Western-blot實驗方法步驟.pptVIP

Western-blot 試驗,概論,它結合了凝膠分辨力高和固相免疫測定的特異敏感等多種優(yōu)點，與免疫沉淀法比較，這種方法無需對靶蛋白進行同位素標記。幾乎總在變性條件下進行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題。 具有從混雜抗原中檢測出特定抗原，或從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性，還可以對轉移到固相膜上的蛋白質進行連續(xù)分析，具有蛋白質反應均一性，固相膜保存時間長等優(yōu)點。 被廣泛地用于蛋白質研究，基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學的研究。,溶解蛋白策略,1 使用劇烈的條件以確保細胞蛋白能全部裂解下來，但這可能導致免疫反應性的丟失。 2 采用溫和的條件以助于保持蛋白質的天然狀態(tài)，但這造成蛋白質從細胞上的脫落效果欠佳。 機械破碎細胞，可釋放出蛋白酶從而使靶蛋白降解。細胞表面蛋白和分泌蛋白通常比細胞內蛋白具有更好的抵抗力，變性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根據(jù)靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性質來調整提取的條件。 為盡可能減少可能出現(xiàn)的問題，可設法采用多克隆抗血清或多種單克隆抗體的混合物，因為他們可與某一蛋白的多種形式起反應。,溶解方法,溶解方法取決于細胞的型別和待測抗原的性質： 1 表達靶蛋白的細菌一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解。 2 酵母先用玻璃珠振蕩法或酶法裂解細胞，然后制備提取液。 3 哺乳動物組織通?？梢詸C械分散并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液。 4 哺乳動物細胞可用去污劑溫和裂解。如果靶抗原耐受相應抽提過程，也可在SDS凝膠加樣緩沖液裂解。,細胞準備,用PBS洗兩次細胞，加入細胞裂解液，用橡膠刮子刮下細胞，由于染色體DNA的釋放，溶液變得很粘稠。吸入1.5ml離心管。 超聲打碎染色體DNA,直至溶液不粘為止。 4度，13000rpm，30分鐘離心。分成三層：上層為油脂，中層為蛋白質，下層為沉淀。 有必要時重復上一步驟。 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可將上清轉入另一Eppendorf -80C保存,注意事項,細胞裂解液的量 超聲的頻率，時間，次數(shù)。插得深不起泡沫。 檢測蛋白的敏感性15ng,0.75mm厚的SDSPAGE的一個孔大約上100ug的總蛋白。 只要被檢測蛋白占總蛋白的1/100000,即可被檢測。 未知蛋白應同時作陽性對照。,主要試劑,RIPA（華舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（華舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 雙丙烯酰胺（Amresco公司） 麗春紅染料（華舜公司） Tween 20（Amresco公司） 過硫酸銨（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纖維素膜（Amersham公司） 考馬斯亮蘭（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗體（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）,儀器與設備,低溫超速離心機（Eppendorf公司） 分光光度計（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 電泳儀（Bio-Rad 公司） 垂直式電泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纖維素膜電轉系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）,配制試劑,10電泳Buffer 稱取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去離子水，定容至1000ml SDS 10克 1.5M Tris.HCl PH 8.8 稱取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，調PH至8.8，定容100ml 0.5M Tris.HCl PH6.8 稱取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，調PH至6.8，定容100ml 轉膜緩沖液 稱取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，臨用前加200ml甲醇 10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml。,配制試劑,30Acry-Bis 29克丙烯酰胺1克雙丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4保存 10過硫酸胺，新鮮配制，1week 0.1克過硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4保存 封閉試劑 10TBS （應用液：1TBS） 10TBS：取24.2克TrisBase 80克氯化鈉 用800mlddH2O溶解后，用HCl調PH至7.6，定容至1000ml 1TBS：取10TBS 50ml，稀釋至500ml，臨用前加0.1Tween 20，500ul。,配制試劑,4SDS Sample Buffer 2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中，調pH6.8 8克SDS 0.4克溴酚蘭 定容至100ml 40ml甘油 10ml DTT貯存液 1mol/L DTT貯存液：0.01mol/L 乙酸鈉 20ml 3.09克DTT過濾除菌后-20保存，分裝成1ml。 考馬斯亮蘭染液： 45ml 甲醇 45ml 水 用Whatman濾紙過濾，去除顆粒狀物質 10ml 冰乙酸 0.25克 考馬斯亮蘭R250,抗體選擇,一種免疫球蛋白可優(yōu)先識別其靶表位的某一特定構象（例如變性構象或天然構象）。并非所有的單克隆抗體都適合作為探針用于WETERN-BLOT，因為這一實驗中靶蛋白是徹底變性的。 多克隆抗血清是由單一免疫球蛋白組成的不確定混合物，通常對其特異性、親和力以及濃度都一無所知。因而不可能預言用特定多克隆抗血清來測定某一固定化變性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。 設置對照： 1不與靶蛋白反應的抗體（即免疫前血清或非相關單克隆抗體） 2 樣品對照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品 選用抗變性蛋白的高滴度多克隆抗血清或單克隆抗體混合物為佳。,實驗步驟,配膠 制膠 先用1ml槍頭小心鋪10%分離膠，上加少許異丙醇，待分離膠干凝后，倒去異丙醇，用水洗去多余未聚合的膠，濾紙吸干。再鋪4%積層膠，注意不要產(chǎn)生氣泡，斜插上梳子，待膠干后備用，拔去梳子。 上樣，所有上樣孔均加樣，沒有樣本，用上樣緩沖液代替。 100V，溴酚蘭走到分離膠底部后，1.5h后電泳結束。,實驗步驟,轉膜 小心取下凝膠，把預先在轉膜緩沖液中平衡過的Whatman濾紙及硝酸纖維素膜切成與凝膠同樣大小，按次序疊放在一起，在4度100V電壓轉膜1H,取出硝酸纖維素膜，右上角切去以作標記，麗春紅染色，可見多條粉紅色條帶，再用TBST漂洗至膜發(fā)白。 封閉 稱取脫脂奶粉1克，用1TBS溶解到20ml，使脫脂奶粉濃度為5。將硝酸膜浸在20ml封閉液中，室溫搖2h后。,實驗步驟,一抗雜交孵育 將一抗用含5%脫脂奶粉的1TBST溶液稀釋，使抗體濃度為1:1000；將封閉過的膜放在一抗稀釋液中，4度過夜；而后吸棄一抗稀釋液，用1TBST洗3次，每次5min。二抗孵育 二抗雜交孵育：將辣根過氧化物酶連接的二抗用含5%脫脂奶粉的1TBST溶液稀釋，使?jié)舛葹?:2000，并加入辣根過氧化物酶連接的抗生物素抗體（濃度為1:1000），將膜置于二抗稀釋液中，室溫振蕩孵育1h；而后吸棄二抗稀釋液，用1TBST洗3次，每次5min。,實驗步驟,顯影：將膜置入10ml LumiGLO溶液中（10ml LumiGLO溶液配方為：0.5ml 20LumiGLO、0.5ml 20Peroxide、9.0ml Milli-Q water），室溫輕搖1分鐘，注意避光操作；在暗室中剪下與膜同樣大小的膠片，壓在暗盒中，約1min；將膠片放在顯影液中洗1-5min；水沖洗；定影液中洗2-5min；水沖洗，可在相應位置見到目的條帶。,疑難雜證,沒有注明可以用來做western blot的一抗，可以用來做western blot嗎？ 不一定,因為有的抗體是識別線性表位的,有的是識別構象型表位的，識別構象型表位的抗體不能用于western blotting，因為在western blotting中抗體識別的是完全變性的蛋白質抗原，而蛋白質抗原的構象型表位變性時被破壞。,疑難雜證,做western每次只加一種一抗，請教有人同時加兩種或者多種一抗的嗎？ 最好還是不要同時加兩種一抗。因為如果結果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。 曾經(jīng)做過Western在同一張膜上檢測兩種蛋白。因為這兩種目的蛋白的分子量相差較遠，轉完膜后，一邊給Marker染色，一邊封閉。在上一抗之前，根據(jù)Marker的條帶把膜水平剪開，分子量小的目的蛋白在下面半張，大的在上面半張。然后分別上一抗、二抗，檢測。,疑難雜證,western blot 使用的膜哪種最好啊，PVDF好還是NC膜，能介紹一下膜的選擇嗎？ PVDF膜價格較貴，可重復使用，特別適合蛋白印跡，結合能力較強，但價格比較昂貴。 NC膜價格比較便宜，應用較廣，結合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 都可以用麗春紅染色。 具體使用還要參考相關文獻,疑難雜證,做western，在分子量很低的位置總是出現(xiàn)一條很強的帶（通常比我要的帶強），不知道為什么？是蛋白降解了嗎？ 有降解的可能，但如果用的是多抗出現(xiàn)非特異也是可能的，關鍵是你要的位置出現(xiàn)了嗎？ 減少非特異可以延長封閉時間，對付降解要視具體情況了。,疑難雜證,請問分子量為41KD和57KD作WESTERN時,可以分開切膠嗎?分別用多大電流轉膜?轉多長時間? 理論上分的開！蛋白Marker分子量分別為97kd 66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白時，分離的效果都比較好！分子量為41KD和57KD的蛋白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd，蛋白分子量相差15KD，分離效果很明顯。應該可以分開切膠！,疑難雜證,分別用多大電流轉膜? 一、一般跟你的分離膠的濃度有關。 二、與你的轉印系統(tǒng)型號有關. 三、與目的蛋白的分子量有關. 一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；,疑難雜證,WESTERN為什么出現(xiàn)了多條帶,每個加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶，而且好象都很有規(guī)律,為什么?是封閉時間不夠嗎,請指教 .做WESTERN必須要內參嗎？ 1、一抗、或二抗抗體濃度太高 2、多克隆抗體本身的非特異性反應 3、抗體的特異性不強 4、目的蛋白經(jīng)過處理后發(fā)生變化,而內參的條帶基本均勻一致.這樣才有說服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認為的造成目的條帶濃度的變化.所以嚴格意義上說,內參是必須做的。,疑難雜證,western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些？購買一抗時發(fā)現(xiàn)單抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？ 作為western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于western的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。 做免疫印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶。,疑難雜證,以下是關于合適抗體選擇的優(yōu)缺點比較，帖子上表格排不齊，只好以圖片形式抓了下來。,疑難雜證,為什么細胞提取液中沒有目標蛋白？ 答：原因有很多，1 細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；2 細胞中的蛋白質被降解掉了，必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；3 抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。 細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？ 答：1 有沉淀可能是因為蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長，2 也不排除抗原濃度過高，這時再加入適量sample buffer即可。,疑難雜證,蛋白質分子量很?。?0KD），請問怎么做WB？ 答：可以選擇PSQ膜,同時縮短轉移時間.也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟可 目的帶很弱，怎么加強？ 答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。 膠片背景很臟，有什么解決方法？ 答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間，牛奶濃度提高。,疑難雜證,目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？ 答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。 我的膠片是一片空白，是怎么回事？ 如果能能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。1 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；2 ECL底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；3 ECL底物沒覆蓋到相應位置；4 二抗失活。 問我顯影液顯影1分鐘,和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢? 1可能是紅燈造成的,可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善. 膠片本來就被曝光了2顯影時間過長.,疑難雜證,DAB好還是ECL好？ DAB(二氨基聯(lián)苯胺) 有毒,但是比較靈敏,是HRP最敏感的底物；ECL結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。 抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？ 抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。在上層膠中加入尿素至8M也可以打開。 半干轉是否要求膜，濾紙，膠同樣大??？因為膠大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？ 一般參照 膜= 濾紙 膠, 就行，你轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。,疑難雜證,電泳時Marker 按說明加5ul，但電泳中看不見，是失活了嗎？ 加入20ul即可。 蛋白轉移不到膜上，但膠上有