中藥指紋圖譜研究生(盛習(xí)鋒).ppt

中 藥 指 紋 圖 譜,盛習(xí)鋒,第一章 中藥指紋圖譜技術(shù)與中藥質(zhì)量控制 1.1 指紋圖譜的起源與發(fā)展 現(xiàn)代指紋鑒定始于19世紀(jì)末20世紀(jì)初的范罪學(xué)和法醫(yī)學(xué)。每個(gè)人的指紋在微小的細(xì)節(jié)構(gòu)造上各有不同，可以據(jù)以鑒別每個(gè)人的特征。 指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于植物藥質(zhì)量控制，是從20世紀(jì)70年代，色譜技術(shù)的發(fā)展，人們大量采用薄層色譜（TLC）方法，將植物中化學(xué)成分展載于由各種擔(dān)體鋪成的薄層板上。根據(jù)薄層板上的斑點(diǎn)的位置、斑點(diǎn)大小、斑點(diǎn)顏色、斑點(diǎn)數(shù)目的多少進(jìn)行定性鑒別，這種薄層鑒別方法具備了指紋圖譜的特征。 20世紀(jì)70年代及80年代，出現(xiàn)薄層掃描儀，日本和我國(guó)部分學(xué)者用薄層掃描儀得到復(fù)方成藥掃描圖作為色譜指紋圖嘗試應(yīng)用于藥材及成藥分析。 20世紀(jì)80年代及90年代，高效液相技術(shù)得到發(fā)展，同時(shí)植物藥中化學(xué)成分的分離鑒定、活性成分的不斷闡明，高效液相廣泛應(yīng)用于定性、定量分析。 西方普遍采用高效液相色譜法對(duì)植物藥中已知及未知組分進(jìn)行控制，并形成相應(yīng)的規(guī)范。目前高效液相色譜法已成為當(dāng)前研究指紋圖譜的主要手段。,1.2 中藥指紋圖譜的定義 中藥指紋圖譜鑒別借用了法醫(yī)學(xué)的指紋鑒定的概念。 定義：運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)中藥化學(xué)信息以圖形（圖像）的方式進(jìn)行表征并加以描述。 由次生代謝產(chǎn)物組成的中藥提取物的色譜指紋圖譜不僅具備個(gè)體的絕對(duì)的惟一性，更強(qiáng)調(diào)的是物種特征的惟一性與同種植物中的相似性。 現(xiàn)代分析技術(shù)：包括光譜、波譜、色譜、核磁共振、X射線衍射及各種技術(shù)的聯(lián)用。 中藥化學(xué)信息：植物藥（包括來(lái)源于植物的中藥材）的提取物（包括中藥的湯藥）與化學(xué)合成藥最根本的區(qū)別是，它（即使是單味藥材）是多種化學(xué)成分的混合體。這種多種化學(xué)成分的綜合體構(gòu)成了“中藥化學(xué)信息”。由于中藥的療效由多種成分協(xié)同作用或“相克作用”，中藥中的化學(xué)信息有一定的模糊性。只有部分化學(xué)信息（包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一部分未知成分）可表征于指紋圖譜中。,表征和描述：“表征”是將中藥化學(xué)信息通過(guò)色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖）等方式進(jìn)行表達(dá)；“描述”是對(duì)指紋圖譜經(jīng)過(guò)計(jì)算、分析、比較、評(píng)價(jià)等過(guò)程，以技術(shù)參數(shù)、指紋特征等加以說(shuō)明。 中藥指紋圖譜研究須經(jīng)過(guò)制備、分析、比較、評(píng)價(jià)和校驗(yàn)等過(guò)程。 分析色譜指紋圖要求“準(zhǔn)確的辨認(rèn)”，不是“精密的測(cè)量”； 比較供試品與對(duì)照品的色譜指紋圖譜是要求“相似”，而不是“相同”； 評(píng)價(jià)色譜比較的結(jié)果，是根據(jù)色譜指紋圖譜的模糊屬性，著眼于宏觀的規(guī)律性的特征分析，即著重辨認(rèn)完整色譜的“圖貌”，而不是求索細(xì)枝末節(jié)。 分析比較的結(jié)果，是對(duì)供試品與對(duì)照品之間的差異或一致性作出評(píng)價(jià)。,1.3中藥指紋圖譜與中藥安全、有效、穩(wěn)定和可控的關(guān)系 藥物研究的主要內(nèi)容包括藥物安全性、有效性、穩(wěn)定性和可控性，四者缺一不可。 已生產(chǎn)并臨床使用的注射劑等中成藥，由于經(jīng)過(guò)了藥效學(xué)測(cè)試、臨床評(píng)價(jià)，安全性與有效性沒(méi)有，但是，現(xiàn)有的質(zhì)量控制方法的不全面性及生產(chǎn)過(guò)程中的不穩(wěn)定性導(dǎo)致各批次產(chǎn)品之間質(zhì)量出現(xiàn)差異，在臨床應(yīng)用過(guò)程中往往出現(xiàn)非正常的醫(yī)療事故。,指紋圖譜研究的直接目的有兩個(gè)方面： （1） 對(duì)中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充和提高。 現(xiàn)有中國(guó)藥典質(zhì)量控制方法及新藥申報(bào)資料7，往往以1個(gè)或個(gè)以上成分為控制指標(biāo)，在一定程度上反映了原藥材、中間體及成品的質(zhì)量，但任何單一的成分都難以準(zhǔn)確、全面地評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，不僅不能進(jìn)行真?zhèn)舞b別和優(yōu)劣判別，在很多情況下，所檢測(cè)的指標(biāo)成分（活性成分）還不具有“惟一性”，使用器材比較簡(jiǎn)單，操作比較粗糙，有時(shí)重現(xiàn)性差。 中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求要求將指紋圖譜檢測(cè)指標(biāo)及持續(xù)術(shù)要求作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)單列項(xiàng)目，是對(duì)現(xiàn)行中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的有益補(bǔ)充。 一個(gè)理想的指紋圖譜不僅能達(dá)到定性鑒別的目的，色譜圖中大部分藥譜理應(yīng)達(dá)到基線分離，對(duì)大部分成分應(yīng)可進(jìn)行定量分析。在沒(méi)有對(duì)照品的情況下，也可以已知標(biāo)準(zhǔn)品針對(duì)其他未知或無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰進(jìn)行定量。因此，中藥指紋圖譜是對(duì)現(xiàn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)近控制方法的提高。,（2） 控制中間體、成品的一致性，減少批間差異 中藥生產(chǎn)的原材料，因土壤、氣候等環(huán)境因素及采收加工的不同，實(shí)際使用時(shí)不能保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定，經(jīng)加工提取得到的中間體，每個(gè)批次在成分含量、成分組成及各成分比例方面都不能保持一致。 通過(guò)指紋圖譜研究，可以掌握每一個(gè)批次的原藥材、中間體中成分變化，進(jìn)行有指導(dǎo)的合理“勾兌“，保證成品在成分含量、組成比例上一致，減少批間差異。 無(wú)論是原藥材、中間體還是成品，因組方已固定、生產(chǎn)工藝相對(duì)恒定，藥品的安全性不可能直接通過(guò)指紋圖譜來(lái)保障，但中藥指紋圖譜可直接解決中間體、成品的批間一致性及穩(wěn)定性問(wèn)題，從而可以間接并最終保障成品的安全性和有效性。,一致性,安全性,指紋圖譜,可控性,有效性,1.4 中藥指紋圖譜建立的意義與原則 中藥指紋圖譜建立的是全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥的質(zhì)量。現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒(méi)有明確，采用中藥指紋圖譜的方式，將有效地表征中藥質(zhì)量。指紋圖譜已為國(guó)際社會(huì)所認(rèn)可，有利于中藥及產(chǎn)品進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)。 中藥指紋圖譜的建立，應(yīng)以系統(tǒng)的化學(xué)成分和藥理學(xué)研究為依托，應(yīng)體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性、重現(xiàn)性三個(gè)基本原則。,系統(tǒng)性： “系統(tǒng)性“是指指紋圖譜所反映的化學(xué)成分應(yīng)包括中藥有效部位所含大部分成妥的種類(lèi)，或指標(biāo)成分的全部。 如：中藥人參中所含的有效成分多為皂苷類(lèi)化合物，則其指紋圖譜應(yīng)盡可能多地反映其中的皂苷成分；銀杏葉中的有效成分是黃酮和銀杏內(nèi)酯類(lèi)，則其指紋圖譜可采用兩種方法針對(duì)這兩類(lèi)成分，分別分析，以達(dá)到系統(tǒng)、全面的目的。,特征性： “特征性“是指指紋圖譜中反映的化學(xué)成分信息（具體表現(xiàn)為保留時(shí)間或位移值）是具有高度選擇性的，這些信息的綜合結(jié)果，將能特征地區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，成為中藥自身的”化學(xué)條碼“。 如：北五味婦的高效液相色譜和薄層色譜指紋圖譜，不僅包括多種已知的五味子木脂素成分，而且還有很多未知成分，這些成分之間的順序、比值在一定范圍內(nèi)是固定的，并且隨藥材品種的不同而不同。通過(guò)這些整體信息，可以很好地區(qū)分北五味子與南五味子以及其它來(lái)源的五味子藥材，辨別藥材的真?zhèn)闻c優(yōu)劣。,重現(xiàn)性： “重現(xiàn)性“是指所建立的指紋圖譜，在規(guī)定的方法與條件下，不同的操作者和不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能作出相同的指紋圖譜，其誤差應(yīng)在允許的范例內(nèi)，這樣才可以保證指紋圖譜的使用具有通用性和實(shí)用性，也是作為標(biāo)準(zhǔn)方法所必備的特征之一。 實(shí)現(xiàn)指紋圖譜的重現(xiàn)性，除在樣品制備方法、分析過(guò)程、結(jié)果處理待環(huán)節(jié)規(guī)范操作外，還應(yīng)建立相應(yīng)的評(píng)價(jià)機(jī)制，對(duì)指紋圖譜進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，并公布標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。 實(shí)現(xiàn)中藥指紋圖譜的三原則，保證其標(biāo)準(zhǔn)化，做到統(tǒng)一規(guī)范，這樣才可以使中藥指紋圖譜得以推廣應(yīng)用。,1.5 國(guó)外植物藥指紋圖譜的應(yīng)用 美國(guó)FDA：允許草藥保健品申報(bào)資料可以提供色譜指紋圖； WHO：1996年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中規(guī)定，如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致。 歐共體：在草藥質(zhì)量指南中稱(chēng)，單靠測(cè)定某有效成分考察質(zhì)量的穩(wěn)定性是不夠的，因?yàn)椴菟幖捌渲苿┦且哉w為活性物質(zhì)。在歐共體藥品申請(qǐng)注冊(cè)表格中植物藥制品的“藥物專(zhuān)家報(bào)告“要求通過(guò)已知的具有治療作用的活性物質(zhì)對(duì)原料、中間體及成品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化控制。,第二章 中藥指紋圖譜研究方法學(xué) 2.1 常用指紋圖譜研究的方法與技術(shù) 研究對(duì)象的不同，指紋圖譜研究的方法與技術(shù)也不同，并都隨著現(xiàn)代科技技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展。 中藥指紋圖譜研究所采用的方法大致分為：色譜法、光譜法及其它。 色譜法包括：薄層色譜法（TLC）、液相色譜法（LC）、氣相色譜法（GC）、高效毛細(xì)管電泳法（CE）； 光譜法包括：紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、近紅外光譜法（NIR）； X射線衍射法、核磁共振法（NMR）等。,（1） X射線衍射法及核磁共振法 這兩種方法能給出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)信息，部分信息也可能與特定化學(xué)成分直接關(guān)聯(lián)。但該兩種方法所使用的儀器在國(guó)內(nèi)尚未普及，不適應(yīng)該方法的應(yīng)用與推廣。在中藥指紋圖譜研究過(guò)程中不建議采用X射線衍射法及核磁共振法。 （2） 紫外可見(jiàn)分光光度法和紅外光譜法 這兩種方法能夠給出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)信息，但所給出的信息是所有化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)信息的加和，不具備指紋特征，但可作為中藥指紋圖譜研究的輔助方法。,（3） 近紅外光譜法 此方法與紅外光譜法原理相同，但檢測(cè)時(shí)采用近紅外波長(zhǎng)，所給出的信息是所有化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的加和，通過(guò)一系列樣本的檢測(cè)（必須預(yù)先知道樣品中相關(guān)成分的含量或樣本的定性歸屬），運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)手段，建立了樣本與信息之間的數(shù)學(xué)模型。運(yùn)用該模型即可對(duì)未知樣本（如：新近購(gòu)進(jìn)的原藥材或新生產(chǎn)的成品等）進(jìn)行辨別分析（給出結(jié)果：合格與否、含量多少等）。 優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)速度快（通常為1 min）、操作簡(jiǎn)單、適宜過(guò)程控制等。 數(shù)據(jù)處理需掌握一定的化學(xué)計(jì)量學(xué)知識(shí)。 近紅外技術(shù)在農(nóng)藥、化工、農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用，方法的成熟度較高，在中藥質(zhì)量控制方面有較好的應(yīng)用前景，可大力推廣近紅外技術(shù)在原材料質(zhì)量控制中的應(yīng)用。,（4） 薄層色譜法 薄層色譜法為傳統(tǒng)的定性、定量分析方法，廣泛應(yīng)用于道地藥材的定性鑒定。 2000版中國(guó)藥典，采用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別，列于【鑒別】項(xiàng)下；采用薄層掃描法進(jìn)行含量測(cè)定，列于【含量測(cè)定】項(xiàng)下。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、分析速度快、一次分析樣品數(shù)量多。 缺點(diǎn)：重現(xiàn)性、精密度差。 可作為中藥指紋圖譜研究的借鑒與補(bǔ)充。 （5） 液相色譜法 最常用的指紋圖譜研究方法，其中高效液相色譜法（HPLC）具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。 中藥樣品中含有的成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，方法成熟，中藥指紋圖譜研究應(yīng)優(yōu)先考慮高效液相色譜法。,（6） 氣相色譜法 氣相色譜法主要用于分析氣體、揮發(fā)性和半揮發(fā)性液體以及能夠產(chǎn)生足夠蒸氣壓的固體，或者沸點(diǎn)在500以下，相對(duì)分子質(zhì)量400以下的物質(zhì)。 在中藥質(zhì)量控制中主要用于揮發(fā)油、極性較小的成分或衍生化后的可揮發(fā)性成分（如脂肪酸的酯）。 特點(diǎn)：靈敏度高、分離度好、分析速度快，定量分析的精密度優(yōu)于1%，但分析范圍只局限于低沸點(diǎn)成分是其主要不足。為中藥指紋圖譜研究的主要方法之一。,（7） 高效毛細(xì)管電泳法 高效毛細(xì)管電泳法是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型分離分析技術(shù)。適用于中藥中帶電荷的化合物（蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮、生物堿）、有機(jī)酸、單糖及一些中性分子的分離分析，可作為中藥指紋圖譜研究的補(bǔ)充。 （8） 其它 高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）等。 這些方法可在指紋圖譜中的部分色譜峰在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證的情況下，起到定性鑒別的作用。 最 常用為：TLC、HPLC、GC。,2.2 指紋圖譜研究常用的儀器與設(shè)備 2.2.1 薄層掃描儀 （1） 薄層掃描流程,點(diǎn)樣 洗脫展開(kāi) 掃描檢測(cè) 數(shù)據(jù)處理,（2） 薄層掃描儀主要部件 典型的薄層掃描儀主要由機(jī)械掃描裝置和數(shù)據(jù)處理兩部分組成，新型的薄層掃描儀配有自動(dòng)點(diǎn)樣器等。 （3） 主要廠家及儀器型號(hào) 日本島津CS系列；美國(guó)Schoeffel SD3000等。 2.2.2 高效液相色譜儀 2 2.2.3 氣相色譜儀,2.3 指紋圖譜研究對(duì)高效液相色譜儀的要求 2.3.1 柱外效應(yīng) 應(yīng)特別注意“柱外效應(yīng)”對(duì)分析結(jié)果的影響。 由于樣品分子在液體流動(dòng)相的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中小45個(gè)數(shù)量級(jí)，液體流動(dòng)相的流速也比氣相慢12個(gè)數(shù)量級(jí)，因此，樣品注入色譜柱后，在柱子以外任何死空間（如進(jìn)樣器、柱接連接管和檢測(cè)器）中，樣品分子的擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著引起色譜峰的擴(kuò)散，而使柱效降低，所以柱外死體積的影響量不能忽略。 在制造和使用高效液相色譜儀時(shí)，應(yīng)使柱外效應(yīng)減至最小,以獲得理想的分析結(jié)果。 建議：色譜柱及檢測(cè)器前死體積應(yīng)最小。,2.3.2 流動(dòng)相的脫氣 流動(dòng)相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如O2），防止在洗脫過(guò)程中，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。若在低死體積檢測(cè)池中存在氣泡，會(huì)增加基線噪聲，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成分析靈敏度下降而無(wú)法進(jìn)行分析。 溶解在流動(dòng)相中的氧氣會(huì)造成熒光猝滅，影響熒光檢測(cè)器的檢測(cè)；可導(dǎo)致樣品中的某些級(jí)組分被子氧化或使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。 常用的脫氣方法有離線式脫氣和在線式脫氣。 離線式脫氣：吹氦脫氣法、加熱回流法、抽真空脫氣法、超聲波脫氣法等。離線式脫氣會(huì)因流動(dòng)相存放時(shí)間的延長(zhǎng)以致有空氣重新溶解在流動(dòng)相中； 在線式脫氣技術(shù)是把真空脫氣裝置串接到貯液系統(tǒng)中，并結(jié)合膜過(guò)濾器，實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相在進(jìn)入輸液泵前的連續(xù)脫氣。在線式脫氣法的脫氣效果明顯優(yōu)于離線式脫氣法，并適用于多元溶劑體系。 建議：選擇在線脫氣。,2.3.3 梯度洗脫 梯度洗脫是流動(dòng)相中含有兩種或兩種以上的不同極性的溶劑，在洗脫過(guò)程中連續(xù)或間斷改變流動(dòng)相的組成，以調(diào)節(jié)它的極性，使每個(gè)流出的組分獲得最理想的分離效果，并使樣品中的所有組分可在最短的分析時(shí)間內(nèi)，以適用的分離度獲得圓滿的選擇性分離。分為高壓梯度和低壓梯度兩種方式進(jìn)行操作。 由于高壓梯度裝置中，每種溶劑是分別由泵輸送的，進(jìn)入混合器后，溶劑的可壓縮性和溶劑混合時(shí)的熱力學(xué)體積的變化，可能影響輸入到色譜柱的流動(dòng)相的組成，因此高壓梯度洗脫過(guò)程中為保證流速穩(wěn)定必須使用恒流泵，否則很難獲得重復(fù)性結(jié)果。 低壓梯度是在常壓下將多元溶劑輸至混合器中。 優(yōu)點(diǎn)是：僅需要使用一個(gè)高壓輸液泵；減小了溶劑可壓縮性的影響，并能完全消除由于溶劑混合引起的熱力學(xué)體積變化帶來(lái)的誤差。 建議：選擇低壓梯度。,2.3.4 樣品進(jìn)樣 進(jìn)樣器有以下幾種： （1） 停流進(jìn)樣裝置 為防止在帶壓操作下引起流動(dòng)相泄露，此裝置要求進(jìn)樣前壓降至常壓下再進(jìn)樣，操作繁瑣，已較少使用。 （2） 六通閥進(jìn)樣裝置 該方法重現(xiàn)性較好，較常用。 （3） 自動(dòng)進(jìn)樣器 自動(dòng)進(jìn)樣器由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制定量閥，按預(yù)先編制的注射樣品操作程序工作。取樣、進(jìn)樣、復(fù)位、樣品管路清洗和樣品盤(pán)的轉(zhuǎn)動(dòng)，全部按預(yù)定程序自動(dòng)進(jìn)行，一次可進(jìn)行幾十個(gè)或上百個(gè)樣品的分析。 自動(dòng)進(jìn)樣的樣品量可連續(xù)調(diào)節(jié)，適合大量樣品分析，節(jié)省人力。 （4） 建議：中藥指紋圖譜研究過(guò)程中，由于對(duì)樣品的進(jìn)樣量精確度要求不高，因此對(duì)進(jìn)樣器的選擇可結(jié)合研究者的實(shí)際情況，建議選擇六通閥手動(dòng)進(jìn)樣裝置。,2.3.5 色譜柱 2.3.6 柱溫 不同柱溫下同一成分在的保留時(shí)間往往發(fā)生遷移，有時(shí)還影響成分之間的分離效果。 由于中藥樣品成分的復(fù)雜性，尤其是中藥指紋圖譜技術(shù)要求色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、峰面積比值的相對(duì)恒定，對(duì)柱溫的要求應(yīng)嚴(yán)格控制，以保證分析方法的重現(xiàn)性。 建議：選擇柱溫箱。,2.3.7 檢測(cè)器 （1） 紫外線檢測(cè)器 應(yīng)用最廣，要求分析樣品必須在紫外線區(qū)有吸收。 特點(diǎn)：靈敏度高、線性范圍寬，可做成很小池體積的流通，對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不太敏感，易操作，不破壞樣品，波長(zhǎng)可以選擇及可用于梯度洗脫。 （2） 示差折光檢測(cè)器 示差折光檢測(cè)器是通用型檢測(cè)器，對(duì)在可見(jiàn)光或紫外線區(qū)無(wú)吸收的樣品一般選用。不破壞樣品，缺點(diǎn)是對(duì)溫度變化敏感，不能用低梯度洗脫，靈敏度低，不能用于痕量分析。 （3） 熒光檢測(cè)器 （4） 電化學(xué)檢測(cè)器,（5） 二極管陣列檢測(cè)器 光束通過(guò)流通池、分光系統(tǒng)后，使所有波長(zhǎng)在二級(jí)管陣列檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)器，可得三維的時(shí)間-色譜信號(hào)-吸收光譜圖。 特點(diǎn)：可進(jìn)行全波長(zhǎng)檢測(cè)，一次進(jìn)樣可以檢測(cè)到樣品中不同波長(zhǎng)下的所有組分；光譜分辨率高，可以檢測(cè)色譜峰的純度；靈敏度高，線性范圍寬，基線噪聲小。 可得到所有組分的全波長(zhǎng)掃描圖，可用于定性分析，通過(guò)對(duì)三維色譜圖的分析，可以?xún)?yōu)化檢測(cè)波長(zhǎng)。 （6） 蒸發(fā)激光光散射檢測(cè)器 通用性檢測(cè)器?？梢詸z測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品，可作于無(wú)生色團(tuán)物質(zhì)的檢測(cè)，如碳水化合物（多糖）、類(lèi)脂類(lèi)（磷脂）、皂苷、不進(jìn)行衍生化的脂肪酸和氨基酸，以及結(jié)構(gòu)不明又無(wú)標(biāo)準(zhǔn)樣品的未知物。 根據(jù)具體情況，進(jìn)行選擇。據(jù)統(tǒng)計(jì)，95%的中藥組分在可見(jiàn)光或紫外線區(qū)有吸收，可首選配置可編波長(zhǎng)紫外線檢測(cè)器（VWD）。 建議：在指紋圖譜研究過(guò)程中，由于并不完全了解樣品中所含組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，尤其是復(fù)方制劑所含組分結(jié)構(gòu)類(lèi)型不一，最大吸收波長(zhǎng)各不相同，很難一次成功地選擇好檢測(cè)波長(zhǎng)。因此最好選用二極管陣列檢測(cè)器。,第三章 中藥色譜指紋圖譜研究過(guò)程中的關(guān)鍵問(wèn)題 指紋圖譜技術(shù)在植物藥領(lǐng)域已應(yīng)用十余年，研究方法與研究思路相對(duì)成熟，已形成共識(shí)，普遍采用HPLC、TLC、GC或NIR（近紅外技術(shù)），對(duì)植物藥有效組分進(jìn)行全成分質(zhì)量控制，即指紋圖譜技術(shù)。,3.1 方案設(shè)計(jì)與思路 3.1.1 研究對(duì)象的確定 植物藥或中藥的成分可分為：蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖及衍生物、有機(jī)酸、酚類(lèi)、鞣質(zhì)、醌類(lèi)、內(nèi)酯、香豆精、黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、生物堿類(lèi)、甾體類(lèi)、萜類(lèi)、揮發(fā)油等。 當(dāng)研究某個(gè)注射劑品種的指紋圖譜時(shí)，首先必須調(diào)研相關(guān)的文獻(xiàn)、新藥申報(bào)資料（質(zhì)量部分和工藝部分）及其它研究結(jié)果， 盡可能詳盡地了解藥材、中間體及成品中所含水量成分的種類(lèi)及其理化性質(zhì)，經(jīng)綜合分析后找出成品中的藥效成妥或有效成分，作為成品或中間體指紋圖譜的研究對(duì)象，即分析檢測(cè)目標(biāo)。 如：黃芪含黃酮、皂苷及多糖；黃芪多糖注射液是以黃芪中的多糖為原料，因此對(duì)黃芪多糖注射液進(jìn)行指紋圖譜研究時(shí)應(yīng)以多糖作為研究對(duì)象；研究其中間體時(shí)也應(yīng)以多糖為研究對(duì)象；研究原藥材的指紋圖譜時(shí)應(yīng)把黃酮、皂苷及多糖作為研究對(duì)象。 復(fù)方應(yīng)以君藥、臣藥中有效成分作為主要研究對(duì)象，佐使藥中的成分可采用其它指紋圖譜方法進(jìn)行輔助、補(bǔ)充研究。,3.1.2 研究方法的選擇 主要采用色譜法。各種色譜法是互補(bǔ)的，應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的實(shí)際需要和可能以及按照不同色譜技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)而定，目的是保證方法的重現(xiàn)性和確能反映產(chǎn)品質(zhì)量的主要化學(xué)成分。 一個(gè)中藥制劑指紋圖譜應(yīng)可以同時(shí)采用兩種或更多種方法進(jìn)行研究。 指紋圖譜研究方法應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)選擇，大多數(shù)方法可采用HPLC法。通常揮發(fā)油類(lèi)采用GC。一些難以檢測(cè)或采用上述方法得不到較理想的分離效果時(shí)，可采用TLC或CE。,3.1.3 研究?jī)?nèi)容 根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局下發(fā)的中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）的規(guī)定，主要研究?jī)?nèi)容有原藥材、中間體、注射劑的指紋圖譜，涉及樣品名稱(chēng)、來(lái)源、制備、測(cè)定方法、指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)等研究項(xiàng)。,3.2 原藥材、中間體及注射劑樣品選擇與收集 中藥是天然產(chǎn)物，中藥的活性成分都是次生的代謝產(chǎn)物，本身有它內(nèi)在的不穩(wěn)定性。我國(guó)藥材品種多、產(chǎn)地廣、分散度大，造成了中藥材基源復(fù)雜，形成許多同名異物的品種，這些品種在傳統(tǒng)中醫(yī)臨床中并未加以細(xì)分，其中多數(shù)已收入中華人民共和國(guó)藥典。對(duì)于中國(guó)藥典收載的品種，從中醫(yī)的角度均可入藥，這種多基源藥材增加了色譜指紋圖譜研究的難度。 近年由于藥材量需求增大，藥材資源破壞嚴(yán)重，藥材內(nèi)在質(zhì)量下降，炮制加工的粗放造成有效成分的流失，人為因素造成了藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，不利于色譜指紋圖譜的研究與應(yīng)用。 我國(guó)藥材GAP工程已起步，將有利于中藥注射劑及其它制劑的質(zhì)量控制。,已生產(chǎn)的注射劑，因生產(chǎn)中藥材來(lái)源基本確定，在補(bǔ)充其指紋圖譜時(shí)，原藥材樣品的收集應(yīng)遵循以下原則： 藥材盡可能固定產(chǎn)地（如道地藥材）、采收期、炮制方法； 對(duì)已往生產(chǎn)使用過(guò)的藥材應(yīng)結(jié)合臨床使用情況選擇收集樣品，對(duì)工藝穩(wěn)定、療效恒定、臨床使用中很少出現(xiàn)異常醫(yī)療事故的藥材批次應(yīng)重點(diǎn)選擇； 另外還應(yīng)收集不同產(chǎn)地、不同采收期的藥材，這些藥材雖然含量高低不同，組成比例各異，但當(dāng)正常使用的藥材一旦出現(xiàn)偏差時(shí)，可通過(guò)這些批次的藥材實(shí)行合理“勾兌”。通過(guò)對(duì)指紋圖譜的研究，可以對(duì)“勾兌”過(guò)程進(jìn)行指導(dǎo)。 中間體、注射劑因其生產(chǎn)工藝已經(jīng)恒定，樣品的收集原則也應(yīng)重點(diǎn)選擇工藝穩(wěn)定、療效恒定、臨床使用中很少出現(xiàn)醫(yī)療事故的批次。 根據(jù)中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）之規(guī)定，原藥材、中間體及注射劑樣品至少應(yīng)收集10批次。不可以同一批次的樣品分散成數(shù)個(gè)批次，充當(dāng)樣品。,33 原藥材、中間體及注射劑的預(yù)處理 在指紋圖譜研究過(guò)程中，供試品（原藥材、中間體及注射劑）溶液的制備過(guò)程不是關(guān)鍵性的技術(shù)問(wèn)題，但操作煩瑣。 原藥材的供試品制備最為復(fù)雜。原藥材所含的多種組分混雜在一起，樣品制備時(shí)，應(yīng)根據(jù)所含成分和物理化學(xué)性質(zhì)，通過(guò)萃取、沉淀、吸附或通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，分離富集樣品。 如：黃芪藥材中的黃酮類(lèi)成分通過(guò)堿水萃取，皂苷類(lèi)成分通過(guò)大孔樹(shù)脂吸附；苦參中的總生物堿通過(guò)陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附與解吸附。 中間體是原藥材經(jīng)過(guò)了多步處理而得，已經(jīng)濾過(guò)了大部分成分，只保留一小 部分有效組分，樣品制備時(shí)，可針對(duì)有效成分處理，并參照原藥材的制備方法。 樣品富集后，尚需過(guò)氧化鋁預(yù)柱、C18預(yù)柱、硅膠預(yù)柱、聚酰胺預(yù)柱等，以除去色素等雜質(zhì)，避免干擾或?qū)ιV柱的損耗。 注射液中除少數(shù)品種添加助溶劑外，所含化學(xué)成分均具有較好的水溶解性能，面且研究生產(chǎn)工藝時(shí)考慮到色素、生物大分子等因素，生產(chǎn)過(guò)程中已通過(guò)微孔濾膜、脫色等操作，因此，樣品無(wú)需特殊處理，可直接分析檢測(cè)。,3.4 色譜條件選擇 指紋圖譜的色譜條件是研究檢測(cè)方法過(guò)程中最重要、關(guān)鍵性的內(nèi)容。 我們以HPLC法為例，闡述各影響因素及解決途徑。 3.4.1 流動(dòng)相 可用作流動(dòng)相的溶劑有：乙腈、甲醇、乙醇、四氫呋喃、氯仿、二氯甲烷、正已烷等。反相高效液相，以乙腈-水系統(tǒng)比較適合梯度洗脫。醇-水系統(tǒng)由于熱力學(xué)和可壓縮性因素，在梯度洗脫時(shí)易導(dǎo)致基線漂移。 在流動(dòng)相中可加入磷酸、乙酸、三乙胺、二乙胺、正丁基溴化胺、十二烷基磺酸鈉等各種改性劑，或采用磷酸-磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，以達(dá)到改善色譜峰分離程度及改善峰形的目的。 樣品中如有部分成分的極性較小，在流動(dòng)相中可加入少量異丙醇、四氫呋喃、氯仿、環(huán)糊精等，增加流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解性，一方面改善峰形，另一方面可快速洗脫。 對(duì)黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)成分可參考選擇乙膊-水-酸系統(tǒng)的流動(dòng)相；對(duì)皂苷類(lèi)成分可參考選擇乙腈-水系統(tǒng)的流動(dòng)相，生物堿類(lèi)成分可參考選擇乙腈-水-三乙胺等系統(tǒng)的流動(dòng)相。,3.4.2 檢測(cè)波長(zhǎng) 選擇有以下方法： 參照樣品的全波長(zhǎng)紫外線吸收?qǐng)D，選擇吸收峰值； 參照對(duì)照品的全波長(zhǎng)紫外線吸收?qǐng)D，選擇吸收峰值； 根據(jù)君、臣、佐、使的組方理論，在盡可能兼顧佐使藥的同時(shí)，主要選擇君、臣藥中有效成妥的及收峰值。 一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖如不能達(dá)到控制質(zhì)量的目的，可建立多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的指紋圖譜。,3.4.3 柱溫 柱溫的選擇與恒定是影響指紋圖譜技術(shù)穩(wěn)定的主要因素之一。適宜的柱溫不僅影響色譜峰的分離效果，而且柱溫發(fā)生變化將導(dǎo)致色譜峰保留時(shí)間的遷移，技術(shù)參數(shù)的設(shè)置就失去了意義，因此，柱溫必須限定。 當(dāng)色譜圖某個(gè)色譜峰因溶解度差而峰形較“鈍”時(shí)，可適當(dāng)提高柱溫（3050）；如樣品中組分在常溫或高溫下不穩(wěn)定，易發(fā)生水解、分解等變化時(shí)，可降低柱溫。,3.4.4 色譜柱 不同廠家的色譜柱由于采用的填料不同，柱效相差較大。即使流動(dòng)相條件一致，用不同填料的色譜柱重復(fù)測(cè)試時(shí)，不僅分離效果大不相同，而且保留時(shí)間的遷移程度也比較明顯。 可供選擇的色譜柱填料型號(hào)：Zorbax、Polaris、Kromasil、MataSil、Nucleosil。 由于中藥樣品的復(fù)雜性，一方面所含成分極性高低不等，另一方面部分成分結(jié)構(gòu)相似，極性相差不大，分離比較困難，因此選擇色譜柱時(shí)應(yīng)以主要成分得到分離為目的，柱效不易過(guò)高。 同時(shí)要考慮填料的穩(wěn)定性和載樣量。指紋圖譜一般選用510mC18填料柱，以4。6mm*250mm較適宜，其它特殊的色譜柱，如氨基柱、腈基柱、酸性柱、堿性柱等，可視研究對(duì)象的不同而采用。,3.4.5 進(jìn)樣量 進(jìn)樣量對(duì)指紋圖譜的結(jié)果影響不大，但加大進(jìn)樣量，可以減弱梯度洗脫時(shí)基線漂移的程度；然而色譜柱的載樣量有一定的限度，進(jìn)樣量過(guò)大，色譜柱超載，導(dǎo)致色譜峰峰寬增加或色譜峰尖鈍化，并影響柱的壽命。研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣量應(yīng)控制最高色譜峰的吸收值在1000mAU以下適合。當(dāng)?shù)榷认疵摃r(shí)，基線平穩(wěn)，進(jìn)樣量較平穩(wěn)，進(jìn)樣量應(yīng)盡量減少，一般控制最高色譜峰的吸收值在100mAU左右，不宜超過(guò)500mAU。,3.4.6 色譜條件的優(yōu)化 當(dāng)一個(gè)指紋圖譜初步建立后，尚需進(jìn)一步優(yōu)化。首先應(yīng)選擇不同操作者、不同型號(hào)的儀器進(jìn)行測(cè)試；其次應(yīng)在其它實(shí)驗(yàn)室、研究單位進(jìn)行測(cè)試。 國(guó)外一個(gè)成熟的指紋圖譜在形成法規(guī)之前，選擇世界各地有名的檢測(cè)機(jī)構(gòu)（分布于公司、醫(yī)院、大學(xué)等的獨(dú)立分析檢測(cè)室）進(jìn)行復(fù)核，以保證所建立的指紋圖譜技術(shù)穩(wěn)定、可靠。,3.5 指紋特征選擇 指紋圖譜一量建立，按照中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）規(guī)定，除提供指紋圖譜外，還應(yīng)說(shuō)明相應(yīng)的技術(shù)參數(shù)。但大量的相對(duì)保留時(shí)間、共有峰峰面積比值等技術(shù)參數(shù)，不能直觀地用來(lái)鑒定、判別。 通過(guò)大樣本的指紋圖譜的挖掘，找出隱藏其中的指紋特征，是指紋圖譜研究的直接目的。 如：歐美植物藥領(lǐng)域普遍采用以人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的峰面積作為鑒別中國(guó)人參、朝鮮人參、越南人參、西洋參及三七參的特征參數(shù)；淫羊藿中的“五指峰”是中國(guó)藥典收載品種Epimedium breuvicornum Maxim。的典型特征，根據(jù)“五指峰”特征區(qū)色譜峰的組成及相互間峰面積的比值，可定性鑒別、定量分析不同產(chǎn)地、不同提取工藝及不同品種的淫羊藿。 指紋圖譜研究的建立、分析、比較、評(píng)價(jià)和校驗(yàn)應(yīng)逐漸形成規(guī)范并取得共識(shí)。指紋圖譜的研究應(yīng)結(jié)合當(dāng)前的實(shí)際情況，同時(shí)結(jié)合生產(chǎn)工藝的篩選及藥效和臨床觀察，當(dāng)前階段宜簡(jiǎn)不宜繁、宜易不宜難，基本保證產(chǎn)品質(zhì)量的基本穩(wěn)定和一致.,第四章 中藥色譜指紋圖譜的建立與評(píng)價(jià) 按技術(shù)要求分析/抽檢成品，并與對(duì)照色譜指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)比較，判別檢測(cè)產(chǎn)品是否合格，是實(shí)施中藥指紋圖譜的最終目的。 實(shí)現(xiàn)中藥指紋國(guó)庫(kù)券譜技術(shù)革新，除了研究中藥色譜指紋圖譜，還包括對(duì)照指紋圖譜及其技術(shù)參數(shù)的建立與指紋圖譜評(píng)價(jià)等過(guò)程。,4. 1 對(duì)照指紋圖譜的建立與指紋圖譜評(píng)價(jià) 目前對(duì)中藥材、中間體及成品（主要為注射劑）的指紋圖譜研究大多采用圖譜法，經(jīng)分析檢測(cè)得到了大量的色譜數(shù)據(jù)。按中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行），需對(duì)以上色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，才能得到指紋圖譜技術(shù)參數(shù)。 如：相對(duì)保留時(shí)間、峰面積比值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等。 目前多采用人工手動(dòng)計(jì)算的方法或借助于Microsoft Excell等應(yīng)用軟件計(jì)算這些參數(shù)，繁瑣，易出差錯(cuò)，計(jì)算操作的過(guò)程了也不規(guī)范。現(xiàn)在已對(duì)計(jì)算公式及計(jì)算過(guò)程要求規(guī)范。,4.1.1 有關(guān)技術(shù)參數(shù)的計(jì)算公式 （1）相對(duì)保留時(shí)間RRT RT（i） RT（S） RT（i）各色譜峰的保留時(shí)間 RT（i）為各色譜峰的保留時(shí)間 （2）積分相對(duì)比值RA A（i） RA= A（s） A（i）為各色譜峰積分面積； A（s）為參考峰積分面積。,RRT（i）=,（3）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%,（ Xi X ）2,n - 1,RSD%=,X,Xi為樣品相應(yīng)參數(shù)；X為均值；n為樣品數(shù)量（個(gè)）。,4.1.2 中藥色譜對(duì)照指紋圖譜的建立與中藥色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)的原則 中藥指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)一旦建立，就可以作為“標(biāo)準(zhǔn)”或“對(duì)照”/“參照”，所起作用如同對(duì)照藥材，樣品的色譜圖譜可與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較。在對(duì)照指紋圖譜建立及與中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)過(guò)程中須綜合考慮以下原則。 4.1.2.1 整體性 對(duì)照指紋圖譜的建與評(píng)價(jià)應(yīng)注意指紋特征的整體性。 一個(gè)品種的對(duì)照指紋圖譜是由各個(gè)具有指紋意義的峰組成的完整圖譜構(gòu)成的，各個(gè)有指紋意義的峰（或薄層色譜的斑點(diǎn)）其位置（保留時(shí)間或比移值）、大小或高你（積分面積或峰高）、各峰之間相對(duì)的比例是指紋圖譜的綜合參數(shù)，建立和評(píng)價(jià)時(shí)從整體的角度綜合考慮，注意各有指紋意義的峰相互的依存關(guān)系。,中藥色譜指紋圖譜在一定程度上與臨床療效的穩(wěn)定性及用藥安全性方面有相關(guān)性，因此對(duì)照指紋圖譜中所有色譜峰在樣品指紋圖譜中均應(yīng)體現(xiàn)且可追溯。只有在對(duì)照指紋圖譜中所有色譜峰的穩(wěn)定體現(xiàn)，才是保證產(chǎn)品真正穩(wěn)定可控的前提。為保證色譜指紋圖譜在整體上相似，在建立對(duì)照指紋圖譜時(shí)： 應(yīng)盡可能包含所有具有指紋意義的特征峰，尤其是含量少面指紋意義顯著的色譜峰、指紋特征區(qū)、共有特征區(qū)； 排除溶劑峰及其他可以追溯的雜質(zhì)峰，供試品的制備應(yīng)與工業(yè)生產(chǎn)相似，并盡可能采用流動(dòng)相來(lái)溶解。 通過(guò)比較指紋