電化學(xué)發(fā)光免疫分析法.ppt

電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI ),免疫分析法 發(fā)光和化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光免疫分析法 電化學(xué)發(fā)光 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,免疫分析,基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段； 免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過(guò)這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。,免疫學(xué)檢測(cè)歷史演進(jìn),放射免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級(jí)以上醫(yī)院）； 酶聯(lián)免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）； 以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)（20世紀(jì)90年代開(kāi)始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期）三個(gè)階段。,免疫分析法 發(fā)光和化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光免疫分析法 電化學(xué)發(fā)光 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,發(fā)光現(xiàn)象,螢火蟲(chóng)發(fā)光,深海魚(yú)發(fā)光,發(fā)光分類,光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光。 生物發(fā)光：反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。 化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光 Chemiluminescence (CL),化學(xué)發(fā)光是指在某些特殊的化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能而處于電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)伴隨產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個(gè)關(guān)鍵步驟，即化學(xué)激發(fā)和發(fā)光。,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)能級(jí)圖,化學(xué)發(fā)光分析,根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)的發(fā)光總量來(lái)確定反應(yīng)中相應(yīng)組分含量的分析方法，稱為化學(xué)發(fā)光分析。,化學(xué)發(fā)光分析優(yōu)點(diǎn),化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度， 并且不象放射分析那樣存在強(qiáng)烈的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。,化學(xué)發(fā)光分析缺點(diǎn),雖然化學(xué)發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學(xué)分析本身的不特異性，制約了整個(gè)方法的使用。,免疫分析法 發(fā)光和化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光免疫分析法 電化學(xué)發(fā)光 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,化學(xué)發(fā)光免疫分析 chemiluminescence immunoassay（ CLIA）,CLIA是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。 這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。,化學(xué)發(fā)光免疫分析（ CLIA）分類,按分離方法不同分 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定,化學(xué)發(fā)光免疫分析（ CLIA）分類,按發(fā)光劑不同分為 發(fā)光酶免疫測(cè)定（chemiluminescence enzyme immunoasssay， CLEIA ） 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) （chemiluminescence immunoassay， CLIA ） 電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（electrochemiluminescence immunoassay， ECLI ）,免疫分析法 發(fā)光和化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光免疫分析法 電化學(xué)發(fā)光 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,電致化學(xué)發(fā)光（ECL),電致化學(xué)發(fā)光 (ECL) 是通過(guò)在電極上施加一定波形的電壓或電流信號(hào)進(jìn)行電解反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中共存組分反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象。,電致化學(xué)發(fā)光（ECL),ECL與CL的差異在于ECL是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，而CL是通過(guò)化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。因此ECL反應(yīng)易精確控制，具有靈活性。,電化學(xué)發(fā)光劑,定義：指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。 特點(diǎn) 反應(yīng)在電極進(jìn)行 化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕 電子供體為：三丙胺（TPA）,三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖,三聯(lián)吡啶釕 （ Ru(bpy)32+ ）特點(diǎn),ECL分析中采用Ru(bpy)32+作為標(biāo)記物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羥基琥珀酸胺酯（NHS） ，該衍生物具有水溶性，且高度穩(wěn)定，保證電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。,三聯(lián)吡啶釕（ Ru(bpy)32+ ）特點(diǎn),Ru(bpy)32+衍生物與免疫球蛋白結(jié)合的分子比超過(guò)20仍不會(huì)影響抗體的可溶性和免疫活性； Ru(bpy)32+分子量小，空間位阻小 ，即便小分子的核酸也能標(biāo)記，使檢測(cè)的菜單大大豐富，更重要的是為其檢測(cè)菜單的開(kāi)發(fā)前景提供了廣闊空間。,電化學(xué)發(fā)光原理圖,基態(tài),激發(fā)態(tài),不穩(wěn)定,免疫分析法 發(fā)光和化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光免疫分析法 電化學(xué)發(fā)光 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,電化學(xué)發(fā)光免疫分析 (Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI),ECLI是繼EIA、RIA、FIA、時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（TRFIA）之后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)； ECLI是電化學(xué)發(fā)光(ECL)和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物； ECLI是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)之一。,ECLI原理,在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+標(biāo)記Ab，通過(guò)Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的Ag或Ab進(jìn)行定量/定性。,ECLIA檢測(cè)流程圖一（雙抗體夾心的形成）,ECLIA檢測(cè)流程圖二 （生物素與親和素結(jié)合）,ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖,ECLIA檢測(cè)流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）,ECLIA檢測(cè)流程圖四 （電極充電啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)）,ECLIA檢測(cè)流程圖五 （撤消磁場(chǎng)沖洗磁珠）,方法評(píng)價(jià),采用的固相載體是帶有磁性的直徑約2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特點(diǎn)是反應(yīng)面積比板式擴(kuò)大2030倍，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應(yīng)時(shí)類似液相，反應(yīng)速度大大加快；,方法評(píng)價(jià),“鏈霉親和素-生物素”是是具有很強(qiáng)的非共價(jià)相互作用的一對(duì)化合物，具有牢固而特異的結(jié)合，應(yīng)用此放大系統(tǒng)，使檢測(cè)的靈敏度大大提高；,方法評(píng)價(jià),利用氧化鐵的磁性，使用電磁場(chǎng)分離結(jié)合態(tài)和游離態(tài)，方便迅速，實(shí)現(xiàn)了精確的全自動(dòng)化； 標(biāo)記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時(shí)間更長(zhǎng)、強(qiáng)度更高、易于測(cè)定。,ELIA優(yōu)越性,高度敏感，可達(dá)pgml或pmol水平； 特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，CV5。 測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。 試劑穩(wěn)定，無(wú)毒害，無(wú)污染，有效