腺病毒載體在腫瘤治療中的應.ppt

優(yōu)秀精品課件文檔資料,2,條件增殖腺病毒在腫瘤 治療中的策略,條件增殖腺病毒在腫瘤 治療中的策略,微生物教研室 李曉霞,3,內 容,基因治療 分類 主要病毒載體系統(tǒng) 腺病毒載體在腫瘤治療中的策略 條件增殖腺病毒 現狀及策略,基因治療及分類,5,Gene-targeted therapy，以基因為靶點的治療，將遺傳物質導入人體組織或細胞所進行的疾病的治療,基因治療,6,歷史與回顧,1980年有人提出用磷酸鈣介導基因轉移來治療地中海貧血。離體基因治療 ex vivo 80年代初建立逆轉錄病毒體系為基因治療提供高效率的轉移載體。 1989年5月22日Rosenberg首次將外源基因-新霉素抗性基因用逆轉錄病毒導入腫瘤浸潤淋巴細胞中。,7,歷史與回顧,Anderson于1990年9月4日第一次用于人類疾病的基因治療，兩例由于腺苷脫氨酶缺失導致的免疫缺陷的女孩經逆轉錄病毒載體將該酶基因導入骨髓而獲救，并且存活至今。 2004 年1月，深圳賽百諾基因技術有限公司將世界上第一個基因治療產品重組人p53 抗癌注射液(商品名：今又生)正式推向市場，這是全球基因治療產業(yè)化發(fā)展的里程碑,8,基因治療分類,根據給藥途徑和方法 離體基因治療 ex vivo 原位基因治療 in situ 體內基因治療 in vivo,9,基因治療分類,離體基因治療 ex vivo將目的基因在體外導入自體或異體來源的腫瘤細胞或其它細胞，再將這些修飾過的靶細胞轉入體內。 原位基因治療 in situ將目的基因載體直接注射或導入體內的腫瘤組織，進行局部治療，這也是最主要的方法。 體內基因治療 in vivo將目的基因載體注射到血液系統(tǒng)進行全身治療。,10,基因治療分類,根據基因導入的方法 裸露DNA直接注射注射gene gun 脂質體共轉化體外細胞轉化 受體介導的基因導入病毒載體,主要病毒載體系統(tǒng),12,常用的病毒載體的特點,13,因該病毒最初來自腺體，故命名為腺病毒(Adenovirus)。 根據宿主可分鳥腺病毒屬和哺乳類腺病毒。 目前，把人腺病毒的46個血清型分為A-F 6個組： A-E組：各型病毒均能在人的組織細胞 (如腎細胞) 常規(guī)培養(yǎng)中增殖，稱為普通腺病毒； F組（40和41型）：是從糞便中發(fā)現，用常規(guī)細胞培養(yǎng)不能增殖的腺病毒，稱為腸道腺病毒。,腺病毒,14,基因治療中常用的基因載體 C亞群:2型及5型腺病毒 增殖能力非常強，滴度通?？梢赃_到109pfu 遺傳背景和生化結構清楚,腺病毒,球形，無包膜，直徑70-80nm。,二十面體病毒殼體,17,腺病毒,殼體含有三種主要的蛋白：六鄰體（II），五鄰體基底（III）和纖突（IV），還有多種其他的輔助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2,18,纖突結構域CAR (coxsackie adenovirus receptor) 五鄰體基質中精氨酸甘氨酸天冬氨酸基序 （Arg-Gly-Asp , RGD）細胞整合素,19,腺病毒,線性雙鏈DNA,基因組36kb 早期和后期轉錄單元 前者有E1a、E1b、E2、E3、E4和兩個延遲型早期單元和a2，編碼病毒的調節(jié)蛋白 后者有L1、L2、L3、L4、L5 五個區(qū)，編碼病毒的結構蛋白,20,腺病毒載體構建,在人腺病毒C亞群的Ad2 和Ad5 基礎上構建 E1區(qū)為病毒復制必需區(qū)，缺失則成為復制缺陷型載體 E3區(qū)是病毒復制非必需區(qū)，用于外源基因的插入,21,腺病毒載體的優(yōu)點,腺病毒粒子相對穩(wěn)定,病毒基因組重排頻率低,外源基因片段插入片段在病毒復制幾個周期后仍可保持不變,易于用重組DNA技術操作; 安全性較好,腺病毒無需整合進宿主細胞基因組中,目的基因在宿主細胞基因組外游離狀態(tài)下表達,整合突變致癌可能性小,基因毒性低; 腺病毒基因組較大(36 kb) ,絕大多數基因組(約35 kb)均能被外源基因取代,插入大片段外源性基因的潛力大; 有較大的宿主范圍,可以感染肝細胞、血管內皮細胞等多種人體細胞,對于受體細胞是否處于分裂期要求不嚴格; 腺病毒載體容易將外源基因直接轉移到靶細胞中,并有效表達成活性蛋白。,22,第一代腺病毒載體,去除了El/E3基因表達盒,可以插入長達615kb的外源DNA。去除E1區(qū)還阻止了依賴E1區(qū)和E2區(qū)功能蛋白的轉錄與隨后病毒DNA的復制及病毒外殼蛋白的產生。E1區(qū)缺失的腺病毒在能夠反式提供E1區(qū)基因蛋白的細胞中得到增殖。,23,第二代腺病毒載體,在E1、E3缺失的基礎上進一步去除了E2區(qū)和(或) E4區(qū),減弱病毒蛋白的表達 用于鳥氨酸氨甲酰基轉移酶缺乏癥的I期臨床實驗。,24,第三代腺病毒載體,通過對無感染能力的腺病毒顆粒的觀察,發(fā)現無感染能力腺病毒顆粒的基因組都含有腺病毒基因組左端的一段序列即包裝信號。因此設想保留兩端TR ( Terminal Repeats)及包裝信號共約500bp 的順式作用元件,去除腺病毒基因組中全部編碼序列(反式作用元件) ,其它功能由輔助病毒提供,這樣的腺病毒載體就是第三代腺病毒載體即所謂空殼載體（gutless adenovirus）。,腺病毒載體在腫瘤治療中的策略 條件增殖腺病毒,26,條件增殖腺病毒,通過基因工程的方法使病毒特異性地在腫瘤細胞中復制來殺死并裂解腫瘤細胞，從中釋放出來的病毒又可以進一步感染周圍的腫瘤細胞，這類病毒被稱為條件增殖腺病毒（conditionally replicative adenovirus , CRADs）或溶瘤腺病毒（Oncolytic adenovirus）。,27,CRADs 的分類,改變病毒的基因使其可以在腫瘤細胞中復制，而在正常細胞中復制能力降低，稱為I型CRADs。 E1B基因 dl1520 (美國ONYX公司)5型腺病毒，缺失了E1B區(qū)編碼55kd蛋白的序列，該蛋白可通過結合細胞內的p53使其功能受到阻滯。 頭頸部腫瘤和卵巢癌的治療進入一期和二期臨床試驗。 E1A 基因 與細胞周期調控蛋白Rb 結合，克服其對細胞周期的抑制作用，使細胞周期由G1 期過渡到S 期，病毒大量復制 腺病毒突變株Ad5-24 和dl922-947的E1A 基因在第2 個保守區(qū)（CR2）缺失24個堿基，,28,表 1 型CRAd的種類,29,利用腫瘤特異性啟動子（tumor specific promoter, TSP）控制病毒復制相關基因在腫瘤細胞中選擇性表達，稱為型CRAD。 這類病毒利用腫瘤特異性啟動子，使其控制腺病毒復制必需基因（E1A及E1B），使這些必需基因只在腫瘤細胞中表達，而在正常細胞中不表達，從而實現腫瘤特異性增殖目的。,30,表 型CRAd中的TSP,31,雙啟動子 分別調控病毒復制所必需的不同基因。以PSA啟動子調控Ad5的E1A，以hK2（human kallikrein 2）的啟動子來調控E1B的表達，實現對前列腺癌的雙重調控 雜合啟動子 由hTERT啟動子和CMV最小啟動子組成的雜合啟動子調控腺病毒E1a區(qū)基因表達,32,提高治療效果的策略,通過改變腺病毒的嗜性增強轉導靶向性 構建雙銜接分子 該分子可同時與病毒外殼和宿主細胞結合，從而增強腺病毒載體的轉導靶向性 病毒抗體：腺病毒纖突、五鄰體基質和六鄰體殼粒 配體：如葉酸酯、基本的成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor, FGF2） 抗體：如表皮生長因子受體的抗體（anti-epidermal growth factor receptor , anti-EGFR）、表皮細胞粘附素抗體（ anti-epithelial cellular adhesion molecule , anti-EpCAM）,33,基因工程方法改變腺病毒的嗜性 腺病毒5型，暴露于纖突蛋白之外的HI 環(huán)結構備受重視，它可以允許更多得氨基酸片段的插入，約100個，如RGD-4C肽 嵌合的Ad5和Ad3纖突蛋白結構域 能高效地轉導CAR低表達的腫瘤細胞； Ad5/3嵌合衣殼能在一定程度上避免體內早已存在的Ad5抗體對腺病毒的中和作用,34,提高治療效果的策略,腫瘤特異性啟動子在轉錄水平控制外源基因在特定的組織細胞中表達 CRAds中插入外源基因，將CRAds的溶瘤治療與基因治療相結合，使其既有對腫瘤的直接殺傷作用，又可以把外源性的治療基因穩(wěn)定地轉入腫瘤細胞內并大量、持續(xù)的表達，從而達到溶瘤-基因治療的雙重目的，這種病毒又被稱為“武裝后的條件增殖腺病毒”（armed CRAds）。,35,插入的外源基因 自殺基因如胸苷激酶（TK）基因、胞嘧啶脫氨酶（CD）基因 免疫調節(jié)因子TNF、IL-2及腫瘤抑制基因P53 報告基因編碼熒光蛋白或其他放射性標記蛋白,36,目前面臨的問題及展望,由于人體免疫系統(tǒng)的干涉，靜脈注射的病毒往往被免疫系統(tǒng)排除殆盡； 腺病毒在實體瘤中的擴散受到限制，這與腫瘤大小、腫瘤中正常細胞比例偏高（某些腫瘤中達50%）、腫