FISH技術在血液腫瘤中的應用.ppt

上海市第一人民醫(yī)院 Shanghai First Peoples Hospital,上海市第一人民醫(yī)院 Shanghai First Peoples Hospital,上海市第一人民醫(yī)院 血液科 Shanghai First Peoples Hospital,熒光原位雜交（FISH） 在血液腫瘤中的應用,FISH的定義,熒光原位雜交（FISH）是20世紀八十年代在細胞遺傳學、分子遺傳學和免疫學相結(jié)合的基礎上發(fā)展起來的新技術。它利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標記或先以生物素或地高辛等半抗原標記后與靶DNA進行雜交，再通過免疫細胞化學過程連接上熒光素標記物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號，從而對標本中待測核酸進行定性、定位和定量分析。,FISH技術原理,FISH技術原理,FISH技術原理,FISH技術原理,FISH技術原理,FISH技術原理,FISH技術原理,FISH的種類,間期FISH（Interphase FISH） 染色體涂染分析（Chromosome painting） 多色FISH（Multicolor-FISH） 反向涂染（Reverse painting） 比較基因組雜交（Comparative genomic hybridization）,FISH探針的種類和用途,著絲粒探針 用于檢測染色體數(shù)目異常如三體、單體等。 亞端粒探針 靠近端粒的200-300Kb為染色體特異性DNA，用于檢測 涉及端粒的隱匿性易位。 染色體臂或整條染色體涂染探針（WCP） 用于檢測染色體易位和標記染色體。 序列特異性探針 包括臂、帶和基因探針等多種，用于檢測基因缺失和重排。,血液腫瘤FISH檢測常見探針類型,雙色雙融合探針（DC，DF）,額外信號探針（ES）,分離探針（BRK）,FISH在血液腫瘤中的應用,檢測樣本可以是血液、骨髓、石蠟切片 診斷和鑒別診斷 治療和預后分層 監(jiān)測療效（微小殘留病灶檢測） 識別移植后骨髓細胞來源,一、診斷和鑒別診斷,核型分析缺點： 有絲分裂象少或缺如 染色體質(zhì)量低劣，顯帶不佳 染色體異常復雜 分子生物學檢測不足： 常見的轉(zhuǎn)錄序列來設計引物，擴增的片段長度一般在100 700bp之間 mRNA剪切方式比較特殊，假陰性結(jié)果，易造成漏診或誤診,一、診斷和鑒別診斷,FISH技術能彌補以上2種技術的不足之處 間期細胞上分析（無需中期分裂象），極大地提高了敏感性、準確性和可靠性。 對核型提示的染色體異常做進一步鑒定，從“正常核型” 中篩查隱匿的染色體畸變，成為精確的染色體分析不可缺少的手段。 FISH探針的片段相對較長，?？蛇_數(shù)百kb，甚至大于1Mb，跨越融合基因每一側(cè)多個外顯子區(qū)域，只要發(fā)生在這些區(qū)域的缺失或易位都能被檢測到，極少發(fā)生漏檢，假陰性率很低。,舉例 男性46歲患者，2003.2.24內(nèi)科急診發(fā)現(xiàn)白細胞增高（25109/L） 。 骨髓顯示粒系極度增生，紅系、巨核系以及血小板增生尚可，NAP積分49分，核型分析結(jié)果為46,XY20。 隨訪3年，其白細胞始終維持在20-30109水平。,一、診斷,2006.5.4發(fā)現(xiàn)白細胞增高至170109，血小板511109，血紅蛋白118g/dL。 骨髓象顯示早幼粒細胞占6%，中幼粒細胞占13%，核型分析未見分裂象。 BCR-ABL 210基因陰性，經(jīng)單融合FISH探針證實骨髓59%細胞BCR-ABL融合基因陽性。 接受格列衛(wèi)治療，2006.9.7復查，F(xiàn)ISH陽性細胞比例降低至7.4%，2006.10.23以后的復查結(jié)果FISH都為陰性。,一、診斷,其他常用于診斷的探針還有：PML/RARA，AML1/ETO，CBF，TEL/AML1等。 以CBF探針為例： 發(fā)生16號染色體倒位的細胞其熒光信號由2F變成1F/1R/1G。 有研究表明CBF探針對inv(16)導致的CBF-MYH11融合基因的檢出率與分子生物學的方法相當。,一、診斷,一、診斷急性淋巴細胞白血病,急性淋巴細胞白血病,一、診斷淋巴瘤,鑒別診斷，以BCR/ABL探針為例： 額外信號的BCR/ABL探針（ES） 根據(jù)熒光信號的模式不同，可以鑒別MBCR斷裂點（P210）和mBCR斷裂點(P190)。 MBCR斷裂點的細胞呈現(xiàn)1Y/2R/1G的信號模式，而mBCR斷裂點的細胞則是2Y/1R/1G的信號模式。,一、鑒別診斷,一、鑒別診斷,雙色雙融合信號探針（DF）雖不能區(qū)分MBCR和mBCR，但能檢測der（9）的部分序列缺失。 ABL和BCR基因同時缺失：1R/1G/1Y ABL基因單獨缺失： 1R/2G/1Y 。 ES探針卻無法檢測der（9）的部分序列缺失，其信號均顯示1R/1G/1Y 。,一、鑒別診斷,IgH-CCND1 男性，54歲患者，左頜下腫塊2月余 白細胞增高（21.3109/L） 骨髓涂片見到增生活躍，以成熟淋巴細胞增生為主，考慮慢性淋巴細胞白血病。 流式分析顯示CD5+CD19+細胞占86.5%，以CD19+的細胞群設門，CD23+細胞約占16.3%。 FISH檢測患者外周血，約50%的圓形細胞顯示融合信號，提示套細胞淋巴瘤可能性大。 病理證實了左頜下淋巴結(jié)非霍奇金套細胞淋巴瘤。,CLL中的應用 CLL的細胞大多處于間期，有絲分裂活性較低，細胞往往不分裂，即使分裂的細胞絕大多也是正常核型，核型分析的異常檢出率很低。 CLL的遺傳學異常被認為與存活期有關： 正常核型和13q-預后相近 +12、11q-和17p-的預后均較差,二、治療和預后分層,FISH共檢出了23例異常（76.7%）。 完成核型分析的18例中僅2例檢出異常。 正常核型的9例中，F(xiàn)ISH檢出7例異常。 未見分裂象的7例中，F(xiàn)ISH檢出5例異常。 而且這些由FISH檢出的異常克隆比例基本都在20%以上。,二、治療和預后分層,MM中的應用 MM的骨髓瘤細胞有絲分裂指數(shù)低，且由于骨髓浸潤程度不同，常規(guī)核型分析異常檢出率相對較低，檢出的異常往往是超二倍體和/或復雜核型。 MM的遺傳學異常同樣被認為與預后相關，13q14的缺失被認為是復發(fā)和預后不良的獨立危險因素，1q21擴增、p53缺失也都提示預后不良。,二、治療和預后分層,二、治療和預后分層,FISH共檢出了17例異常（56.7%）。 完成核型分析的27例中6例檢出異常（22.2%）。 正常核型的15例中，F(xiàn)ISH檢出9例異常。 未見分裂象的7例中，F(xiàn)ISH檢出3例異常。 FISH檢出的異常克隆比例大多都低于30%。 漿細胞比例低于20%，異常檢出率會大大降低。,MDS中的應用 FISH在MDS中的應用價值相對較低。 MDS的患者大多能成功完成核型分析，且被分析的分裂象數(shù)目和質(zhì)量尚可。 FISH檢測普遍采用組合探針（-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-和-Y）對五大類常見異常進行分析。,二、治療和預后分層,在我院新近完成的70例MDS患者的研究中： 核型和FISH分別檢出21例和22例異常，異常檢出率相當。 核型異常但FISH正常的6例，這6例異常均發(fā)生于探針覆蓋范圍以外區(qū)域。 核型正常而FISH異常7例，這7例的異?？寺〖毎壤蠖噍^低（10%）。 對于未見分裂像和正常核型的患者有一定的應用價值，能提高小克隆異常的檢出率。,二、治療和預后分層,三、監(jiān)測療效,對于某些不具有特定分子水平改變，或者是基因重排方式比較特殊，常規(guī)的分子生物學方法不能檢測，但其在疾病初發(fā)時有較大片段的易位、缺失、擴增或重排并能被現(xiàn)有的FISH探針檢出的患者，可在治療后進行FISH監(jiān)測。,FISH在異性別異基因造血干細胞移植后供受者嵌合比例的監(jiān)測中也有非常重要的價值。 比較未分選細胞的STR和FISH兩種技術，F(xiàn)ISH的敏感性和準確度更高，對于早期提示復發(fā)或排斥反應的臨床應用價值更大。,四、識別移植后骨髓細胞來源,小 結(jié),FISH的優(yōu)點： 簡便迅速。 雜交和檢測效率高。 敏感性和特異性高，能對間期細胞進行分析。 缺點