腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及干預(yù)研究.ppt

Cancer,Invasion & Metastasis,Liver Metastasis of Lung Cancer,主要內(nèi)容,一、概述 二、侵襲、轉(zhuǎn)移的定義 三、癌轉(zhuǎn)移的條件及特點(diǎn) 四、腫瘤轉(zhuǎn)移過程 五、腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,什么是轉(zhuǎn)移？,腫瘤侵襲（Invasion) 是指惡性腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)灶而侵犯鄰近組織并繼續(xù)增殖的過程。,腫瘤細(xì)胞的增殖 腫瘤從原發(fā)灶脫離E-鈣粘連素下降 腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和趨化性 血管生成與腫瘤侵襲,侵襲包括四個(gè)過程,腫瘤細(xì)胞的增殖,Ki67是一種增殖相關(guān)核抗原，檢測其表達(dá)能特異性識(shí)別增殖的腫瘤或正常細(xì)胞。反映細(xì)胞增殖活性的Ki 67指數(shù)(Ki67 LI)可作為判斷腫瘤生長速度的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的反映腫瘤侵襲能 力的形態(tài)學(xué)標(biāo)志(如核多形性、細(xì)胞不典型性和有絲 分裂活躍等)，與垂體腺瘤增殖和侵襲性相關(guān)性較低。 而腫瘤生長速度則被認(rèn)為是反映垂體腺瘤侵襲性的 客觀指標(biāo) 這與其具有高增殖性及高侵襲性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腺病 毒作為載體介導(dǎo)抑癌基因PTEN體外轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì) 胞U87，檢測其細(xì)胞增殖力與體外侵襲力的改變，進(jìn)而探 討PTEN作為膠質(zhì)瘤基因治療靶點(diǎn)的可能性。,是惡性腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，通過各種渠道轉(zhuǎn)運(yùn)到不連續(xù)的靶組織中繼續(xù)增殖，形成同樣性質(zhì)腫瘤的過程。,遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)瘤形成 繼發(fā)瘤繼續(xù)生長 繼發(fā)瘤再侵襲轉(zhuǎn)移,腫瘤轉(zhuǎn)移(Metastasis),人類對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí) 腫瘤是高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體 轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、序貫的復(fù)雜過程 轉(zhuǎn)移的發(fā)生是多因素相互作用的結(jié)果 （Fidler,IJ Surgical Oncology Clinics of North America. 2001，10（2）：257-269）,轉(zhuǎn)移有什么特點(diǎn)？,腫瘤轉(zhuǎn)移特點(diǎn),1. 不同腫瘤其轉(zhuǎn)移能力有差異 低轉(zhuǎn)移 基底細(xì)胞癌、脊髓瘤、 唾液腺腺樣囊性癌、軟骨肉瘤、,高轉(zhuǎn)移 甲狀腺濾泡型腺癌、黑色素瘤,2. 不同類型腫瘤其轉(zhuǎn)移途徑不同 淋巴道轉(zhuǎn)移 癌 如肺癌、 NPC,血道轉(zhuǎn)移 肉瘤、絨癌、腎癌 前列腺癌等,3. 轉(zhuǎn)移的器官特異性,原發(fā)瘤,轉(zhuǎn)移器官,乳腺癌 骨、腦、腎上腺 前列腺癌 骨 肺小細(xì)胞癌 骨、腦、肝 甲狀腺癌 骨 腎癌 骨、肝、甲狀腺 膀胱癌 腦 睪丸癌 肝 ,“Seed and Soil” theory By Paget S. The distribution of secondary growth in cancer of the breast Lancet, 1889 Seed: tumor cell with metastatic potential Soil: microenviroment,轉(zhuǎn)移器官特異性的機(jī)制,(1) 腫瘤細(xì)胞表型的差異 -異質(zhì)性 表現(xiàn) 細(xì)胞表面糖蛋白復(fù)合物、抗原、 酶活性、運(yùn)動(dòng)能力等 如 EGFR(-)/EGFR(+),HEx20,EBERx20,TFCx20,HEx20,EBERx20,TFCx20,NPC65,HEx60,EBERx60,TFCx60,NPC65,（2）組織器官微環(huán)境差異 實(shí)驗(yàn)證明,不同腫瘤移植于相同器官 同種腫瘤移植于不同器官,侵襲轉(zhuǎn)移能力有差異,如：部位相同 小鼠胃癌、人食管癌 不同部位 皮下、肌肉和腹腔,繼發(fā)器官微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的特殊親和性, 繼發(fā)器官脈管內(nèi)皮細(xì)胞 及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu) 化學(xué)趨化因子作用 器官相關(guān)的免疫狀態(tài) 各種生長因子作用,鼻咽癌轉(zhuǎn)移 裸鼠模型,腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移 需要哪些條件？,三、腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的條件及轉(zhuǎn)移特點(diǎn),（一）轉(zhuǎn)移發(fā)生的條件 1.細(xì)胞變異轉(zhuǎn)移異質(zhì)性,瘤細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定,異質(zhì)性演進(jìn),轉(zhuǎn)移亞克隆優(yōu)勢生長,依據(jù),轉(zhuǎn)移異質(zhì)性實(shí)驗(yàn)依據(jù)1977 Fidler,Tissue culture,Spontanous metastasis,Nine times,CNE-2Z-H5,本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行裸鼠體內(nèi)篩選高轉(zhuǎn)移癌株：,2. 微環(huán)境和機(jī)體免疫狀態(tài),（1）毗鄰細(xì)胞 旁分泌各種生長因子， 促進(jìn)腫瘤生長 （2）血液流變學(xué)改變 表現(xiàn) 血漿粘稠度及 紅細(xì)胞密度高,（3）機(jī)體的免疫反應(yīng) （4）細(xì)胞粘附性改變 瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞間粘附力下降 瘤細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)粘 附力增高,腫瘤轉(zhuǎn)移的條件,四、腫瘤轉(zhuǎn)移過程及其影響因素,Fidler,（一）原發(fā)瘤的形成與生長 即正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和生長, 受血管生成因子和抑制因子 共同調(diào)控,（二）腫瘤血管生成 始于腫瘤直徑達(dá)1-2mm 與宿主血管網(wǎng)互相聯(lián)系,（三）腫瘤細(xì)胞脫落并侵入基質(zhì) 1. 瘤細(xì)胞 粘附能力改變,同質(zhì)型粘附力低 異質(zhì)性粘附力高,易侵襲轉(zhuǎn)移,細(xì)胞粘附力與轉(zhuǎn)移關(guān)系,細(xì)胞系,同質(zhì)粘附%,轉(zhuǎn)移率%,LA1 91.29 0 LAD 88.5 16 LA5 72.5 32 CNE2L4 63 13 CNE2L2 92 100,異質(zhì)粘附%,瘤細(xì)胞間橋粒減少 瘤細(xì)胞表面負(fù)電荷增加 鈣粘蛋白表達(dá)水平下降 瘤細(xì)胞表面受體改變 瘤細(xì)胞表面纖維連接蛋白減少,有關(guān)影響因素,2. 瘤細(xì)胞表面負(fù)電荷增加,實(shí)驗(yàn)表明：,細(xì)胞系,電泳率,轉(zhuǎn)移率%,MFC-C-64 0.73m/sec/v/cm 7.5 MFC-C-38 0.83 m/sec/v/cm 31.4 CNE2L4 0.76 m/sec/v/cm 13 CNE2L2 1.36 m/sec/v/cm 100,3. 瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),細(xì)胞系,36h (m/h),轉(zhuǎn)移率%,LA1 198 0 LAD 285 16 LA5 316 32 CNE2L4 16.94 13 CNE2L2 28.94 100,刺激瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而抑制其生長，如TGF,干擾素等,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的因子,促進(jìn)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與生長，如 EGF,肝細(xì)胞生長因子等,刺激腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲的因子， 如：自分泌運(yùn)動(dòng)因子(AMF),4. 瘤細(xì)胞產(chǎn)生蛋白水解酶增加,主要包括 血漿纖維蛋白溶解酶原激活物 （Plasminogen activators,PA) 組織蛋白酶(cathepsins) 基質(zhì)金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinase,MMPs）,（四）瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng),新生脈管管壁不完整 瘤細(xì)胞通過運(yùn)動(dòng)、粘附、侵襲血管基底膜而進(jìn)入脈管,（五）瘤細(xì)胞與脈管粘附及瘤栓形成,循環(huán)中的瘤細(xì)胞互相粘連或與血小板粘附形成瘤栓。 瘤細(xì)胞通過粘附分子介導(dǎo)與內(nèi)皮細(xì)胞粘附（選擇素、整合素及其受體等） 但瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附有異質(zhì)性,（六）瘤細(xì)胞穿出血管,內(nèi)皮細(xì)胞 層損傷,內(nèi)皮下基 底膜暴露,瘤細(xì)胞 粘附,降 解 基底膜,瘤細(xì)胞 運(yùn)動(dòng)進(jìn) 入間質(zhì),（七）轉(zhuǎn)移灶生長及再侵襲轉(zhuǎn)移,瘤細(xì)胞與靶器官的實(shí)質(zhì)細(xì)胞粘附 瘤細(xì)胞和靶器官分泌各種生長因子刺激瘤細(xì)胞增殖 新生血管形成,微小轉(zhuǎn)移的概念 1971年 Huvos 直徑2 Fisher直徑1.3 1980年 Black直徑小于受累淋巴結(jié)的20%作為標(biāo)準(zhǔn) 1993年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)12 目前, 直徑2,腫瘤可轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)(包括新鮮淋巴結(jié)和石蠟切片)、骨髓、外周血及其他體液等,較多見的取材為淋巴結(jié)、骨髓、外周血。,微小轉(zhuǎn)移檢測方法 細(xì)胞學(xué)方法 癌細(xì)胞數(shù)量很少,鑒別良、惡性細(xì)胞仍有困難,其特異性和敏感性差,陽性率1% 連續(xù)切片法 工作量繁重,費(fèi)時(shí)費(fèi)力 7%33% 免疫學(xué)方法 抗上皮細(xì)胞膜/骨架成份的單克隆抗體檢測肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等播散至外周組織中的癌細(xì)胞。,微小轉(zhuǎn)移檢測方法 聚合酶鏈反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)PCR、RT-PCR 高效率、高靈敏度、高特異性、操作簡便,現(xiàn)已能測定組織、體液中的單個(gè)癌細(xì)胞 診斷特異性尚存在爭議 定量法 具有更高的特異性和敏感性,微小轉(zhuǎn)移檢測方法 癌基因直接檢測法 肺和6例癌組織均有1基因表達(dá), 正常淋巴結(jié)無 端粒酶活性檢測 外周血端粒酶活性,反映血液微轉(zhuǎn)移的情況,是一種潛在的預(yù)后指標(biāo)。,五、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,(一) 腫瘤轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)調(diào)控 1.癌基因(Oncogenes) 研究表明：多種癌基因與轉(zhuǎn)移相關(guān)，如 Myc, Mos,Raf, Fos,Ras等,以Ras為例： Ras 家屬：N-Ras,K-Ras, H-Ras,體外侵襲,體內(nèi)轉(zhuǎn)移,提示：H-Ras促進(jìn)BW5147 侵襲轉(zhuǎn)移,以NIH/3T3細(xì)胞為對象的研究 還發(fā)現(xiàn)：H-Ras 可以改變某些 基因表達(dá)水平,2. 抑癌基因 目前已發(fā)現(xiàn)的抑癌基因近20種 如Rb,P53,P15,P16,APC等。,實(shí)驗(yàn)證實(shí)：,高轉(zhuǎn)移肺癌 細(xì)胞系PG,P53wtmRNA 低于正常,PCR-SSCP檢測p53,CD44v突變情況,P53突變,CD44v6突變,3. 轉(zhuǎn)移抑制基因 nm23,發(fā)現(xiàn) Steeg(1988)從小鼠黑色素瘤細(xì)胞系中克隆出,蛋白 17KD, 與核苷酸二磷酸激酶(NDPK)高度同源,基因 定位17q22,533bp 有兩個(gè)亞型H1,H2,功能,A. 通過與NDPK相似途徑參與細(xì) 胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控 B . 影響微管的聚合以調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng) C. 影響G蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,A. 在多數(shù)腫瘤中，nm23-H1表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān) B. 在癌轉(zhuǎn)移過程中，出現(xiàn)等位基因 缺失，造成其蛋白功能異常 C. nm23-H2基因常出現(xiàn)點(diǎn)突變，蛋白結(jié)構(gòu)被破壞,與轉(zhuǎn)移的關(guān)系,（二）粘附分子與腫瘤轉(zhuǎn)移,1. 粘附的類型,細(xì)胞間粘附(同質(zhì) 或異質(zhì)）,細(xì)胞與ECM粘附,2.粘附分子的種類與作用 （1）整合素(integrins),整合素為跨膜糖蛋白 由和兩個(gè)亞基構(gòu)成異二聚體 參與不同細(xì)胞間及細(xì)胞 與細(xì)胞外基質(zhì)粘附 受多種活化因子活化,（2）鈣粘蛋白(Cadherin), 為跨膜糖蛋白家族 E-CD:上皮組織 P-CD:上皮、胎盤 N-CD:神經(jīng)組織 基因定位于16q22-q23.1, E-CD 和 Catenin 構(gòu)成復(fù)合體 介導(dǎo)同源細(xì)胞粘附 E-CD 的低表達(dá)促進(jìn)多數(shù)腫瘤 侵襲轉(zhuǎn)移,主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間粘附 包括ICAM-1、VCAM-1、 NCAM等 ICAM-1， VCAM-1過表達(dá)，腫瘤侵襲能力強(qiáng), NCAM 低表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)移,(3) 免疫球蛋白類粘附分子, 包括 L-選擇素 存在于白細(xì)胞表面 E-選擇素 內(nèi)皮細(xì)胞 P-選擇素 參與瘤細(xì)胞與血小板粘附, 選擇素 參與瘤細(xì)胞聚集和瘤細(xì)胞與特定內(nèi)皮細(xì)胞錨定,(4) 選擇素（selectins), 分標(biāo)準(zhǔn)型(CD44s)和變異型 (CD44v) 為跨膜蛋白，細(xì)胞內(nèi)部分與細(xì)胞骨架相連，膜外部分與透明質(zhì)酸(HA) 等配體作用,（5）CD44分子,介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM 之間粘附，為淋巴細(xì)胞的歸巢受體 具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 通過影響細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)降解而參與腫瘤轉(zhuǎn)移,(三) 腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移,1. 血管生成的過程 血管內(nèi)皮基底膜降解 內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織遷移 內(nèi)皮細(xì)胞增殖 管腔及血管網(wǎng)形成 形成新基底膜,Fig 4-14,Cancer cells disseminate to remote organs via blood stream,x,Function of tumor vessels,Supply tumors with oxygen, nutrients and growth factors Transport of CO2 and toxic components away from the tissue Mediate tumor metastasis,2. 腫瘤血管生成的調(diào)節(jié),促進(jìn)因子,纖維母細(xì)胞生長因子(bFGF) 干擾素(INF-,) 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF) 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF- ) 血小板因子4 TNF PAI PA TIMPs PDEGF MMPs IL-8,抑制因子,低氧誘導(dǎo)VEGF mRNA表達(dá) (RT-PCR),Isoforms Folds s VEGF189 2.670.30(P0.05) VEGF165 2.050.03(P0.01) VEGF145 2.730.15(P0.05) VEGF121 1.650.01(P0.05),低氧誘導(dǎo)VEGF 蛋白表達(dá) (Western-Blot),VEGF in hypoxic cells was (2.200.07)-fold of that in normoxic cells. *Independent Samples T-Test: t=8.944, P0.05,（四）蛋白水解酶與腫瘤轉(zhuǎn)移,1. 纖維蛋白溶解酶原激活劑及其抑制劑(PA and PAI) (1) PA的分類與功能 分組織型(t-PA)和尿激酶型 (u-PA),不同的基因產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)相似，即單鏈絲氨酸蛋白酶 參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程，包括細(xì)胞分化、血管生成、細(xì)胞遷移、基質(zhì)降解等,圖1 uPA在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá),圖2 各鼻咽癌細(xì)胞RT-PCR結(jié)果uPA mRNA與GAPDH mRNA灰度比值,圖3 uPAR mRNA在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá),圖4 各鼻咽癌細(xì)胞RT-PCR uPAR mRNA結(jié)果與GAPDH mRNA灰度比值,CNE-2Z H5 H5-9,60KD 55KD,Western Blot檢測 uPAR在CNE-2Z,H5,H5-9中的表達(dá),圖5 PAI-1 mRNA在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá), 包括PAI-1,2,3 PAI-1為糖蛋白，52KD, PAI-2分子量46.6KD, 為u-PA抑制劑 在多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，提示 預(yù)后好,(2) PAI的分類與功能,圖6 各鼻咽癌細(xì)胞RT-PCR結(jié)果PAI-1mRNA與GAPDHmRNA灰度比值,(1) 分類與結(jié)構(gòu) 為Zn依賴的內(nèi)肽酶，包括 膠原酶(collagenase) 明膠酶(gelatinase) 基質(zhì)溶素(tromitysinase) 膜型MMP(MT-MMPs),2.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑 ( MMPs/TIMPs), 能降解ECM中所有成分 誘導(dǎo)和促進(jìn)新生血管形成 調(diào)節(jié)瘤細(xì)胞的粘附 細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 膠原蛋白、彈性蛋白、 糖蛋白、蛋白多糖,免疫組化檢測鼻咽癌組織中MMP-2,MMP-9,LMP-1的表達(dá)情況,LMP1 MMP-2 MMP-9,（五）機(jī)體免疫與轉(zhuǎn)移,（1）NK細(xì)胞 為第一道防線，無需抗原刺激可殺傷瘤細(xì)胞 依據(jù),1. 參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞,小鼠,環(huán)磷酰胺,清除NK細(xì)胞,移植腫瘤于小鼠,轉(zhuǎn)移早,裸小鼠,T細(xì)胞缺陷， NK細(xì)胞存在,移植腫瘤于小鼠,轉(zhuǎn)移率相對低,（2）巨噬細(xì)胞 其活性與轉(zhuǎn)移抑制能力呈正相關(guān) 實(shí)驗(yàn)表明,巨噬細(xì)胞抑制劑,促進(jìn)轉(zhuǎn)移,巨噬細(xì)胞激活劑,減少轉(zhuǎn)移,（3）T細(xì)胞,Ts細(xì)胞 促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移 Th細(xì)胞 增強(qiáng)殺傷T細(xì)胞的作用 殺傷T細(xì)胞 抑制和殺傷瘤細(xì)胞,問題與展望：,轉(zhuǎn)移各步驟和不同微環(huán)境中癌細(xì)胞基因表達(dá)譜變化尚難確定 各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間形成的交叉對話(Cross-talking)機(jī)制有待闡明 腫瘤臨床診斷、療效評價(jià)及預(yù)后判斷的敏感標(biāo)記物有待確定。 高通量技術(shù)平臺(tái)的建立將為腫瘤轉(zhuǎn)移研究帶來新的希望,一、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制 （續(xù)）,（二）粘附分子與腫瘤轉(zhuǎn)移,1.粘附的類型,細(xì)胞間粘附(同質(zhì) 或異質(zhì)）,細(xì)胞與ECM粘附,2. 粘附分子的種類與作用 （1）整合素(integrins),整合素為跨膜糖蛋白 參與不同細(xì)胞間及細(xì)胞 與細(xì)胞外基質(zhì)粘附 受多種活化因子活化,（2）鈣粘蛋白(Cadherin), 為跨膜糖蛋白家族 E-CD:上皮組織 P-CD:上皮、胎盤 N-CD:神經(jīng)組織 基因定位于16q22-q23.1, E-CD 和 Catenin 構(gòu)成復(fù)合體 介導(dǎo)同源細(xì)胞粘附 E-CD 的低表達(dá)促進(jìn)多數(shù)腫瘤 侵襲轉(zhuǎn)移,主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間粘附 包括ICAM-1、VCAM-1、 NCAM等。 ICAM-1， VCAM-1過表達(dá)，腫瘤侵襲能力強(qiáng)。, NCAM 低表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。,(3) 免疫球蛋白類粘附分子, 包括 L-選擇素 存在于白細(xì)胞表面。 E-選擇素 內(nèi)皮細(xì)胞 P-選擇素 參與瘤細(xì)胞與血小板粘附, 選擇素 參與瘤細(xì)胞聚集和瘤細(xì)胞與特定內(nèi)皮細(xì)胞錨定。,(4) 選擇素（selectins),(三) 腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移,1.血管生成的過程 血管內(nèi)皮基底膜降解 內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織遷移 內(nèi)皮細(xì)胞增殖 管腔及血管網(wǎng)形成 形成新基底膜,Fig 4-14,Cancer cells disseminate to remote organs via blood stream,x,Function of tumor vessels,Supply tumors with oxygen, nutrients and growth factors Transport of CO2 and toxic components away from the tissue Mediate tumor metastasis,2.腫瘤血管生成的調(diào)節(jié),促進(jìn)因子,纖維母細(xì)胞生長因子(bFGF) 干擾素(INF-,) 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF) 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF- ) 血小板因子4 TNF PAI PA TIMPs PDEGF MMPs IL-8,抑制因子,低氧誘導(dǎo)VEGF mRNA表達(dá) (RT-PCR),Isoforms Folds s VEGF189 2.670.30(P0.05) VEGF165 2.050.03(P0.01) VEGF145 2.730.15(P0.05) VEGF121 1.650.01(P0.05),低氧誘導(dǎo)VEGF 蛋白表達(dá) (Western-Blot),VEGF in hypoxic cells was (2.200.07)-fold of that in normoxic cells. *Independent Samples T-Test: t=8.944, P0.05,（四）蛋白水解酶與腫瘤轉(zhuǎn)移,1. 纖維蛋白溶解酶原激活劑及其抑制劑(PA and PAI) (1) PA的分類與功能 分組織型(t-PA)和尿激酶型 (u-PA),為不同的基因產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)相似，單鏈絲氨酸蛋白酶。 參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程，包括細(xì)胞分化、血管生成、細(xì)胞遷移、基質(zhì)降解等。,圖1 uPA在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá),圖2 各鼻咽癌細(xì)胞RT-PCR結(jié)果uPA mRNA與GAPDH mRNA灰度比值, 包括PAI-1,2,3 PAI-1為糖蛋白，52KD, PAI-2分子量46.6KD, 為u-PA抑制劑 在多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，提示 預(yù)后好。,(2) PAI的分類與功能,圖5 PAI-1 mRNA在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá),圖6 各鼻咽癌細(xì)胞RT-PCR結(jié)果PAI-1 mRNA與GAPDHmRNA灰度比值,(1) 分類與結(jié)構(gòu) 為Zn依賴的內(nèi)肽酶，包括 膠原酶(collagenase) 明膠酶(gelatinase) 基質(zhì)溶素(tromitysinase) 膜型MMP(MT-MMPs),2. 基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑 ( MMPs/TIMPs), 能降解ECM中所有成份。 誘導(dǎo)和促進(jìn)新生血管形成。 調(diào)節(jié)瘤細(xì)胞的粘附。,免疫組化檢測鼻咽癌組織中MMP-2,MMP-9,LMP-1的表達(dá)情況,慢性鼻咽炎 鼻咽癌 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌,MMP-2,MMP-9,（五） 機(jī)體免疫與轉(zhuǎn)移,（1） NK細(xì)胞 為第一道防線，無需抗原刺激 可殺傷瘤細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)依據(jù)：,1、參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞,先天無NK Bejge 小鼠轉(zhuǎn)移早,（2）巨噬細(xì)胞 其活性與轉(zhuǎn)移抑制能力呈正相關(guān) 實(shí)驗(yàn)表明：,巨噬細(xì)胞抑制劑,促進(jìn)轉(zhuǎn)移,巨噬細(xì)胞激活劑,減少轉(zhuǎn)移,（3）T細(xì)胞,Ts細(xì)胞 促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移 Th細(xì)胞 增強(qiáng)殺傷T細(xì)胞的作用 殺傷T細(xì)胞 抑制和殺傷瘤細(xì)胞,問題與展望：,轉(zhuǎn)移各步驟和不同微環(huán)境中癌細(xì)胞基因表達(dá)譜變化尚難確定。 腫瘤臨床診斷、療效評價(jià)及預(yù)后判斷的敏感標(biāo)記物有待確定。 高通量技術(shù)平臺(tái)的建立將為腫瘤轉(zhuǎn)移研究帶來新的希望。,策略 針對腫瘤細(xì)胞（嚴(yán)打：應(yīng)用各種細(xì)胞毒藥物） 針對瘤細(xì)胞生存微環(huán)境（整治環(huán)境）,二、抗轉(zhuǎn)移治療的新策略,抗轉(zhuǎn)移治療的新方法,1.抑制腫瘤血管生成 即針對腫瘤血管形成的某些因子及其關(guān)鍵步驟進(jìn)行干預(yù), 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞活化類藥物，如RhuMAb VEGF， FLK-1(DC101),(2) 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂與 遷移,如Angiostatin(血管抑素），endostatin（內(nèi)皮抑素）， TNP-470 (3)抑制基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)降解類藥物 (4)封閉整合素功能類藥物,2. 細(xì)胞粘附分子抑制劑與抗轉(zhuǎn)移 （1）阻止粘附信號(hào)的傳遞 蛋白酪氨酸激酶(PTK) 抑制劑（Genistein),（3）增強(qiáng)E-cadherin介導(dǎo)的同質(zhì)粘附,（2）抑制Integrins 依賴性的粘附 如 環(huán)孢霉素等,3.蛋白酶抑制劑的應(yīng)用,（1）MMPs抑制劑 a. Batimastat 為人工合成的小分子MMP 抑制劑，能與MMP活性基 團(tuán)結(jié)合，能抑制MMP-2,9等,b. Marimastas 為第二代人工合成MMP抑制劑，副作用小，病人耐受好等，能抑制多種MMP活性,（2）uPA 抑制劑如抗uPA抗體及多肽,4.基因治療,1. 定義 基因治療 將正常的外源基因?qū)肷矬w或人體靶細(xì)胞內(nèi)以彌補(bǔ)所缺失的基因、或關(guān)閉、降低異常表達(dá)的基因，以達(dá)到治療疾病的目的。, 增強(qiáng)宿主抗癌免疫 恢復(fù)或增強(qiáng)抑癌基因的功能 阻斷癌基因 增強(qiáng)化療和放療敏感性 細(xì)胞基因殺傷效應(yīng),2.腫瘤轉(zhuǎn)移基因治療的策略,3.基因治療的途徑,1. ex vivo 途徑: 將人體細(xì)胞從體內(nèi)取出, 基因改造, 再移植到人體中. 自體,同種異體, 異種細(xì)胞, 同種異體或異種組織和器官等. 2. in vivo 途徑: 直接將基因轉(zhuǎn)移到人體中, 如DNA注射,口服, 噴霧等. 有如普通治療藥物, 商業(yè)化發(fā)展方向所在.,基因治療的ex vivo 途徑,基因治療就與打針和吃藥一樣.,基因治療的in vivo 途徑,舉例,nm23 gene,TIMP gene,轉(zhuǎn)染,高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞,轉(zhuǎn)移能力降低,三、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究的基本策略與技術(shù),（一）研究策略 整體水平：人癌動(dòng)物模型 自發(fā)性癌癥動(dòng)物模型 誘發(fā)性癌癥動(dòng)物模型 可移植性癌癥動(dòng)物模型（裸鼠，SCID小鼠） 轉(zhuǎn)基因癌癥動(dòng)物模型 細(xì)胞水平（細(xì)胞培養(yǎng)、雜交瘤技術(shù)等）,裸小鼠特征： 外觀無毛，裸體，皮膚薄，發(fā)育遲緩。 無胸腺 T細(xì)胞功能欠缺 無細(xì)胞毒效應(yīng)，無移植排斥 成年鼠NK細(xì)胞活性增加 抵抗力低 11號(hào)染色體突變,SCID小鼠特征 (Severe Combined Immune Deficency) 外觀正常 16號(hào)染色體突變，T、B缺陷 免疫學(xué)特征為T 、B細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞水平（細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等） 組織水平研究 分子水平研究 染色體水平 DNA水平 RNA水平 蛋白水平,（二）高通量技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用,1.常用分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 重組DNA技術(shù) PCR,RT-PCR,PCR-SSCP Southern blot,Northern blot Western blot,2. 高通量技術(shù)的應(yīng)用,染色體、DNA水平(Genomics):比較基因組雜交(CGH) RNA水平(Transcriptomics):差異顯示(DD-PCR),抑制消減雜交(SSH)，基因表達(dá)系列分析(SAGE), 基因芯片(cDNA array). 蛋白質(zhì)水平(Proteomics):2-D gels,比較基因組雜交(Comparative Genomic Hybridization,CGH),CGH 原理：將兩種不同熒光標(biāo)記的基因組DNA等比例與正常分裂中期染色體競爭雜交，分析每條染色體上熒光強(qiáng)度比率，推測待檢DNA拷貝數(shù)變化。,基本方法： 正常中期染色體制備 基因組DNA分離 DNA標(biāo)記 雜交和染色 熒光鏡檢和圖象分析,Tissue Microdissection equipments,Tissue Microdissection