GB5009.96-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中赭曲霉毒素A的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9 .9 62 0 1 6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中赭曲霉毒素A的測定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.9 62 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T2 3 5 0 22 0 0 9 食品中赭曲霉毒素A的測定 免疫親和層析凈化高效液相色譜法 、G B/T2 5 2 2 02 0 1 0 糧油檢驗 糧食中赭曲霉毒素A的測定 高效液相色譜法和熒光光度法 、G B/T5 0 0 9.9 62 0 0 3 谷物和大豆中赭曲霉毒素A的測定 、S N/T1 7 4 62 0 0 6 進出口大豆、 油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的檢驗方法 、S N/T1 9 4 02 0 0 7 進出口食品中赭曲霉毒素A的測定方法 和S N0 2 1 11 9 9 3 出口糧谷中棕曲霉毒素A的檢驗方法 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T2 3 5 0 22 0 0 9相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中赭曲霉毒素A的測定” ; 增加了第三法免疫親和層析凈化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和第四法酶聯(lián)免疫吸附測定法; 增加了適用范圍并優(yōu)化了提取方法; 刪除了免疫親和柱層析凈化熒光光度法。G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中赭曲霉毒素A的測定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中赭曲霉毒素A的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于谷物、 油料及其制品、 酒類、 醬油、 醋、 醬及醬制品、 葡萄干、 胡椒粒/粉中赭曲霉毒素A的測定, 第二法適用于玉米、 稻谷( 糙米) 、 小麥、 小麥粉、 大豆、 咖啡、 葡萄酒中赭曲霉毒素A的測定, 第三法適用于玉米、 小麥等糧食產(chǎn)品、 辣椒及其制品等、 啤酒等酒類、 醬油等產(chǎn)品、 生咖啡、 熟咖啡中赭曲霉毒素A的測定, 第四法適用于玉米、 小麥、 大麥、 大米、 大豆及其制品中赭曲霉毒素A的測定,第五法適用于小麥、 玉米、 大豆中赭曲霉毒素A的測定。第一法 免疫親和層析凈化液相色譜法2 原理用提取液提取試樣中的赭曲霉毒素A, 經(jīng)免疫親和柱凈化后, 采用高效液相色譜結(jié)合熒光檢測器測定赭曲霉毒素A的含量, 外標(biāo)法定量。3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。3.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。3.1.3 冰乙酸(C2H4O2) : 色譜純。3.1.4 氯化鈉(N a C l) 。3.1.5 聚乙二醇HO CH2(CH2OCH2)nCH2OH 。3.1.6 吐溫2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。3.1.7 碳酸氫鈉(N a HC O3) 。3.1.8 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。3.1.9 濃鹽酸(HC l) 。3.1.1 0 氮氣(N2) : 純度9 9.9%。3.2 試劑配制3.2.1 提取液: 甲醇-水(8 0+2 0) 。G B5 0 0 9.9 62 0 1 62 3.2.2 提取液: 稱取1 5 0.0g氯化鈉、2 0.0g碳酸氫鈉溶于約9 5 0m L水中, 加水定容至1L。3.2.3 提取液: 乙腈-水(6 0+4 0) 。3.2.4 沖洗液: 稱取2 5.0g氯化鈉、5.0g碳酸氫鈉溶于約9 5 0m L水中, 加水定容至1L。3.2.5 真菌毒素清洗緩沖液: 稱取2 5.0g氯化鈉、5.0g碳酸氫鈉溶于水中, 加入0.1m L吐溫2 0, 用水稀釋至1L。3.2.6 磷酸鹽緩沖液: 稱取8 .0g氯化鈉、1 .2g磷酸氫鈉、0 .2g磷酸二氫鉀、0 .2g氯化鉀溶解于約9 9 0m L水中, 用濃鹽酸調(diào)節(jié)p H至7.0, 用水稀釋至1L。3.2.7 碳酸氫鈉溶液(1 0g/L) : 稱取1.0g碳酸氫鈉, 用水溶解并稀釋到1 0 0m L。3.2.8 淋洗緩沖液: 在10 0 0m L磷酸鹽緩沖液中加入1.0m L吐溫2 0。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品赭曲霉毒素A(C2 0H1 8C l NO6,C A S號:3 0 3 - 4 7 - 9) , 純度9 9%?；蚪?jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液: 準(zhǔn)確稱取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品, 用甲醇-乙腈(5 0+5 0) 溶解, 配成0.1m g/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 在-2 0保存, 可使用3個月。3.4.2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液: 根據(jù)使用需要, 準(zhǔn)確移取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液(3 .4 .1) , 用流動相稀釋, 分別配成相當(dāng)于1n g/m L、5n g/m L、1 0n g/m L、2 0n g/m L、5 0n g/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作液,4保存, 可使用7d。3.5 材料3.5.1 赭曲霉毒素A免疫親和柱: 柱規(guī)格1m L或3m L, 柱容量1 0 0n g, 或等效柱。3.5.2 定量濾紙。3.5.3 玻璃纖維濾紙: 直徑1 1c m, 孔徑1.5m, 無熒光特性。4 儀器和設(shè)備4.1 分析天平: 感量0.0 0 1g。4.2 高效液相色譜儀, 配熒光檢測器。4.3 高速均質(zhì)器:1 20 0 0r/m i n。4.4 玻璃注射器:1 0m L。4.5 試驗篩: 孔徑1mm。4.6 空氣壓力泵。4.7 超聲波發(fā)生器: 功率1 8 0W。4.8 氮吹儀。4.9 離心機:1 00 0 0r/m i n。4.1 0 渦旋混合器。4.1 1 往復(fù)式搖床:2 5 0r/m i n。4.1 2 p H計: 精度為0.0 1。G B5 0 0 9.9 62 0 1 63 5 分析步驟5.1 試樣制備與提取5.1.1 谷物、 油料及其制品5.1.1.1 糧食和糧食制品顆粒狀樣品需全部粉碎通過試驗篩( 孔徑1mm) , 混勻后備用。提取方法1: 稱取試樣2 5.0g( 精確到0.1g) , 加入1 0 0 m L提取液, 高速均質(zhì)3 m i n或振蕩3 0m i n, 定量濾紙過濾, 移取4m L濾液加入2 6m L磷酸鹽緩沖液混合均勻, 混勻后于80 0 0r/m i n離心5m i n, 上清作為濾液A備用。提取方法2: 稱取試樣2 5.0g( 精確到0.1g) , 加入1 0 0 m L提取液, 高速均質(zhì)3 m i n或振蕩3 0m i n, 定量濾紙過濾, 移取1 0m L濾液加入4 0m L磷酸鹽緩沖液稀釋至5 0m L, 混合均勻, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾, 濾液B收集于干凈容器中, 備用。5.1.1.2 食用植物油準(zhǔn)確稱取試樣5 .0g( 精確到0 .1g) , 加入1g氯化鈉及2 5m L提取液, 振蕩3 0m i n, 于60 0 0r/m i n離心1 0m i n, 移取1 5m L上層提取液, 加入3 0m L磷酸鹽緩沖液混合均勻, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾, 濾液C收集于干凈容器中, 備用。5.1.1.3 大豆、 油菜籽準(zhǔn)確稱取試樣5 0.0g( 精確到0.1g) ( 大豆需要磨細且粒度2mm) 于均質(zhì)器配置的攪拌杯中, 加入5g氯化鈉及1 0 0m L甲醇( 適用于油菜籽) 或1 0 0m L提取液, 以均質(zhì)器高速均質(zhì)提取1m i n。定量濾紙過濾, 移取1 0m L濾液并加入4 0m L水稀釋, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 濾液D收集于干凈容器中, 備用。5.1.2 酒類取脫氣酒類試樣( 含二氧化碳的酒類樣品使用前先置于4冰箱冷藏3 0m i n, 過濾或超聲脫氣) 或其他不含二氧化碳的酒類試樣2 0.0g( 精確到0.1g) , 置于2 5m L容量瓶中, 加提取液定容至刻度, 混勻, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 濾液E收集于干凈容器中, 備用。5.1.3 醬油、 醋、 醬及醬制品稱取2 5.0g( 精確到0.1g) 混勻的試樣, 加提取液定容至5 0m L, 超聲提取5m i n。定量濾紙過濾, 移取1 0m L濾液于5 0m L容量瓶中, 加水定容至刻度, 混勻, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 濾液F收集于干凈容器中, 備用。5.1.4 葡萄干稱取粉碎試樣5 0.0g( 精確到0.1g) 于均質(zhì)器配置的攪拌杯中, 加入1 0 0m L碳酸氫鈉溶液, 將攪拌杯置于均質(zhì)器上, 以2 20 0 0r/m i n高速均質(zhì)提取1m i n。定量濾紙過濾, 準(zhǔn)確移取1 0m L濾液并加入4 0m L淋洗緩沖液稀釋, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 濾液G收集于干凈容器中, 備用。5.1.5 胡椒粒/粉稱取粉碎試樣2 5.0g( 精確到0.1g) 于均質(zhì)器配置的攪拌杯中, 加入1 0 0m L碳酸氫鈉溶液, 將攪拌G B5 0 0 9.9 62 0 1 64 杯置于均質(zhì)器上, 以2 20 0 0r/m i n高速均質(zhì)提取1m i n。將提取物置離心杯中以40 0 0r/m i n離心1 5m i n。移取2 0m L濾液并加入3 0m L淋洗緩沖液稀釋, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 濾液H收集于干凈容器中, 備用。5.2 試樣凈化5.2.1 谷物、 油料及其制品5.2.1.1 糧食和糧食制品將免疫親和柱連接于玻璃注射器下, 準(zhǔn)確移取提取方法1中全部濾液A或提取方法2中2 0m L濾液B, 注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接, 調(diào)節(jié)壓力, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 直至空氣進入親和柱中, 依次用1 0m L真菌毒素清洗緩沖液、1 0m L水先后淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。5.2.1.2 食用植物油將免疫親和柱連接于玻璃注射器下, 準(zhǔn)確移取3 0m L濾液C, 注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接, 調(diào)節(jié)壓力, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 直至空氣進入親和柱中,依次用1 0m L真菌毒素清洗緩沖液、1 0m L水先后淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。5.2.1.3 大豆、 油菜籽將免疫親和柱連接于玻璃注射器下, 準(zhǔn)確移取1 0m L濾液D, 注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接, 調(diào)節(jié)壓力, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 直至空氣進入親和柱中,依次用1 0m L真菌毒素清洗緩沖液、1 0m L水先后淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。5.2.2 酒類將免疫親和柱連接于玻璃注射器下, 準(zhǔn)確移取1 0m L濾液E, 注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接, 調(diào)節(jié)壓力, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 直至空氣進入親和柱中,依次用1 0m L沖洗液(3.2.4) 、1 0m L水先后淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液,抽干小柱。5.2.3 醬油、 醋、 醬及醬制品將免疫親和柱連接于玻璃注射器下, 準(zhǔn)確移取1 0m L濾液F, 注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接, 調(diào)節(jié)壓力, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 直至空氣進入親和柱中,依次用1 0m L真菌毒素清洗緩沖液、1 0m L水先后淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。5.2.4 葡萄干將免疫親和柱連接于玻璃注射器下, 準(zhǔn)確移取1 0m L濾液G, 注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接, 調(diào)節(jié)壓力, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 直至空氣進入親和柱中,依次用1 0m L淋洗緩沖液、1 0m L水先后淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。G B5 0 0 9.9 62 0 1 65 5.2.5 胡椒粒/粉將免疫親和柱連接于玻璃注射器下, 準(zhǔn)確移取1 0m L濾液H, 注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接, 調(diào)節(jié)壓力, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 直至空氣進入親和柱中,依次用1 0m L淋洗緩沖液、1 0m L水先后淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。5.3 洗脫準(zhǔn)確加入1.5m L甲醇或免疫親和柱廠家推薦的洗脫液進行洗脫, 流速約為1滴/s, 收集全部洗脫液于干凈的玻璃試管中,4 5下氮氣吹干。用流動相溶解殘渣并定容到5 0 0L, 供檢測用。5.4 試樣測定5.4.1 高效液相色譜參考條件高效液相色譜參考條件列出如下:a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長1 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 粒徑5m, 或等效柱;b) 流動相: 乙腈-水-冰乙酸(9 6+1 0 2+2) ;c) 流速:1.0m L/m i n;d) 柱溫:3 5;e) 進樣量:5 0L;f) 檢測波長: 激發(fā)波長3 3 3n m, 發(fā)射波長4 6 0n m。5.4.2 色譜測定在5.4.1色譜條件下, 將赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按濃度從低到高依次注入高效液相色譜儀, 待儀器條件穩(wěn)定后, 以目標(biāo)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)(x軸) , 目標(biāo)物質(zhì)的峰面積積為縱坐標(biāo)(y軸) , 對各個數(shù)據(jù)點進行最小二乘線性擬合, 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按式(1) 計算:y=a x+b(1) 式中:y 目標(biāo)物質(zhì)的峰面積比;a 回歸曲線的斜率;x 目標(biāo)物質(zhì)的濃度;b 回歸曲線的截距。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi), 如果樣品含量超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍, 需稀釋后再測定。5.4.3 空白試驗不稱取試樣按5.1、5.2和5.3的步驟做空白試驗。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測組分的物質(zhì)。6 分析結(jié)果的表述試樣中赭曲霉毒素A的含量按式(2) 計算:X=V10 0 0m10 0 0f(2)G B5 0 0 9.9 62 0 1 66 式中:X 試樣中赭曲霉毒素A的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ; 試樣測定液中赭曲霉毒素A的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 試樣測定液最終定容體積, 單位為毫升(m L) ;10 0 0 單位換算常數(shù);m 試樣的質(zhì)量, 單位為克(g) ;f 稀釋倍數(shù)。計算結(jié)果時需扣除空白值, 檢測結(jié)果以兩次測定值的算數(shù)平均值表示, 計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。7 精密度樣品中赭曲霉毒素A含量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 5%。8 其他糧食和糧食制品、 食用植物油、 大豆、 油菜籽、 葡萄干、 胡椒粒 /粉的檢出限和定量限分別為0 .3g/k g和1g/k g。酒類的檢出限和定量限分別為0.1g/k g和0.3g/k g。醬油、 醋、 醬及醬制品的檢出限和定量限分別為0.5g/k g和1.5g/k g。第二法 離子交換固相萃取柱凈化高效液相色譜法9 原理用提取液提取試樣中的赭曲霉毒素A, 經(jīng)離子交換固相萃取柱凈化后, 采用高效液相色譜儀結(jié)合熒光檢測器測定赭曲霉毒素A的含量, 外標(biāo)法定量。1 0 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。1 0.1 試劑1 0.1.1 乙腈(CH3C N) : 色譜純。1 0.1.2 甲醇(CH3OH) : 色譜純。1 0.1.3 冰乙酸(C2H4O2) 。1 0.1.4 石油醚: 分析純,6 09 0。1 0.1.5 甲酸(CH2O2) 。1 0.1.6 三氯甲烷(CHC l3) 。1 0.1.7 碳酸氫鈉(N a HC O3) 。1 0.1.8 磷酸(H3P O4) 。1 0.1.9 氫氧化鉀(KOH) 。G B5 0 0 9.9 62 0 1 67 1 0.2 試劑配制1 0.2.1 氫氧化鉀溶液(0.1m o l/L) : 稱取氫氧化鉀0.5 6g, 溶于1 0 0m L水。1 0.2.2 磷酸水溶液(0.1m o l/L) : 移取0.6 8m L磷酸, 溶于1 0 0m L水。1 0.2.3 碳酸氫鈉溶液(3 0g/L) : 稱取碳酸氫鈉3 0.0g, 溶于10 0 0m L水。1 0.2.4 乙酸水溶液(2%) : 移取2 0m L冰乙酸, 溶于9 8 0m L水。1 0.2.5 提取液: 氫氧化鉀溶液(0.1m o l/L)-甲醇-水(2+6 0+3 8) 。1 0.2.6 淋洗液: 氫氧化鉀溶液(0.1m o l/L)-乙腈-水(3+5 0+4 7) 。1 0.2.7 洗脫液: 甲醇-乙腈-甲酸-水(4 0+5 0+5+5) 。1 0.2.8 甲醇-碳酸氫鈉溶液(3 0g/L) (5 0+5 0) 。1 0.2.9 乙腈- 2%乙酸水溶液(5 0+5 0) 。1 0.3 標(biāo)準(zhǔn)品赭曲霉毒素A(C2 0H1 8C l NO6,C A S號:3 0 3 - 4 7 - 9) , 純度9 9%?；蚪?jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。1 0.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 0.4.1 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液: 準(zhǔn)確稱取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品, 用甲醇溶解配制成1 0 0g/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 于-2 0避光保存。1 0.4.2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液: 準(zhǔn)確移取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 0.4.1) , 用甲醇溶解配制成1g/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 于4避光保存。1 0.4.3 赭曲霉毒素A系列標(biāo)準(zhǔn)工作液: 準(zhǔn)確移取適量赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 0.4.2) , 用甲醇稀釋配制成1n g/m L、2.5n g/m L、5n g/m L、1 0n g/m L、5 0n g/m L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。1 1 儀器和設(shè)備1 1.1 高效液相色譜儀配熒光檢測器。1 1.2 分析天平: 感量0.0 1g和0.0 0 01g。1 1.3 固相萃取柱: 高分子聚合物基質(zhì)陰離子交換固相萃取柱, 柱規(guī)格3m L, 柱床重量2 0 0m g, 或等效柱。1 1.4 氮吹儀。1 1.5 渦旋振蕩器。1 1.6 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。1 1.7 高速萬能粉碎機:1 20 0 0r/m i n。1 1.8 2 0目篩。1 1.9 有機濾膜: 孔徑0.4 5m。1 1.1 0 快速定性濾紙。1 2 分析步驟1 2.1 試樣制備玉米、 稻谷( 糙米) 、 小麥、 小麥粉、 大豆及咖啡豆等用高速萬能粉碎機將樣品粉碎, 過2 0目篩后混勻G B5 0 0 9.9 62 0 1 68 備用。1 2.2 試樣提取1 2.2.1 玉米稱取試樣1 0.0g( 精確至0.0 1g) , 加入5 0m L三氯甲烷和5m L0.1m o l/L的磷酸水溶液, 于渦旋振蕩器上振蕩提取3m i n 5m i n, 提取液用定性濾紙過濾, 取1 0m L下層濾液至1 0 0m L平底燒瓶中,于4 0水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干, 用2 0m L石油醚溶解殘渣后加入1 0m L提取液, 再用渦旋振蕩器振蕩提取3m i n5m i n, 靜置分層后取下層溶液, 用濾紙過濾, 取5m L濾液進行固相萃取凈化。1 2.2.2 稻谷( 糙米) 、 小麥、 小麥粉、 大豆稱取試樣1 0.0g( 精確至0.0 1g) , 加入5 0m L提取液, 于渦旋振蕩器上振蕩提取3m i n5m i n, 用定性濾紙過濾, 取1 0m L濾液至1 0 0m L平底燒瓶中, 加入2 0m L石油醚, 渦旋振蕩器振蕩提取3m i n 5m i n, 靜置分層后取下層溶液, 用濾紙過濾, 取5m L濾液進行固相萃取凈化。1 2.2.3 咖啡稱取試樣2.5g( 精確至0.0 1g) 于5 0m L聚丙烯錐形試管( 帶蓋) 中, 加入2 5m L甲醇-碳酸氫鈉溶液于渦旋振蕩器振蕩提取3m i n 5m i n,40 0 0r/m i n離心1 0m i n后上清液用濾紙過濾, 取1 0m L濾液進行固相萃取凈化。1 2.2.4 葡萄酒移取試樣1 0.0g( 精確至0.0 1g) 于燒杯中, 加入6m L提取液, 混勻, 再用氫氧化鉀溶液調(diào)p H至9.01 0.0進行固相萃取凈化。1 2.3 試樣凈化分別用5m L甲醇、3m L提取液活化固相萃取柱, 然后將1 2.2制備的樣品提取液加入固相萃取柱,調(diào)節(jié)流速以1滴/s 2滴/s的速度通過柱子, 分別依次用3m L淋洗液、3m L水、3m L甲醇淋洗柱, 抽干, 用5m L洗脫液洗脫, 收集洗脫液于玻璃試管中, 于4 5下氮氣吹干, 用1m L乙腈- 2%乙酸水溶液溶解, 過濾后備用。1 2.4 高效液相色譜參考條件高效液相色譜參考條件列出如下:a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長1 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 粒徑5m, 或等效柱;b) 柱溫:3 0;c) 進樣量:1 0L;d) 流速:1m L/m i n;e) 檢測波長: 激發(fā)波長:3 3 3n m, 發(fā)射波長:4 6 0n m;f) 流動相及洗脫條件:流動相:A: 冰乙酸-水(2+1 0 0) ,B: 乙腈;等度洗脫條件:A - B(5 0+5 0) ; 梯度洗脫條件: 見表1。G B5 0 0 9.9 62 0 1 69 表1 流動相及梯度洗脫條件時間/m i n流動相A/%流動相B/%08 81 228 81 21 08 02 01 27 03 01 95 05 03 05 05 03 101 0 03 901 0 04 08 81 24 58 81 2 注:咖啡和葡萄酒樣品測定采用梯度洗脫程序, 其他樣品采用等度洗脫程序。1 2.5 色譜測定在1 2.4的色譜條件下, 將赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按濃度從低到高依次注入高效液相色譜儀;待儀器條件穩(wěn)定后, 以目標(biāo)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)(x軸) , 目標(biāo)物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)(y軸) , 對各個數(shù)據(jù)點進行最小二乘線性擬合, 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按式(3) 計算:y=a x+b(3) 式中:y 目標(biāo)物質(zhì)的峰面積;a 回歸曲線的斜率;x 目標(biāo)物質(zhì)的濃度;b 回歸曲線的截距。注:咖啡和葡萄酒樣品測定采用梯度洗脫程序, 其他樣品采用等度洗脫程序。1 3 分析結(jié)果的表述試樣中赭曲霉毒素A的含量按式(4) 計算:X=V10 0 0m10 0 0f(4) 式中:X 試樣中赭曲霉毒素A的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ; 待測試樣液中赭曲霉毒素A的含量, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 試樣測定液最終定容體積, 單位為毫升(m L) ;10 0 0 單位換算系數(shù);m 試樣的質(zhì)量, 單位為克(g) ;f 稀釋倍數(shù)。計算結(jié)果( 需扣除空白值) 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示, 結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 0 1 4 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 5%。1 5 其他葡萄酒檢出限為0 .1g/L, 定量限為0 .3 3g/L; 其他樣品檢出限為1 .0g/k g, 定量限為3 .3g/k g。第三法 免疫親和層析凈化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1 6 原理用提取液提取試樣中的赭曲霉毒素A, 經(jīng)免疫親和柱凈化后, 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定赭曲霉毒素A的含量, 外標(biāo)法定量。1 7 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。1 7.1 試劑1 7.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。1 7.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。1 7.1.3 甲酸(HC OOH) : 色譜純。1 7.1.4 甲酸銨(HC OONH4) : 色譜純。1 7.1.5 氯化鈉(N a C l) 。1 7.1.6 碳酸氫鈉(N a HC O3) 。1 7.2 試劑配制1 7.2.1 提取液: 甲醇-水(8 0+2 0) 。1 7.2.2 提取液: 稱取1 5 0.0g氯化鈉、2 0.0g碳酸氫鈉溶于約9 5 0m L水中, 加水定容至1L。1 7.2.3 提取液: 甲醇- 3%碳酸氫鈉溶液(5 0+5 0) 。1 7.2.4 3%碳酸氫鈉溶液: 稱取3 0.0g碳酸氫鈉, 加水定容至1L。1 7.2.5 苯基硅烷固相萃取柱淋洗液1: 甲醇- 3%碳酸氫鈉溶液(2 5+7 5) 。1 7.2.6 苯基硅烷固相萃取柱淋洗液2: 稱取1 0.0g碳酸氫鈉, 加水定容至1L。1 7.2.7 苯基硅烷固相萃取柱洗脫液: 甲醇-水(7+9 3) 。1 7.2.8 磷酸鹽緩沖液(P B S) : 稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀, 用水溶解, 調(diào)節(jié)p H至7.0, 加水定容至1L。1 7.2.9 定容溶液: 乙腈-水(3 5+6 5) 。1 7.3 標(biāo)準(zhǔn)品赭曲霉毒素A(C2 0H1 8C l NO6,C A S號:3 0 3 - 4 7 - 9) , 純度9 9%?；蚪?jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 1 書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。1 7.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 7.4.1 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液: 準(zhǔn)確稱取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品, 用甲醇-乙腈(1+1) 溶解后配成0.1m g/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 于-2 0避光保存, 可使用3個月。1 7.4.2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液: 根據(jù)使用需要移取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 7.4.1) , 用空白樣品提取液稀釋, 分別配成相當(dāng)于1n g/m L、5n g/m L、1 0n g/m L、2 0n g/m L、5 0n g/m L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。1 7.5 材料1 7.5.1 赭曲霉毒素A免疫親和柱: 柱規(guī)格1m L, 柱容量1 0 0n g, 或等效柱。1 7.5.2 苯基硅烷固相萃取柱: 柱床重量5 0 0m g, 柱規(guī)格3m L, 或等效柱。1 7.5.3 玻璃纖維濾紙: 直徑1 1c m, 孔徑1.5m, 無熒光特性。1 7.5.4 定性濾紙。1 7.5.5 微孔濾膜: 直徑0.2 0m。1 8 儀器和設(shè)備1 8.1 分析天平: 感量0.0 0 01g和0.0 1g。1 8.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀: 配有電噴霧電離源。1 8.3 固相萃取裝置。1 8.4 渦旋混合器。1 8.5 恒溫振蕩器。1 8.6 氮吹儀。1 8.7 高速均質(zhì)器:1 20 0 0r/m i n。1 8.8 離心機:1 20 0 0r/m i n。1 8.9 樣品粉碎機。1 9 分析步驟1 9.1 試樣制備與提取1 9.1.1 玉米、 小麥等糧食產(chǎn)品將樣品充分粉碎混勻, 稱取試樣2 5.0g, 加入5g氯化鈉, 用提取液定容至1 0 0m L, 混勻, 高速均質(zhì)提取2m i n。定性濾紙過濾, 移取1 0m L濾液于5 0m L容量瓶中, 加水定容至刻度, 混勻, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 收集濾液A于干凈的容器中。1 9.1.2 辣椒及其制品等將樣品充分粉碎混勻, 稱取試樣2 5.0g, 加入5g氯化鈉, 用提取液定容至1 0 0m L, 混勻, 高速均質(zhì)提取2m i n。定性濾紙過濾, 移取1 0m L濾液于5 0m L容量瓶中, 加水定容至刻度, 混勻, 用玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 收集濾液B于干凈的容器中。1 9.1.3 啤酒等酒類取脫氣酒類試樣( 含二氧化碳的酒類樣品使用前先置于4冰箱冷藏3 0m i n, 過濾或超聲脫氣) 或G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 2 其他不含二氧化碳的酒類試樣2 5.0g, 加5 0m L提取液, 混勻, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 收集濾液C于干凈的容器中。1 9.1.4 醬油等產(chǎn)品稱取2 5.0g混勻試樣, 用提取液定容至5 0m L, 超聲提取5m i n。定性濾紙過濾, 移取1 0m L濾液于5 0m L容量瓶中, 加水定容至刻度, 混勻, 經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清, 收集濾液D于干凈的容器中。1 9.1.5 生咖啡將樣品充分粉碎混勻, 稱取試樣2 5.0g, 加入2 0 0m L提取液, 均質(zhì)提取5m i n。80 0 0r/m i n離心5m i n, 上清液先后經(jīng)定性濾紙和玻璃纖維濾紙過濾。移取4m L濾液于1 0 0m L容量瓶中, 加P B S緩沖液定容至刻度, 混勻, 得提取液E。1 9.1.6 熟咖啡將樣品充分粉碎混勻, 稱取試樣1 5.0g, 加入1 5 0m L提取液, 輕搖3 0m i n。玻璃纖維濾紙過濾,移取約5 0m L濾液,4下45 0 0r/m i n離心1 5m i n。取1 0m L上清液, 加入1 0m L3%碳酸氫鈉溶液得提取液F。1 9.2 試樣凈化1 9.2.1 玉米、 小麥等糧食產(chǎn)品準(zhǔn)確移取1 0m L濾液A, 注入玻璃注射器中, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 依次用1 0m LP B S緩沖液、1 0m L水淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。1 9.2.2 辣椒及其制品等準(zhǔn)確移取1 0m L濾液B, 注入玻璃注射器中, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 依次用1 0m LP B S緩沖液、1 0m L水淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。1 9.2.3 啤酒等酒類準(zhǔn)確移取1 0m L濾液C, 注入玻璃注射器中, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 依次用1 0m LP B S緩沖液、1 0m L水淋洗免疫親和柱, 流速為1滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。1 9.2.4 醬油等產(chǎn)品準(zhǔn)確移取1 0m L濾液D, 注入玻璃注射器中, 使溶液以約1滴/s的流速通過免疫親和柱, 依次用1 0m LP B S緩沖液、1 0m L水淋洗免疫親和柱, 流速為l滴/s 2滴/s, 棄去全部流出液, 抽干小柱。1 9.2.5 生咖啡分次將提取液E全部注入玻璃注射器中, 使溶液以2m L/m i n 3m L/m i n的流速全部通過免疫親和柱, 保持柱體濕潤, 用1 0m L水淋洗免疫親和柱, 流速3m L/m i n, 棄去全部流出液, 吹干小柱3 0s。1 9.2.6 熟咖啡1 9.2.6.1 苯基硅烷固相萃取柱凈化: 預(yù)先依次用1 5m L甲醇、5m L3%碳酸氫鈉溶液活化苯基硅烷固G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 3 相萃取柱, 保持柱體濕潤。將提取液F以5 m L/m i n的流速通過苯基硅烷固相萃取柱, 再依次用1 0m L苯基硅烷固相萃取柱淋洗液1和5m L苯基硅烷固相萃取柱淋洗液2淋洗, 吹干萃取柱后用1 0m L苯基硅烷固相萃取柱洗脫液進行洗脫, 得洗脫液G。1 9.2.6.2 免疫親和柱凈化: 用3 0m LP B S緩沖液稀釋洗脫液G, 以5m L/m i n的流速通過免疫親和柱, 保持柱體濕潤, 用1 0m L水淋洗后吹干小柱。1 9.3 洗脫以5m L甲醇分兩次洗脫, 流速為2m L/m i n 3m L/m i n, 收集全部洗脫液于干凈的玻璃試管中,于4 0下氮氣吹干, 以1m L乙腈-水溶液(3 56 5, 體積比) 復(fù)溶, 微孔濾膜過濾后, 玉米、 小麥、 辣椒及其制品等稀釋1倍, 啤酒等酒類濃縮5倍, 醬油等產(chǎn)品等倍稀釋后, 供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。1 9.4 儀器參考條件1 9.4.1 高效液相色譜參考條件高效液相色譜參考條件列出如下:a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長1 0 0mm, 內(nèi)徑2.1mm, 粒徑3m, 或等效柱;b) 柱溫:3 0;c) 進樣量:2 0L;d) 流速:0.2m L/m i n;e) 流動相及梯度洗脫條件見表2。流動相A液: 水溶液( 含有0.1%甲酸,5mm o l/L甲酸銨) ;流動相B液:9 5%乙腈水溶液( 含有0.1%甲酸,5mm o l/L甲酸銨) 。表2 流動相及梯度洗脫條件時間/m i n流動相A/%流動相B/%06 53 5259 5759 57.16 53 51 56 53 51 9.4.2 質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件列出如下:a) 離子化方式: 電噴霧電離;b) 離子源噴霧電壓:50 0 0V;c) 離子源溫度:6 0 0;d) 霧化氣、 氣簾氣、 碰撞氣、 輔助加熱氣均為高純氮氣, 使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求;e) 掃描方式: 負離子掃描;f) 檢測方式: 多反應(yīng)監(jiān)測, 參數(shù)詳見表3。G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 4 表3 多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)毒素母離子/(m/z)子離子/(m/z)采集時間/m s去簇電壓/V碰撞能量/V赭曲霉毒素A4 0 2.13 5 8.1a2 0 0-8 2-2 81 6 6.92 0 0-6 8-4 7 a為定量子離子。1 9.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定試樣中赭曲霉毒素A色譜峰的保留時間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰保留時間相比較, 變化范圍應(yīng)在 2 .5 %之內(nèi)。每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn), 至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子, 而且同一檢測批次,對同一種化合物而言, 樣品中目標(biāo)化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液比, 其允許偏差不超過表4規(guī)定的范圍。表4 定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度5 0%2 0%5 0%1 0%2 0%1 0%允許相對偏差2 0%2 5%3 0%5 0% 目標(biāo)化合物以保留時間和兩對離子( 特征離子對/定量離子對) 所對應(yīng)的色譜峰面積相對豐度進行定性, 同時要求測試樣品中目標(biāo)化合物的兩對離子對應(yīng)的色譜峰面積比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的面積比一致。儀器最佳工作條件下, 用系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進樣, 以峰面積為縱坐標(biāo), 以基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進行定量, 樣品溶液中赭曲霉毒素A的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。1 9.6 空白試驗除不稱取試樣外, 均按上述步驟同時完成空白試驗。2 0 分析結(jié)果的表述赭曲霉毒素A的含量按式(5) 計算:X=V10 0 0m10 0 0f(5) 式中:X 試樣中赭曲霉毒素A的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ; 試樣測定液中赭曲霉毒素A的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 試樣測定液最終定容體積, 單位為毫升(m L) ;10 0 0 單位換算常數(shù);m 試樣的質(zhì)量, 單位為克(g) ;f 稀釋倍數(shù)。計算結(jié)果時需扣除空白值, 計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 5 2 1 精密度在重復(fù)性測定條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不超過其算術(shù)平均值的1 5%。2 2 其他玉米、 小麥等糧食產(chǎn)品、 辣椒及其制品等檢出限和定量限分別為1.0g/k g和3.0g/k g, 啤酒等的檢出限和定量限分別為1.0g/k g和3.0g/k g, 熟咖啡、 醬油等的檢出限和定量限分別為0.5g/k g和1.5g/k g。第四法 酶聯(lián)免疫吸附測定法2 3 原理用甲醇-水提取試樣中的赭曲霉毒素A, 提取液經(jīng)過濾、 稀釋后, 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定赭曲霉毒素A的含量, 外標(biāo)法定量。2 4 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。2 4.1 試劑2 4.1.1 氯化鈉(N a C l) 。2 4.1.2 氯化鉀(K C l) 。2 4.1.3 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。2 4.1.4 十二水磷酸氫二鈉(N a2H P O41 2 H2O) 。2 4.1.5 吐溫2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。2 4.1.6 檸檬酸鈉(N a3C6H5O72 H2O) 。2 4.1.7 檸檬酸(C6H8O7H2O) 。2 4.1.8 3,3 ,5,5 -四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 。2 4.1.9 過氧化氫(H2O2) 。2 4.1.1 0 濃硫酸(H2S O4) : 純度9 8%。2 4.2 試劑配制2 4.2.1 提取液: 甲醇-水(7 0+3 0) 。2 4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液: 甲醇-水(5+9 5) 。2 4.2.3 洗滌液: 分別稱取4 0.0g氯化鈉、1.0g氯化鉀、1.0g磷酸二氫鉀、1 4.5g十二水磷酸氫二鈉, 加入2.5m L吐溫2 0, 用水溶解后定容至5 0 0m L, 得到濃縮洗滌液, 使用前用水1 0倍稀釋。2 4.2.4 赭曲霉毒素A稀釋緩沖液: 分別稱取8.0g氯化鈉、0.2g氯化鉀、0.2g磷酸二氫鉀、2.9g十二水磷酸氫二鈉, 用水溶解后定容至10 0 0m L。2 4.2.5 檸檬酸緩沖溶液: 分別稱取1 0.1 5g檸檬酸鈉、1 3.7 6g檸檬酸, 用水溶解后定容至10 0 0m L。2 4.2.6 底物溶液甲: 稱取0.4gTMB用檸檬酸緩沖溶液溶解后定容至10 0 0m L。G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 6 2 4.2.7 底物溶液乙: 移取1.5m L3 0% H2O2用檸檬酸緩沖溶液稀釋后定容至10 0 0m L。2 4.2.8 顯色底物溶液: 底物溶液甲-底物溶液乙(5 0+5 0) 。2 4.2.9 反應(yīng)終止液: 移取2 2.2m L濃硫酸緩慢加入至1 7 7.8m L水中。2 4.3 標(biāo)準(zhǔn)品赭曲霉毒素A(C2 0H1 8C l NO6,C A S號:3 0 3 - 4 7 - 9) , 純度9 9%。或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。2 4.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制2 4.4.1 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液: 準(zhǔn)確稱取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品, 用甲醇溶解后配成1 0 0g/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 在-2 0下避光保存, 可使用3個月。2 4.4.2 赭曲霉毒素A系列標(biāo)準(zhǔn)工作液: 根據(jù)使用需要移取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液(2 4 .4 .1) ,用5 %甲醇溶液稀釋, 分別配成相當(dāng)于0n g/m L、0 .2n g/m L、0 .5n g/m L、1n g/m L、2n g/m L、5n g/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作液, 在4下避光保存, 可使用7d。2 4.5 材料2 4.5.1 抗抗體: 能與赭曲霉毒素A單克隆抗體特異性結(jié)合的抗體, 例如羊抗鼠抗體或兔抗鼠抗體等。2 4.5.2 包被有抗抗體的微孔板9 6孔或4 8孔。2 4.5.3 赭曲霉毒素A抗體溶液: 赭曲霉毒素A單克隆抗體。2 4.5.4 赭曲霉毒素A酶標(biāo)抗原: 赭曲霉毒素A與辣根過氧化物酶(HR P) 偶聯(lián)物。2 4.5.5 定性濾紙。2 5 儀器和設(shè)備2 5.1 酶標(biāo)測定儀: 配有4 5 0n m和6 3 0n m的檢測波長和振蕩功能。2 5.2 小型粉碎機。2 5.3 微量移液器:2 0L2 0 0L單道移液器,1 0 0L10 0 0L單道移液器,5 0L3 0 0L八道移液器。2 5.4 多功能旋轉(zhuǎn)混合器或高速均質(zhì)器或搖床。2 5.5 酶標(biāo)板振蕩器。2 5.6 渦旋混合器。2 5.7 分析天平: 感量0.0 1g。2 5.8 試驗篩: 孔徑1mm。2 6 分析步驟2 6.1 試樣制備稱取玉米、 小麥、 大麥、 大米、 大豆及其制品5 0 0.0g, 用粉碎機等粉碎并通過1mm試驗篩, 混勻后備用。2 6.2 試樣提取稱取試樣5.0g( 精確至0.1g) , 加入2 5m L提取液, 在多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩提取1 0m i n或高G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 7 速均質(zhì)器均質(zhì)提取3m i n或搖床振蕩4 0m i n。過濾提取液, 移取2 0 0L濾液置1.5m L離心管中, 加入2 0 0L赭曲霉毒素A稀釋緩沖液后渦旋混勻, 作為提取試樣, 備用。2 6.3 試樣測定2 6.3.1 將赭曲霉毒素A系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和提取試樣所用包被有抗抗體的微孔條插入酶標(biāo)板架, 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均需做平行實驗, 記錄標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣的位置。2 6.3.2 分別吸取5 0L赭曲霉毒素A系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和提取試樣加至相應(yīng)的微孔中, 然后各加入5 0L赭曲霉毒素A酶標(biāo)抗原, 再加入5 0L赭曲霉毒素A抗體溶液, 加蓋, 室溫反應(yīng)4 0m i n。2 6.3.3 棄掉孔中液體, 將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體, 然后每孔加入2 5 0L洗滌液, 置振蕩器上振蕩后棄掉孔中液體, 拍干。重復(fù)操作四次, 洗板時每次間隔2 0s, 洗完后用力在吸水紙上排干。2 6.3.4 每孔加入1 5 0L顯色底物溶液, 室溫避光溫育1 5m i n。2 6.3.5 每孔加入5 0L反應(yīng)終止液, 混勻。2 6.3.6 置酶標(biāo)儀中, 振蕩混勻, 測定4 5 0n m處的吸光度值, 參比波長設(shè)為6 3 0n m。2 6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在儀器最佳工作條件下, 測定赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液的吸光度, 以赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度值(n g/m L) 的對數(shù)值為橫坐標(biāo), 百分吸光度值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進行定量, 樣品溶液中待測物的吸光度值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。2 7 分析結(jié)果的表述提取試樣中赭曲霉毒素A吸光度按式(6) 計算。A=BB01 0 0%(6) 式中:A 百分吸光度值;B 標(biāo)準(zhǔn)溶液或提取試樣吸光度值的平均值;B0 空白的吸光度值。試樣中赭曲霉毒素A含量按式(7) 計算:X=Vfm(7) 式中:X 試樣中赭曲霉毒素A的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ; 提取試樣液中赭曲霉毒素A的濃度, 單位為微克每升(g/L) ;V 試樣體積, 單位為毫升(m L) ;f 試樣稀釋倍數(shù);m 試樣質(zhì)量, 單位為克(g) ;計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位有效數(shù)字。2 8 精密度樣品中赭曲霉毒素A含量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 8 均值的1 5%。2 9 其他玉米、 小麥、 大麥、 大米、 大豆及其制品的檢出限和定量限分別為1g/k g和2g/k g。第五法 薄層色譜測定法3 0 原理用三氯甲烷- 0.1m o l/L磷酸或石油醚-甲醇-水提取試樣中的赭曲霉毒素A, 提取液經(jīng)液-液分配后,根據(jù)其在3 6 5n m紫外光燈下產(chǎn)生黃綠色熒光, 在薄層色譜板上與標(biāo)準(zhǔn)比較測定赭曲霉毒素A的含量。3 1 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。3 1.1 試劑3 1.1.1 石油醚: 分析純,6 09 0或3 06 0。3 1.1.2 甲醇(CH3OH) 。3 1.1.3 三氯甲烷(CHC l3) 。3 1.1.4 甲苯(C6H5CH3) 。3 1.1.5 乙酸乙酯(C4H8O2) 。3 1.1.6 甲酸(CH2O2) 。3 1.1.7 冰乙酸(C2H4O2) 。3 1.1.8 乙醚(C4H1 0O) 。3 1.1.9 乙腈(CH3C N) 。3 1.1.1 0 苯(C6H6) 。3 1.1.1 1 磷酸(H3P O4) : 純度8 5%。3 1.1.1 2 鹽酸(HC l) 。3 1.1.1 3 氯化鈉(N a C l) : 純度9 8%。3 1.1.1 4 碳酸氫鈉(N a HC O3) 。3 1.1.1 5 乙醇(C2H5OH) 。3 1.2 試劑配制3 1.2.1 苯-冰乙酸(9 9+1) : 移取9 9m L苯和1m L冰乙酸并混勻。3 1.2.2 苯-乙腈(9 8+2) : 移取9 8m L苯和2m L乙腈并混勻。3 1.2.3 磷酸溶液(0.1m o l/L) : 稱取1 1.5g磷酸, 用水稀釋至10 0 0m L。3 1.2.4 鹽酸溶液(2m o l/L) : 移取2 0m L鹽酸, 用水稀釋至1 2 0m L。3 1.2.5 氯化鈉溶液(4 0g/L) : 稱取4 0g氯化鈉, 用水溶解后定容至10 0 0m L。3 1.2.6 碳酸氫鈉溶液(0.1m o l/L) : 稱取8.4g碳酸氫鈉, 用水溶解后定容至10 0 0m L。3 1.2.7 碳酸氫鈉-乙醇溶液: 稱取6.0g碳酸氫鈉, 用水溶解后定容至1 0 0m L, 移取2 0m L乙醇并混勻。G B5 0 0 9.9 62 0 1 61 9 3 1.3 標(biāo)準(zhǔn)品赭曲霉毒素A(C2 0H1 8C l NO6,C A S號:3 0 3 - 4 7 - 9) , 純度9 9%?；蚪?jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3 1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3 1.4.1 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液: 準(zhǔn)確稱取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品, 用苯-冰乙酸(9 9+1) 溶解后配成濃度為4 0g/m L, 用紫外分光光度計測定其濃度。濃度的測定參照G B5 0 0 9.2 2中3.1 4條( 赭曲霉毒素A的最大吸收峰波長3 3 3n m, 分子量4 0 3, 克分子消光系數(shù)值為55 5 0) 。于-2 0避光保存,可使用3個月。3 1.4.2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液: 準(zhǔn)確移取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 用苯稀釋成0.5g/m L的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液, 于4避光保存, 可使用7d。3 1.5 材料3 1.5.1 硅膠G: 薄層層析用。3 1.5.2 定性濾紙。3 2 儀器和設(shè)備所有玻璃儀器均需用稀鹽酸浸泡, 用自來水、 蒸餾水沖洗。3 2.1 小型粉碎機。3 2.2 電動振蕩器。3 2.3 玻璃板:5c m2 0c m。3 2.4 薄層涂布器。3 2.5 展開槽: 內(nèi)長2 5c m, 寬6c m, 高4c m。3 2.6 紫外光燈:3 6 5n m。3 2.7 微量注射器:1 0L,5 0L。3 2.8 具0.2m L尾管的1 0m L小濃縮瓶。3 2.9 分析天平: 感量0.0 0 1g。3 3 分析步驟3 3.1 試樣制備稱取2 5 0.0g試樣經(jīng)粉碎并通過2 0目篩后, 混勻后備用。3 3.2 試樣提取3 3.2.1 甲法稱取試樣2 0.0g( 精確至0.0 1g) 于2 0 0 m L具塞錐形瓶中, 加入1 0 0 m L三氯甲烷和1 0 m L0.1m o l/L磷酸, 在振蕩器上振蕩提取3 0m i n, 將提取液通過快速定性濾紙過濾; 取2 0m L濾液置于2 5 0m L分液漏斗中, 加5 0m L0.1m o l/L碳酸氫鈉溶液振搖2m i n, 靜置分層后, 將三氯甲烷層放入另一個1 0 0m L分液漏斗中, 如有少量乳化層, 或即使三氯甲烷層全部乳化均可放入分液漏斗中, 加入5 0m L0.1m o l/L碳酸氫鈉溶液重復(fù)提取三氯甲烷層, 靜置分層后棄去三氯甲烷層, 如三氯甲烷層仍乳G B5 0 0 9.9 62 0 1 62 0 化, 棄去, 不影響結(jié)果。碳酸氫鈉水層并入第一個分液漏斗中, 加約5.5m L2m o l/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)p H2 3, 加入2 5m L三氯甲烷振搖2m i n, 靜置分層后, 放三氯甲烷層于另一個盛有1 0 0m L水的2 5 0m L分液漏斗中, 酸水層再用1 0m L三氯甲烷振搖、 提取、 靜置, 將三氯甲烷層并入同一分液漏斗中。振搖、靜置分層, 用脫脂棉擦干分液漏斗下端, 放三氯甲烷層于一個7 5m L蒸發(fā)皿中, 將蒸發(fā)皿置蒸汽浴上通風(fēng)揮干。用約8m L三氯甲烷分次將蒸發(fā)皿中的殘渣溶解, 轉(zhuǎn)入具尾管的1 0m L濃縮瓶中, 置8 0水浴鍋上用蒸汽加熱吹氮氣(N2) 濃縮至干, 加入0.2m L苯-乙腈(9 8+2) 溶解殘渣, 搖勻, 供薄層色譜點樣用。3 3.2.2 乙法稱取試樣2 0.0g( 精確至0.0 1g) 于2 0 0m L具塞錐形瓶中, 加入3 0m L石油醚和1 0 0m L甲醇-水(5 5+4 5) , 在瓶塞上抹上一層水蓋嚴(yán)防漏。在振蕩器上振蕩提取3 0m i n后, 通過快速定性濾紙濾入分液漏斗中, 待下層甲醇水層分清后, 取出2 0m L濾液置于1 0 0m L分液漏斗中, 調(diào)節(jié)p H56。加入2 5m L三氯甲烷振搖2m i n, 靜置分層后放出三氯甲烷層于另一分液漏斗中, 再用1 0m L三氯甲烷重復(fù)振搖提取甲醇水層, 如發(fā)生乳化現(xiàn)象, 可滴加甲醇促使其分層, 將三氯甲烷層合并于同一分液漏斗中, 加入5 0m L1 0 0m L氯化鈉溶液( 加入量視品種不同而異,