《次級代謝產(chǎn)物》PPT課件.ppt

次級代謝產(chǎn)物,兩個概念 ：初級代謝產(chǎn)物，次級代謝產(chǎn)物,初級代謝產(chǎn)物：是指微生物產(chǎn)生的，生長和繁殖所必需的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸等。 次級代謝產(chǎn)物：從初級代謝途徑中形成分枝代謝途徑，并用初級代謝產(chǎn)物生成與菌體生長繁殖無關(guān)的物質(zhì)或功能還未明的化合物，這個過程稱次級代謝，產(chǎn)物稱次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、毒素、色素。,從菌體生化代謝角度來說，由于次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是多種多樣的，菌體合成抗生素的生化代謝途徑也是多樣的。但許多抗生素的基本結(jié)構(gòu)是由少數(shù)幾種初級代謝產(chǎn)物構(gòu)成的。所以，次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為母體衍生出來的，次級代謝產(chǎn)物合成途徑并不是獨立的，而是與初級代謝產(chǎn)物合成途徑有著密切的關(guān)系。,次級代謝產(chǎn)物的類型：,（1）抗感染抗生素 （2）抗腫瘤抗生素 （3）免疫抑制劑 （4）降膽固醇劑 （5）殺寄生蟲劑 （6）植物生長激素 （7）殺真菌抗生素 （8）生物殺生劑,微生物次級代謝產(chǎn)物抗生素的研制中-內(nèi)酰胺抗生素已成為主要產(chǎn)品,次級代謝產(chǎn)物的經(jīng)濟效益是巨大的,據(jù)統(tǒng)計，次級代謝產(chǎn)物的國際市場估計年產(chǎn)值高達(dá)500多億美元以上。,造福人類的青霉素,青霉素G,青霉素V,青霉素是指分子中含有青霉烷，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素。,青霉素又被稱為青霉素G、peillin G、 盤尼西林、 配尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青 霉素鉀。,按其特點可分為 ： 青霉素G類：如青霉素G鉀、青霉素G鈉、長效西林等。 青霉素V類：(別名：苯氧甲基青霉素、6-苯氧乙酰胺基青霉 烷酸) 如青霉素V鉀等（包括有多種劑型）。 耐酶青霉素：如苯唑青霉素(新青號)、氯唑青霉素等。 廣譜青霉素：如氨芐青霉素、羥氨芐青霉素等。 抗綠膿桿菌的廣譜青霉素：如羧芐青霉素、氧哌嗪青霉素、 呋芐青霉素等。 氮咪青霉素：如美西林及其酯匹美西林等，其特點為較耐酶， 對某些陰性桿菌(如大腸、克雷伯氏和沙門氏菌)有效，但對綠膿桿菌效差。,青霉素的基本結(jié)構(gòu)與生物合成,青霉素的工業(yè)生產(chǎn),青霉素的發(fā)酵控制,青霉素工業(yè)生產(chǎn)中注意的問題,選育青霉素生產(chǎn)菌,青霉素生產(chǎn)的發(fā)展,青霉素的生物合成的調(diào)控,青霉素的基本結(jié)構(gòu)與生物合成,青霉素的基本結(jié)構(gòu)（活性母核）：,6氨基青霉烷酸 （6APA）,噻唑烷環(huán)和內(nèi)酰胺環(huán)融合,內(nèi)酰胺環(huán),噻唑烷環(huán), L-氨基己二酸, L- 半胱氨酸, L-纈氨酸,青霉素生物合成前體,（LLDACV）,（異青霉素N）,（青霉素G）,三肽合成酶,異青霉素N合成酶,異青霉素N?；D(zhuǎn)移酶 ?；o酶A 、苯乙酸,選育青霉素生產(chǎn)菌,1、出發(fā)菌株的選擇 青霉素產(chǎn)生菌主要是產(chǎn)黃青霉。開始生長時，孢子先脹大，長出芽管并急速伸長，形成隔膜，繁殖成菌絲，然后產(chǎn)生復(fù)雜的分支，交織為網(wǎng)狀而成菌落。菌落外觀有的平坦，有的褶皺很多，一般都是圓形的。在發(fā)育過程中從氣生菌絲形成大梗和小梗，于小梗上著生分生孢子，排列成鏈狀，形狀似毛筆。分生孢子有橢圓形、圓柱形、圓形，每種菌種的孢子均具有一定的形狀，多次傳代后也不改變。,2、切斷支路代謝 （1）當(dāng)菌種的初級代謝和次級代謝處于分路途徑時，初級代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)缺陷突變菌株?？墒瓜鄳?yīng)的次級代謝產(chǎn)物增產(chǎn)。 （2）青霉素的生物合成受賴氨酸的反饋抑制，這是由于賴氨酸可使高檸檬酸合成酶受到抑制或阻遏，因此選育賴氨酸缺陷突變株，通過在培養(yǎng)基中限量添加賴氨酸，可使青霉素產(chǎn)量明顯提高。,3、解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié),（1）選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株,（2）篩選自身耐受性突變株,（3）篩選前體或前體類似物抗性突變株,（4）選育營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株,4、增加前體物的合成,纈氨酸是產(chǎn)黃青霉生物合成的前體物。乙酰羥酸合成酶將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴Ｈ樗?，最后形成纈氨酸。但是，過量的纈氨酸會反饋抑制乙酰羥酸合成酶。通過誘變選育纈氨酸對乙酰羥酸合成酶的反饋抑制比親株小的產(chǎn)黃青霉，使細(xì)胞內(nèi)積累較多的纈氨酸，是青霉素產(chǎn)量大幅度提高。,青霉素的工業(yè)生產(chǎn),產(chǎn)黃青霉,斜面孢子,真空冷凍干燥或液氮保藏孢子,瓊脂斜面培養(yǎng)基上25培養(yǎng)79天,米孢子,種子罐,發(fā)酵罐,發(fā)酵液,發(fā)酵濾液,一次BA萃取液,用斜面孢子懸浮液接種于大米或小米基質(zhì)上25培養(yǎng)67天,用孢子米?；蜴咦討腋∫航臃N，26 通氣、攪拌培養(yǎng)6068h,用種子罐按10%15%體積接種，在25 及通氣、攪拌下補料分批培養(yǎng)200240h,冷卻至5 左右，絮凝、過濾,用15%硫酸調(diào)節(jié)pH2.02.2，按1：3.51：4.0體積比加入乙酸丁酯（BA）及適量破乳劑，在5 左右進(jìn)行逆流萃取,補料： 葡萄糖 硫酸銨 氨水 苯乙酸 消沫劑,絲狀菌發(fā)酵工藝流程,一次BA萃取液,一次水提液,一次BA萃取液,脫色液,青霉素工業(yè)鹽,結(jié)晶混懸液,濕晶體,按1：41：5體積比加入1.5%NaHCO3緩沖液，在5 左右進(jìn)行逆流反萃取,用15%硫酸調(diào)節(jié)pH2.02.2，按1：3.51：4.0體積比加入乙酸丁酯（BA），在5 左右進(jìn)行逆流萃取,加入粉末活性炭，攪拌1520min脫色，然后過濾,按脫色液中青霉素含量計算所需鉀量的110%加入25%乙酸鉀丁醇溶液，在真空度0.095MPa及4548 下共沸結(jié)晶,過濾，先后用少量丁醇和乙酸乙酯各洗滌晶體兩次,在0.095MPa的真空及50 下干燥,表一,青霉素的發(fā)酵控制,溫度 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別 , 但一般認(rèn)為應(yīng)在25 C 左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率 , 同時增加葡萄糖的維持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對菌絲生長和青霉素合成來說 , 最適溫度不是一樣的, 一般前者略高于后者, 故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的溫度，以縮短生長時間, 到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 , 以利于青霉素的合成。,在青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中,通常采用25恒溫控制法。抗生素發(fā)酵一般不能在整個發(fā)酵周期內(nèi)只選一個最合適的培養(yǎng)溫度,因為適合于菌生長的溫度不一定適合于抗生素的合成,反之,適合于抗生素合成的溫度亦不一定適合于菌的生長。青霉菌的最合適生長溫度為30,而最適于青霉素合成的溫度是20左右。,在青霉素發(fā)酵前期050h把溫度控制在最適合青霉菌生長的30 ，可促進(jìn)菌絲迅速生長盡可能提前進(jìn)人抗生素分泌期。在51160h 間，把溫度控制在最適于青霉素合成的20 ，可增加抗生素分泌量并維持較長的分泌期，而160h后又升溫培養(yǎng)，可刺激抗生素的分泌 ，雖然這樣會加速菌絲衰老，但因已近放罐，無礙大局，這個溫度控制在25 較好，過高如30 會使菌絲過快衰老，反而不利于增長單位，而溫度偏低 如 20 則起不到刺激后期抗生素分泌的作用，會使單位偏低。,青霉素發(fā)酵的最適 pH 值一般認(rèn)為在 6. 5 左右 , 有時也可以略高或略低一些 , 但應(yīng)盡量避免 pH 值超過7.0。,pH,溶氧 在青霉素發(fā)酵過程中，溶氧有個限值，在此值之下，青霉素的產(chǎn)量會越來越低，直到青霉素不在產(chǎn)出為止。我們稱這一點為臨界點。大多數(shù)情況下高粘度發(fā)酵液控制溶氧值為30%，低粘度發(fā)酵液控制溶氧值為20%。通過電極插入罐中發(fā)酵液來測量溶氧值，并且勻速攪拌，即使假設(shè)發(fā)酵罐中每一點的攪拌都是相同的（這實際上是不可能實現(xiàn)的），因為發(fā)酵液中每一點的生物量都不同，所以所測的值不是真實的值。如果僅僅是不同的壓力的影響，罐底部的溶氧實際上要比電極測的要高。而表面溶氧值要比電極在表面所測的溶氧值要低。,菌絲濃度 發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度, 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達(dá)到平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強度 (取決于維持因數(shù)的大小, 維持因數(shù)越大,呼吸強度越高) 、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強度低的菌株降低發(fā)酵中氧的消耗速率，而通氣與攪拌能力強的發(fā)酵罐及黏低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升, 從而提高臨界菌體濃度。,菌絲生長速度 用恒化器進(jìn)行的發(fā)酵試驗證明，在葡萄糖限制生長的條件下，青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長速率之間呈一定關(guān)系。當(dāng)比生長速率低于0.015h-1時，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比, 當(dāng)比生長速率高于 O. 015h-1時, 比生產(chǎn)速率與比生長速率無關(guān) D 因此, 要在發(fā)酵過程中達(dá)到并維持最大比生產(chǎn)速率, 必須使比生長速率不低0.015h-1 。這一比生長速率稱為 臨界比生長速率。對于分批補料發(fā)酵的生產(chǎn)階段來說, 維持0.015h斗的臨界比生長速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍, 這在實際工業(yè)生產(chǎn)中是很難實現(xiàn)的。事實上 , 青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多, 卻仍然能達(dá)到很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補料分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶, 抵消了一部分生長, 故雖然表觀比生長速率低, 但真比生長速率卻要高一些。,菌絲形態(tài) 在長期的菌株改良中 , 青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸, 故一般比生產(chǎn)速率較高； 后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低, 使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高, 從而允許更多的菌絲生長 (即臨界菌體濃度較高), 發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。,在絲狀菌發(fā)酵中, 控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L度, 并避免結(jié)球 , 是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中, 使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊 , 并盡量減少游離菌絲的含量, 也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強度及比生長速率密切相關(guān)。,青霉素的生物合成的調(diào)控,生物合成的調(diào)控： 1、碳源調(diào)控 青霉素的生物合成在很大程度上受葡萄糖和蔗糖及在較小程度上受麥芽糖、果糖、甘露糖等其他糖的調(diào)控，而不受乳糖調(diào)控。研究表明，葡萄糖能被菌體迅速利用而有利于菌體生長，但抑制青霉素合成，而被緩慢利用的乳糖，卻是產(chǎn)生青霉素的最好碳源。乳糖是有葡萄糖和半乳糖所組成的雙糖，并不是合成青霉素的特殊前體，所以乳糖比葡萄糖優(yōu)越的主要原因是乳糖被緩慢水解成單糖的速度正好符合產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)期合成青霉素的需要，而不會產(chǎn)生很高濃度的分解產(chǎn)物來抑制青霉素的合成，因此，碳源的緩慢利用時大量合成青霉素的關(guān)鍵。,乳糖是早年青霉素生產(chǎn)中使用的碳源，在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中則采用慢速流加葡萄糖的方法，這樣既能促進(jìn)發(fā)酵前期的產(chǎn)生菌生長，又可避免葡萄糖阻遏，從而達(dá)到較高的青霉素產(chǎn)量。高濃度的葡萄糖顯著阻遏產(chǎn)黃青霉的ACVS和IPNS生成而不抑制它們的活性，而在較小程度上阻遏?；o酶A：異青霉素N-?；D(zhuǎn)移酶的生成。葡萄糖還導(dǎo)致產(chǎn)黃青霉的乙酰輔酶A合成酶失活，使側(cè)鏈前體的活化受阻。用葡萄糖培養(yǎng)的菌體的-氨基己二酸庫縮小，這顯然是由于刺激了細(xì)胞生長和作為賴氨酸生物合成中間體的-氨基己二酸向賴氨酸轉(zhuǎn)化所造成的。由于葡萄糖比乳糖更有利于真菌的生長，由此可見，青霉素的生物合成階段需要保持亞適生長條件。 葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率，還由于葡萄糖與6-APA之間形成復(fù)合物，從而減少了可用于青霉素合成的中間產(chǎn)物。,葡萄糖效應(yīng),所有迅速代謝能源都能阻遏較慢代謝的能源所需酶的合成。酶的生成被易分解碳源所阻遏。此稱葡萄糖效應(yīng)。酶大多數(shù)是誘導(dǎo)酶。 葡萄糖效應(yīng)并不是由葡萄糖直接造成，而是葡萄糖某種分解代謝物引起。cAMP（環(huán)腺苷酸）是關(guān)鍵控制因子。其與分解代謝物活化蛋白（CAP）結(jié)合，促使RNA多聚酶與啟動基因結(jié)合而開始轉(zhuǎn)錄。 cAMP濃度低時，影響結(jié)合，不能轉(zhuǎn)錄。 葡萄糖的某種代謝產(chǎn)物降低了cAMP水平，即使有誘導(dǎo)劑存在，也不能合成分解其它糖的酶，只有葡萄糖消耗完，cAMP水平上升，才能開始轉(zhuǎn)錄、合成。,流加式操作,流加式操作又稱補料分批式操作（Fed-batch operation），是指在分批式操作的基礎(chǔ)上，連續(xù)不斷補充新培養(yǎng)基，但不取出培養(yǎng)液。由于不斷補充新培養(yǎng)基，整個發(fā)酵體積與分批式操作相比是在不斷增加。 在青霉素發(fā)酵中通常采用補料分批操作法 。,流加培養(yǎng)優(yōu)點,實現(xiàn)對發(fā)酵過程的控制，如控制代謝途徑、菌體比生長速率等，隨著菌體的生長，營養(yǎng)物質(zhì)會不斷消耗，加入新培養(yǎng)基，滿足了菌體適宜生長的營養(yǎng)要求。既避免了高濃度底物的抑制作用，也防止了后期養(yǎng)分不足而限制菌體的生長。 解除了產(chǎn)物的反饋抑制和葡萄糖效應(yīng)；避免了前期用于微生物大量生長導(dǎo)致的設(shè)備供氧不足；可用于理論研究。不產(chǎn)生微生物的老化變異；產(chǎn)物濃度較高，有利于分離；使用范圍廣。,控制流加操作的形式有二種，即無反饋控制和反饋控制。 無反饋控制包括定流量和定時間流加，而反饋控制根據(jù)反應(yīng)系中限制性物質(zhì)的濃度來調(diào)節(jié)流加速率。青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中流加操作采用后者，即對容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的最適濃度。 必須特別注意的是葡萄糖的流加 , 因為即使是超出最適濃度范圍較小的波動 , 都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制 , 使生物合成速度減慢或停止。目前 , 糖濃度的檢測尚難在線進(jìn) 行 , 故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制 , 而是間接根據(jù)pH 值、溶氧或 C02 釋放率予以調(diào)節(jié)。,pH值,青霉素發(fā)酵的最適 pH 值一般認(rèn)為在 6. 5 左右 , 有時也可以略高或略低一些 , 但應(yīng)盡量避免 pH 值超過7.0,因為青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定, 容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中, pH 值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映 在青霉素發(fā)酵中，采用自動化補料工藝，通過控制葡萄糖的補加速率來控制發(fā)酵的pH，采用按需補糖方法（根據(jù)pH的變化來決定補糖速率），一般在殘?zhí)墙抵?0.6% 左右, pH 值上升時開始加糖，這樣可維持長久的青霉素高產(chǎn)。,溶氧,對于好氧的青霉素發(fā)酵來說 , 溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到 30% 飽和度以下時, 青霉素產(chǎn)率急劇下降, 低于 10% 飽和度時, 則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高 , 說明菌絲生長不良或加糖率過低, 造成呼吸強度下降, 同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。 氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個動態(tài)平衡點, 而氧消耗與碳能源消耗成正比, 故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個參考指標(biāo)。,2、氮調(diào)控 產(chǎn)黃青霉生物合成青霉素被高濃度的銨離子抑制。這一調(diào)控反應(yīng)和低水平的谷氨酰胺合成酶相關(guān)聯(lián)。在低NH4+濃度下生長的菌絲中，有較高濃度的谷氨酰胺積累，而谷氨酸濃度較低。相反，隨著NH4+濃度的增加，谷氨酰胺庫減少，而谷氨酸濃度增加，抗生素合成減少。NH4+還直接阻遏產(chǎn)黃青霉的青霉素生物合成基因表達(dá)。在用乳糖培養(yǎng)的產(chǎn)黃青霉菌絲中加入40mmol/L NH4Cl，pcbAB和pcbC基因的表達(dá)都受到阻遏。現(xiàn)已查明，這種阻遏是通過氮調(diào)控蛋白NRE介導(dǎo)的，它能結(jié)合到pcbAB和pcbC基因的啟動子區(qū)，從而影響它們的表達(dá)。,3、氨基酸調(diào)控 由于青霉素是由三個前體氨基酸生物合成的，因而某些氨基酸必然對這一生物合成過程產(chǎn)生某種調(diào)控反應(yīng)。 在產(chǎn)黃青霉和構(gòu)巢曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入賴氨酸降低青霉素的發(fā)酵效價，這一效應(yīng)物作用于賴氨酸生物合成途徑的幾個步驟，包括對-氨基己二酸分支點之前的高檸檬酸合成酶活性的反饋抑制（較大程度）和阻遏（較小程度）及對高順烏頭酸酶的反饋抑制和阻遏，從而減少可用于青霉素生物合成的-氨基己二酸庫。另一方面，賴氨酸在典型的生理濃度下抑制-氨基己二酸分支點之后的-氨基己二酸還原酶活性，使細(xì)胞內(nèi)的-氨基己二酸庫增加。低產(chǎn)產(chǎn)黃青霉菌株的-氨基己二酸還原酶對賴氨酸的抑制不敏感，而高產(chǎn)菌株十分敏感，這是高產(chǎn)菌株何以能夠產(chǎn)生更多青霉素的一個重要原因。,纈氨酸作為-內(nèi)酰胺抗生素生物合成的前體氨基酸，在胞內(nèi)保持一定的濃度是必要的，但它反饋抑制本身生物合成途徑中的乙酰羥酸合成酶。產(chǎn)黃青霉的乙酰羥酸合成酶對纈氨酸的反饋抑制表現(xiàn)出部分脫敏，從而使得這一前體氨基酸的供應(yīng)得以增加。,青霉素的生物合成和賴氨酸的,反饋調(diào)節(jié),三肽是青霉素生物合成的中間體，除了半胱氨酸和纈氨酸外，還含有-氨基己二酸。 -氨基己二酸的初級代謝終產(chǎn)物是賴氨酸，分支的次級代謝產(chǎn)物是青霉素G。所以， -氨基己二酸是青霉素和賴氨酸的生物合成共同中間體。賴氨酸能反饋抑制賴氨酸生物合成途徑中的第一個酶高檸檬酸合成酶，導(dǎo)致-氨基己二酸的合成受阻，減少青霉素生物合成中的中間體的供應(yīng)，使青霉素產(chǎn)量減少。如圖一所示,酮戊二酸乙酰CoA,高檸檬酸,順高烏頭酸,高異檸檬酸,酮已二酸,酮已二酸,氨基已二酸（AAA）,賴氨酸,L- -AAA半胱氨酸,L- -AAA半胱氨酸-D-纈氨酸,青霉素G,高檸檬酸合成酶,反饋抑制,圖一,4、硫調(diào)控 硫酸鹽作為前體氨基酸半胱氨酸的合成原料，在青霉素的生物合成中起著重要作用，但高濃度的硫酸鹽阻遏低產(chǎn)產(chǎn)黃青霉菌株的硫酸鹽通透酶而影響其攝取，硫酸鹽饑餓條件下的硫酸鹽通透酶活性和硫酸鹽攝取率均上升。 在高產(chǎn)產(chǎn)黃青霉菌株中，呈現(xiàn)脫阻遏現(xiàn)象，即使在較高的硫酸鹽濃度下，仍能具有較高的通透酶活性。,青霉素工業(yè)生產(chǎn)中注意的問題,特別注意和說明的事項： 1、生產(chǎn)菌種的長期保存要采用孢子懸浮液液氮低溫（-196）存放或真空冷凍干燥管冷藏（4）的方法，而不采用傳統(tǒng)的沙土管保藏方法，以便在較長時間（510年）內(nèi)保持菌種的存活和生產(chǎn)能力穩(wěn)定。 2、瓊脂斜面種子（孢子）密封后在415下保存不超過3個月 3、米孢子的基質(zhì)可以是大米或小米，培養(yǎng)成熟后密封可以在415下保存不超 過3個月；如果在密封前真空干燥，則可以保存不超過6個月。 4、種子罐以達(dá)到對數(shù)生長的后期為培養(yǎng)成熟標(biāo)志，不能隨意延長或縮短培養(yǎng)時間；同時要考慮培養(yǎng)液的流動性，以不影響通過管道向發(fā)酵罐接種的速度為宜。,5、發(fā)酵罐的發(fā)酵條件要嚴(yán)格按工藝要求（表一）進(jìn)行控制，特別是各項補料要適應(yīng)工藝對溶氧、pH及維持量的要求，不能過量，也不能不足；為了減少過程空氣濕度對發(fā)酵液體積的影響，在濕度偏高或偏低的季節(jié)，要適當(dāng)提高或降低用于補料的糖液濃度。 6、氨水既作為發(fā)酵的氮源，又用來調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH，它的補入要根據(jù)發(fā)酵液的pH和銨氮含量與補硫酸銨協(xié)調(diào)進(jìn)行。 7、發(fā)酵液過濾要盡量提高速度，縮短時間，為此一般需要在過濾前對發(fā)酵液進(jìn)行絮凝處理，絮凝劑的加入量隨絮凝劑種類不同而異，以達(dá)到最大絮凝效果而不過量為宜。,8、除種子制備和發(fā)酵過程要嚴(yán)防雜菌侵入外，提取的各工序也應(yīng)盡量保持無菌，因為污染細(xì)菌極有可能產(chǎn)生能破壞青霉素的青霉素酶；特別是過濾，由于操作時間長，料液營養(yǎng)豐富，容易滋生雜菌，故必須定期對設(shè)備和過濾介質(zhì)進(jìn)行清洗和滅菌，必要時可在過濾前加入0.4%福爾馬林防腐。 9、青霉素對熱、酸、堿都不穩(wěn)定，而萃取操作正好處于不穩(wěn)定pH范圍內(nèi)，故萃取過程要盡量降低溫度、縮短時間，以減少青霉素的降解；離心萃取速度快，青霉素在不穩(wěn)定pH下維持時間短，是目前生產(chǎn)上普遍采用的方法。,10、由于一次萃取對象的發(fā)酵濾液中含有不少可溶性蛋白質(zhì)，容易在萃取界面形成乳化層，影響萃取和相分離，故在萃取過程中要加入適量破乳劑。 11、結(jié)晶操作要掌握好晶體形成的速度，以達(dá)到理想的晶體和晶粒大?。粸榇?，必須控制結(jié)晶時的溫度和結(jié)晶反應(yīng)劑加入的速度，并保持適當(dāng)轉(zhuǎn)速的攪拌。 12、在整個提取過程中使用的過程水、溶媒及其它原輔料，都要有嚴(yán)格的質(zhì)量要求，設(shè)備、周圍環(huán)境和操作人員也要嚴(yán)格保持清潔，以避免帶進(jìn)雜質(zhì)和雜菌，影響產(chǎn)品質(zhì)量。,青霉素生產(chǎn)的發(fā)展和前景,青霉素類抗生素的毒性很小，由于-內(nèi)酰胺類作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，而人類只有細(xì)胞膜無細(xì)胞壁，故對人類的毒性較小，除能引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)外，在一般用量下，其毒性不甚明顯，是化療指數(shù)最大的抗生素。,青霉素是一種高效、低毒、臨床應(yīng)用廣泛的重要抗生素。它的研制成功大大增強了人類抵抗細(xì)菌性感染的能力，帶動了抗生素家族的誕生。它的出現(xiàn)開創(chuàng)了用抗生素治療疾病的新紀(jì)元。通過數(shù)十年的完善，青霉素針劑和口服青霉素已能分別治療肺炎、肺結(jié)核、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、白喉、炭疽等病。繼青霉素之后，鏈霉素、氯霉素、土霉素、四環(huán)素等抗生素不斷產(chǎn)生，增強了人類治療傳染性疾病的能力。但與此同時，部分病菌的抗藥性也在逐漸增強。為了解決這一問題，科研人員目前正在開發(fā)藥效更強的抗生素，探索如何阻止病菌獲得抵抗基因，并以植物為原料開發(fā)抗菌類藥物。,青霉素可用于治療： 1流行性腦脊髓膜炎 2放線菌病 3淋病 4奮森咽峽炎 5萊姆病 6多殺巴斯德菌感染 7鼠咬熱 8李斯特菌感染 9除脆弱擬桿菌以外的許多厭氧菌感染 風(fēng)濕性心臟病或先天性心臟病患者進(jìn)行口腔、牙科、胃腸道或泌尿生殖 道手術(shù)和操作前，可用青霉素預(yù)防感染性心內(nèi)膜炎發(fā)生,其中青霉素為以下感染的首選藥物： 1溶血性鏈球菌感染，如咽炎、扁桃體炎、猩紅熱、丹毒、蜂窩織炎和產(chǎn)褥熱等 2肺炎鏈球菌感染如肺炎、中耳炎、腦膜炎和菌血癥等 3不產(chǎn)青霉素酶葡萄球菌感染 4炭疽 5破傷風(fēng)、氣性壞疽等梭狀芽孢桿菌感染 6梅毒(包括先天性梅毒) 7鉤端螺旋體病 8回歸熱 9白喉 10青霉素與氨基糖苷類藥物聯(lián)合用于治療草綠色鏈球菌心內(nèi)膜炎,扁桃體炎,溶血性鏈球菌感染,肺炎鏈球菌感染,不產(chǎn)青霉素酶葡萄球菌感染,炭疽,梭狀芽孢桿菌感染,破傷風(fēng),梅毒,鉤端螺旋體病,回歸熱螺旋體,白喉桿菌,草綠色鏈球菌,草綠色鏈球菌心內(nèi)膜炎,專家估計，青霉素的國際市場年產(chǎn)值 足有440億美元以上,擴展.延伸.,提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法,防止碳分解代謝阻遏或抑制的發(fā)生 青霉素發(fā)酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以減少碳分解阻遏的發(fā)生，是一項很有效的提高產(chǎn)量的方法。 使用寡糖、多糖等緩慢利用的碳源，葡萄糖與麥芽糖、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與淀粉混合碳源的利用，也都能減少碳分解阻遏的發(fā)生。例如在次級代謝產(chǎn)物青霉素的生產(chǎn)中，葡萄糖雖能很好利用，但生產(chǎn)不適宜，而乳糖雖緩慢利用，卻可多產(chǎn)青霉素。在含葡萄糖和乳糖混合培養(yǎng)基中，生長階段迅速利用葡萄糖，葡萄糖用盡時，對乳糖利用解阻遏，不生長，但產(chǎn)青霉素。,青霉素是典型的微生物次級代謝產(chǎn)物。在生長代謝過程中存在兩個階段，即菌體生長繁殖階段和代謝產(chǎn)物合成階段。適當(dāng)控制培養(yǎng)基中玉米漿的量，減少對次級代謝的阻遏作用，提前由生長期進(jìn)入對數(shù)期。,由于玉米漿是一種快速利用的氮源，含有大量的可溶性蛋白，還含有苯乙酸 、苯乙酰等前體物質(zhì)。針對青霉素發(fā)酵后期糖利用慢，菌絲濃度易變稀的缺點，采取后補玉米漿的方法，即可平衡糖的代謝刺激青霉素的形成，又可延