GB4789.13-2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗.pdf

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.132012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部發(fā)布2012-05-17 發(fā)布2012-07-17 實施GB 4789.132012I前言本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 4789.132003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗 。本標(biāo)準(zhǔn)與 GB/T 4789.132003 相比，主要變化如下：修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱；修改了樣品制備過程；修改了培養(yǎng)基與試劑；修改了操作步驟；修改了菌數(shù)計算部分；增加了附錄 A。GB 4789.1320121食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗。2設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：a）恒溫培養(yǎng)箱：36 1 ；b）冰箱：2 5；c）恒溫水浴箱：501 ，460.5；d）天平：感量 0.1 g；e）均質(zhì)器；f）顯微鏡：10100；g）無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；h）無菌試管：18mm180mm；i）無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm；j）pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙；k）厭氧培養(yǎng)裝置。3培養(yǎng)基和試劑3.1胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂：見附錄 A 中 A.1。3.2液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG） ：見附錄 A 中 A.2。3.3緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.3。3.4乳糖-明膠培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.4。3.5含鐵牛乳培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.5。3.60.1%蛋白胨水：見附錄 A 中 A.6。3.7革蘭氏染色液：見附錄 A 中 A.7。3.8硝酸鹽還原試劑：見附錄 A 中 A.8。3.9緩沖甘油-氯化鈉溶液：見附錄 A 中 A.9。4檢驗程序GB 4789.1320122產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗程序見圖 1。圖 1 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗程序5操作步驟5.1樣品制備5.1.1樣品采集后應(yīng)盡快檢驗，若不能及時檢驗，可在 2 5 保存；如 8 h 內(nèi)不能進(jìn)行檢驗，應(yīng)以無菌操作稱取 25 g（mL）樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應(yīng)加雙料） ，并盡快至于-60 低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。5.1.2以無菌操作稱取 25 g（mL）樣品放入含有 225 mL 0.1%蛋白胨水（如為 5.1.1 中冷凍保存樣品，室溫解凍后，加入 200 mL 0.1%蛋白胨水）的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì) 1 min2 min；或置于盛有 225 mL0.1%蛋白胨水的均質(zhì)杯中， 8 000 r/min10 000 r/min 均質(zhì) 1min2 min， 作為 1:10 稀釋液。5.1.3以上述 1:10 稀釋液按 1 mL 加 0.1%蛋白胨水 9 mL 制備 10-210-6的系列稀釋液。檢樣25g(mL)檢樣+225 mL0.1%蛋白胨水均質(zhì)、稀釋10-110-6稀釋液各 1mL + TSC 瓊脂混合厭氧培養(yǎng)，361、20h24h，黑色菌落計數(shù)任選黑色菌落 5 個，分別接種 FTG 培養(yǎng)基確證試驗鏡檢形態(tài)乳糖-明膠動力-硝酸鹽牛奶發(fā)酵報告GB 4789.13201235.2培養(yǎng)5.2.1吸取各稀釋液 1 mL 加入無菌平皿內(nèi)， 每個稀釋度做兩個平行。 每個平皿傾注冷卻至 50 的 TSC瓊脂（可放置于 50 1 恒溫水浴箱中保溫）15 mL，緩慢旋轉(zhuǎn)平皿，使稀釋液和瓊脂充分混勻。5.2.2上述瓊脂平板凝固后，再加 10 mL 冷卻至 50 的 TSC 瓊脂（可放置于 50 1 恒溫水浴箱中保溫）均勻覆蓋平板表層。5.2.3待瓊脂凝固后，正置于厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi)，36 1 培養(yǎng) 20 h24 h。5.2.4典型的產(chǎn)氣莢膜梭菌在 TSC 瓊脂平板上為黑色菌落。5.3確證試驗5.3.1從單個平板上任選 5 個（小于 5 個全選）黑色菌落，分別接種到 FTG 培養(yǎng)基，36 1 培養(yǎng)18 h24 h。5.3.2用上述培養(yǎng)液涂片，革蘭氏染色鏡檢并觀察其純度。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌， 有時可見芽孢體。 如果培養(yǎng)液不純， 應(yīng)劃線接種 TSC 瓊脂平板進(jìn)行分純， 36 1 厭氧培養(yǎng) 20 h24 h，挑取單個典型黑色菌落接種到 FTG 培養(yǎng)基，36 1 培養(yǎng) 18 h24 h，用于后續(xù)的確證試驗。5.3.3取生長旺盛的 FTG 培養(yǎng)液 1 mL 接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在 46 0.5 水浴中培養(yǎng) 2 h 后，每小時觀察一次有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，該現(xiàn)象的特點(diǎn)是乳凝結(jié)物破碎后快速形成海綿樣物質(zhì)，通常會上升到培養(yǎng)基表面。5 h 內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣，呈“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，但培養(yǎng)基不變黑。5.3.4用接種環(huán)（針）取 FTG 培養(yǎng)液穿刺接種緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基，于 36 1 培養(yǎng) 24 h。在透射光下檢查細(xì)菌沿穿刺線的生長情況，判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴(kuò)散生長，無動力的菌株只沿穿刺線生長。然后滴加 0.5 mL 試劑甲和 0.2 mL 試劑乙以檢查亞硝酸鹽的存在。15 min 內(nèi)出現(xiàn)紅色者，表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；如果不出現(xiàn)顏色變化，則加少許鋅粉，放置 10 min，出現(xiàn)紅色者，表明該菌株不能還原硝酸鹽。產(chǎn)氣莢膜梭菌無動力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。5.3.5用接種環(huán)（針）取 FTG 培養(yǎng)液穿刺接種乳糖-明膠培養(yǎng)基，于 36 1 培養(yǎng) 24 h，觀察結(jié)果。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣和培養(yǎng)基由紅變黃， 表明乳糖被發(fā)酵并產(chǎn)酸。 將試管于 5 左右放置 1 h， 檢查明膠液化情況。如果培養(yǎng)基是固態(tài)，于 36 1 再培養(yǎng) 24 h，重復(fù)檢查明膠是否液化。產(chǎn)氣莢膜梭菌能發(fā)酵乳糖，使明膠液化。6結(jié)果與報告6.1典型菌落計數(shù)選取典型菌落數(shù)在 20 CFU200 CFU 之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。如果：a) 只有一個稀釋度平板的典型菌落數(shù)在 20CFU200CFU 之間，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；b）最低稀釋度平板的典型菌落數(shù)均小于 20 CFU，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；c）某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于 200 CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；d）某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于 200 CFU，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落數(shù)不在 20 CFU200 CFU 之間，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；e）2 個連續(xù)稀釋度平板的典型菌落數(shù)均在 20CFU200CFU 之間，分別計數(shù) 2 個稀釋度平板上的典型菌落。6.2結(jié)果計算6.1 計數(shù)結(jié)果按公式（1）計算：GB 4789.1320124(1)式中：T樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù)；A單個平板上典型菌落數(shù)；B單個平板上經(jīng)確證試驗為產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù)；C單個平板上用于確證試驗的菌落數(shù)；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）經(jīng)確證試驗有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）經(jīng)確證試驗有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個數(shù)；0.1稀釋系數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度） 。6.3報告根據(jù) TSC 瓊脂平板上產(chǎn)氣莢膜梭菌的典型菌落數(shù)，按照 6.2 中公式計算，報告每 g（mL）樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)，報告單位以 CFU/ g（mL）表示；如 T 值為 0，則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)報告。dnnCBAT)1 . 0()(21+=GB 4789.1320125附錄 A培養(yǎng)基和試劑A.1 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂A.1.1 基礎(chǔ)成分胰胨15.0 g大豆胨5.0 g酵母粉5.0 g焦亞硫酸鈉1.0 g檸檬酸鐵銨1.0 g瓊脂15.0 g蒸餾水900.0 mLpH 7.60.2A.1.2 D-環(huán)絲氨酸溶液溶解 1 gD-環(huán)絲氨酸于 200 mL 蒸餾水，膜過濾除菌后，于 4 冷藏保存?zhèn)溆?。A.1.3 制法將基礎(chǔ)成分加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝到 500 mL 燒瓶中，每瓶 250 mL，121 高壓滅菌15 min，于 50 1 保溫備用。臨用前每 250 mL 基礎(chǔ)溶液中加入 20 mL D-環(huán)絲氨酸溶液，混勻，傾注平皿。A.2 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）A.2.1 成分胰蛋白胨15.0 gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0 g葡萄糖5.0 g氯化鈉2.5g硫乙醇酸鈉0.5g刃天青0.001g瓊脂0.75g蒸餾水1 000.0 mLpH 7.10.2A.2.2 制法將以上成分加熱煮沸至完全溶解，冷卻后調(diào)節(jié) pH，分裝試管，每管 10 mL，121 高壓滅菌 15 min。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱 15 min，迅速冷卻至接種溫度。A.3 緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基A.3.1 成分蛋白胨5.0 g牛肉粉3.0 g硝酸鉀5.0 g磷酸氫二鈉2.5gGB 4789.1320126半乳糖5.0 g甘油5.0 mL瓊脂3.0 g蒸餾水1 000.0 mLpH 7.30.2A.3.2 制法將以上成分加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝試管，每管 10 mL，121 高壓滅菌 15 min。如果當(dāng)天不用，置 4 左右冷藏保存。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱 15 min，迅速冷卻至接種溫度。A.4 乳糖-明膠培養(yǎng)基A.4.1 成分蛋白胨15.0 g酵母粉10.0 g乳糖10.0 g酚紅0.05g明膠120.0 g蒸餾水1 000.0 mLpH 7.50.2A.4.2制法加熱溶解蛋白胨、酵母粉和明膠于 1000 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH，加入乳糖和酚紅。分裝試管，每管 10 mL，121 高壓滅菌 10 min。如果當(dāng)天不用，置 4 左右冷藏保存。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱15 min，迅速冷卻至接種溫度。A.5 含鐵牛乳培養(yǎng)基A.5.1 成分新鮮全脂牛奶1 000.0 mL硫酸亞鐵（FeSO47H2O）1.0 g蒸餾水50.0 mLA.5.2 制法將硫酸亞鐵溶于蒸餾水中，不斷攪拌，緩慢加入 1000 mL 牛奶中，混勻。分裝大試管，每管 10 mL，118 高壓滅菌 12 min。本培養(yǎng)基必須新鮮配制。A.6 0.1% 蛋白胨水A.6.1 成分蛋白胨1.0 g蒸餾水1 000.0 mLpH 7.00.2A.6.2制法加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，121 高壓滅菌 15 min。A.7 革蘭氏染色液A.7.1 結(jié)晶紫染色液A.7.1.1 成分結(jié)晶紫1.0gGB 4789.132012795%乙醇20.0 mL1%草酸銨水溶液80.0 mLA.7.1.2 制法將結(jié)晶紫完全溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.7.2 革蘭氏碘液A.7.2.1 成分碘1.0 g碘化鉀2.0 g蒸餾水300.0 mLA.7.2.2 制法將碘與碘化鉀先混合，加入蒸餾水少許振搖，待完全溶解后，再加入蒸餾水至 300 mL。A.7.3 沙黃復(fù)染液A.7.3.1 成分沙黃0.25 g95%乙醇10.0 mL蒸餾水90.0 mLA.7.3.2 制法將沙黃溶解于 95%乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.7.4 染色方法涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染色 1 min，水洗。滴加革蘭氏碘液，作用 1 min，水洗。 滴加 95%乙醇脫色約 15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染 1 min，水洗、待干、鏡檢。A.8 硝酸鹽還原試劑A.8.1 甲液（對氨基苯磺