釋度和紫外誘變時(shí)間。1.2.5木糖發(fā)酵菌的馴化為穩(wěn)定和提高篩選酵母利用木糖發(fā)酵酒精的能力,將篩選菌株接入酵母木糖馴化培養(yǎng)基馴化5培養(yǎng)數(shù)代,并逐步提高發(fā)酵液中的初始木糖含量,根據(jù)秸稈水解液中木糖含量,將木糖含量的上限控制在7%,直至菌體適應(yīng)木糖含量上限.將馴化后的菌株接種發(fā)酵,測(cè)定其酒精濃度、殘?zhí)菨舛?、pH等參數(shù),研究其發(fā)酵性能。用滅菌后的接種環(huán)挑取2環(huán)酵母菌接種至木糖濃度為20g/L的100mlYEPD液體培養(yǎng)基中,30搖床90r/min連續(xù)培養(yǎng)96h,其后以6%的接種量將菌液接入木糖濃度為30g/L的液體培養(yǎng)基中,30搖床90r/min再次連續(xù)培養(yǎng)96h,以此類推直至在木糖濃度為70g/L的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)完畢完成菌株的定向馴化。2.結(jié)果與分析2.1紫外線最佳照射劑量的選擇紫外線照射時(shí)間對(duì)熱帶假絲酵母致死率的影響見(jiàn)表1。紫外線照射對(duì)熱帶假絲酵母有明顯的致死效應(yīng),致死率隨照射劑量增大而增大。由表2可以看出,出發(fā)菌株對(duì)紫外線照射的耐受能力較強(qiáng),菌濃度分別為103,104,105時(shí),在35s時(shí)的處理?xiàng)l件下,其致死率為80.06%85.91%.為保證有較高的篩選機(jī)率,選擇35s作為紫外線照射劑量。2.2紫外線照射后突變株的選擇菌種經(jīng)過(guò)3次誘變后從其中挑選菌落直徑較大者38株,接入斜面,從中選出8株產(chǎn)酒精能力明顯高于其它突變株,其產(chǎn)酒精能力見(jiàn)表2。由表2可以看出,經(jīng)過(guò)傳代試驗(yàn),只有Y11、Y27能穩(wěn)定產(chǎn)酶且酶活力較高,其中Y27產(chǎn)酒精能力最高為6.78%。2.3馴化菌種為穩(wěn)定酵母利用木糖的能力,將菌株接入酵母木糖馴化培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)數(shù)代,并逐步提高發(fā)酵液中的初始木糖含量,馴化后菌體逐漸適應(yīng)了木糖發(fā)酵液環(huán)境,對(duì)代謝過(guò)程中的有害物質(zhì)的抵抗力逐漸增強(qiáng),木糖的利用率顯著提高,酒精產(chǎn)量提高,見(jiàn)表3。3.結(jié)論本試驗(yàn)以購(gòu)買的熱帶假絲酵母菌株為誘變出發(fā)菌株,經(jīng)過(guò)紫外線誘變及馴化篩選后,得到1株穩(wěn)定的產(chǎn)酒精生產(chǎn)菌株。熱帶假絲酵母的誘變育種最佳條件為紫外線照射時(shí)間35s,菌濃度104,酒精產(chǎn)率由出發(fā)菌3.28%提高到6.78%,木糖利用率由45.3%提高到71.1%,馴化之后突變株Y27的酒精產(chǎn)率提高到9.6%,木糖利用率達(dá)到了90.3%。但是該菌株酒精產(chǎn)率還達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)水平,應(yīng)繼續(xù)采用基因工程育種方法提高其產(chǎn)酒精水平,使之能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。參考文獻(xiàn):1KerstinSkoogandBarbelHalin一Hagerdal.EnzymeMierob.Teehnol.1988；10(2):66.2PREEZDJC.Processparametersandenvironmental.factersaffectingD-xylosefermentationbyy