PCR擴增產(chǎn)物的分析.ppt

PCR 擴增產(chǎn)物的分析,Gel electrophoresis Restriction endonuclease Molecular hybridization Nucleic acid sequence,PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析,瓊脂糖凝膠電泳 常用于臨床檢測（定性） 聚丙烯酰胺凝膠電泳 分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中 可用于科研及檢測分析,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法 瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物 根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖 低熔點瓊脂糖熔點為6265，溶解后在37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等,凝膠濃度選擇,瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍,電泳緩沖液,常用三種緩沖液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀 TAE：緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TAE。緩沖液中的 EDTA 可螯合二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴增產(chǎn)物降解,10TBE緩沖液的配制,配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH應(yīng)為8.08.2 臨用時用水稀至0.5TBE（20倍稀釋）,核酸電泳的指示劑,指示劑： 溴酚蘭 二甲苯青 溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色 電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性DNA片段,核酸電泳的指示劑,二甲苯青：水溶液呈蘭色， 電泳時，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當(dāng),載樣緩沖液,指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液 作用： 增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi) 在電泳中形成肉眼可見的指 示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置 使樣品呈色，使加樣操作更方便,核酸電泳的染色劑,最常用的染色劑 溴化乙錠 銀染色,核酸電泳的染色劑,溴化乙錠（ethidium bromide，EB） 是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光 可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min 瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般5ng 溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察,核酸電泳的染色劑,銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色 靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收,電泳,電泳裝置 電泳儀 電泳槽 灌膠模具等,電泳儀,普通電泳儀 高壓電泳儀,電泳槽,水平平板 垂直平板,電泳方法,用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子 根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般 200400 bp 的DNA片段（可配制1.21.7%）,電泳方法 配制瓊脂糖凝膠及倒膠,0.5TBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至60(需要時可加入EB)，倒入電泳槽中，待凝固 向電泳槽中倒入0.5 TBE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子（如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)除去）,電泳方法 上樣與通電,在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi) 接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負(fù)），電壓為1 5V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算） 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳，一般 200400bp 的PCR產(chǎn)物50V電壓，電泳2040min,電泳方法 結(jié)果觀察,紫外儀上觀察電泳帶及其位置 并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴增產(chǎn)物的大小,聚丙烯酰胺凝膠電泳,適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析 其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長度僅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分離,聚丙烯酰胺凝膠,由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED（N，N，N，N一四甲基乙二胺）和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠 聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的,不同濃度丙烯酰胺和DNA有效分離范圍,材料,電泳儀器： 電泳儀 垂直電泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亞甲基雙丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml 裝于棕色瓶內(nèi)，4可保存二個月,材料,10%過硫酸銨 過硫酰銨，1克，加水至 10 ml 4可保存一周，-20可保存一個月 1TBE電泳緩沖液 TEMED（四甲基乙烯基二胺）,聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳,配膠：根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出 將裝好的玻璃電泳板傾斜成4560角 按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù) 加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止,聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳,立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力 的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10角，可減少液體泄漏的機會 室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1TBE緩沖液,聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳,小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則 將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時不要產(chǎn)生氣泡,聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳,接好電極，電壓為1-8V/cm，進行電泳 電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶液中，1530min后取出水洗，紫外儀下觀察結(jié)果 聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出10ng以上量的DNA條帶（要求更高的靈敏度，可用銀染）,電泳結(jié)果分析,DNA Marker DNA 人工片段 100 bp ladder,酶切分析,根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶進行酶切 酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的片段 此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究,分子雜交,檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù) 檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法 主要的雜交 Southern印跡雜交 斑點雜交,Southern印跡雜交：,在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈并作標(biāo)記（探針） 與 PCR 產(chǎn)物雜交 此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測 PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。,斑點雜交：,將PCR 產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上 寡核苷酸探針雜交 觀察有無著色斑點 主要用于 PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析,RDB檢測 -地中海貧血突變基因,-29（AG） -28（ AG） 17（ AT，AAG TAG） E （CD26 GAG AAG） IVS-I-1（ GT ） IVS-I-5（ GC） 27-28（+C） 41-42（-CTTT） 43（ GT ） 71-72（+A或+T） 654（ CT）,微孔板夾心雜交法,通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異性雜交，使PCR產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域特異性雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果 該法使用了兩個雜交過程來檢測一個產(chǎn)物，其特異性較一次雜交的檢測法高,Principle,：NOS（11014/cm2） N-羥化琥珀酰亞胺酯,Principle,-CCCCCC,Capture Probe:,：NH2,Detection Probe:,：Biotin,Principle,：NH2標(biāo)記的探針,：Biotin標(biāo)記的探針,Avidin-HRP 顯色系統(tǒng),：NOS基團,Principle,微孔板夾心雜交法 方法學(xué)評價,敏感度：該法檢測HBV，敏感度達5個HBV DNA分子 敏感性和特異性與 PCR 32P 探針的Southern雜交法相當(dāng) PCR微孔板夾心雜交法：操作簡便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA,微孔板直接雜交,不是采用夾心法，而是直接將特異的探針固定于微孔板上，然后用生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與之雜交 只進行一次雜交，方法簡單，但特異性不高,微孔板雜交的基本過程,DNA的固定 探針的雜交 酶聯(lián)顯色,DNA的固定,在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可固定在微孔板上 不同來源的微孔板固定DNA時所需鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度 （0.153.0mol/L NaCl）來固定加熱變性的核酸，然后，用固定濃度的標(biāo)記探針雜交。顯色后，判斷合適的固定鹽濃度,DNA的固定,固定方法的選擇必須使DNA最大量的固定，且不影響雜交 用合適濃度的 NaCl 或（NH4）2SO4 可達到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。 鹽濃度合適時，DNA應(yīng)為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使DNA “平躺”固定在孔內(nèi)而影響雜交,DNA的固定,Mg2+雖有促進DNA固定的作用，但它可激活Dnase，所以，一般不用 被固定的DNA應(yīng)大于300bp，否則影響雜交結(jié)果。每孔可固定高達 200ng（624bp）的DNA 鹽濃度和固定量確定后，按下法固定DNA,DNA的固定,待固定DNA 100加熱 5min 變性，并立即冷卻，與合適的固定液混合后，加入微孔板的孔內(nèi) 固定液：10mmol/L磷酸鈉-10mmol/L EDTA，pH7.0，合適濃度的NaCl（與DNA變性混合后，終濃度為最適固定濃度） 用膠布封好，浸于37水浴2h 用PBS-0.05%Tween20 漂洗3次 立即用于雜交，或封閉于塑料袋內(nèi)保存,雜交與顯色,雜交 可采用標(biāo)準(zhǔn)的雜交系統(tǒng)雜交 夾心雜交時，是將變性的PCR產(chǎn)物與檢測探針一并加入 雜交與漂洗時間均較一般膜雜交短 顯色 根據(jù)不同酶標(biāo)，檢測分子的不同來選擇不同的底物、終止劑和測定波長,顏色互補分析法（A）,利用三原色原理，當(dāng)不同DNA片段（A和B）同時擴增時，用引物5端修飾技術(shù)將不同引物用不同顏色熒光素標(biāo)記（A片段引物標(biāo)記綠色的熒光素，B標(biāo)記紅色的羅丹明） 如果僅有一條片段被擴增，擴增產(chǎn)物激發(fā)后，只有一種顏色（紅色或綠色） 如果兩條不同大小的片段均被擴增，可通過電泳分離，紫外激發(fā)后可觀察到不同顏色的兩條帶 如果兩條被擴增片段大小相同，電泳后可見一條紅綠互補色-黃色帶 如果不用電泳法分離擴增片段，通過一定手段除未摻入引物，亦可觀察到擴增產(chǎn)物的顏色。此時，擴增產(chǎn)物無論大小，只要均被擴增，就可見一條紅綠互補的黃色條帶,顏色互補分析法 方法學(xué)評價,該法簡便、易于自動化 可用于檢測基因（缺失、染色體轉(zhuǎn)位）和病原微生物 只判斷產(chǎn)物的有無 在檢測多種基因?qū)嵶儭⒍喾N病原菌和HLA分型時，可用復(fù)合PCR。此時，不同引物可用不同熒光素標(biāo)記（如綠色的ROX；藍色的COUM等）,PCR-ELISA法：,本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測 5端修飾后仍可進行常規(guī)PCR擴增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個引物的5端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團，而通過另一引物5端的修飾使產(chǎn)物便于檢測 操作過程,1 鏈親和素包被：,聚丙乙烯微孔板，包被效果差異并不顯著 親和層析純化的鏈霉親和素（13U/mg，Sigma公司） 用PBS-Tween液140mmol/L NaCl， 2.7mmol/L KCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/L K2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，pH7.2配成1g/ml 向微孔板的每孔內(nèi)加入100l，封好，室溫過夜 用PBS液漂洗,2 擴增產(chǎn)物與包被板的結(jié)合,PCR產(chǎn)物1l用501 PBS-Tween液稀釋后加入包被孔內(nèi) 室溫下作用30min 用