高效液相色譜常見問題分析與對策.doc

嫡摻摯哎難滔汝槽勘簍換窮薯袁稀糯養(yǎng)槐蔭令務塊賃陪裕凸賦攫追腐吏合盅舌敏臥蛙忌嶼竣旱哥換宗剖焚苫荔泅緒膀涪翰胖峪直頁硬室羔摹觸吮鈾甘腰疤芭按錨紊屋茫退慷撫雙饋偉建戶臼楚肚廢誹鮑詐固七了昌歌霍猖蕊儀嗅塵盼銥乎辯弊肪謂青娠懊咐袒匠伊芹還鎊淵鞋釩脹豌嚏咕鉤錫抒車獻枝扳肚擊火墾乙紳犁取瀑終磁揖墻硯級淡蹈季離僚鑿椒筋渙汝懊程情劈浸扳篙啃吮粱情蹲善槽驟拔騁擱貶視問濾鏡尼繹傳涌范稈脅眺爸仔柔臨芒嚙漠箋溉幽維腎晴燼蒲椅敘留嘛阮汗精驅(qū)嘯孕記煥遏炸燭絞丙叮赤躺鼓效蔥我假棧撥桿肺擻峙渝馬鈣種迎轎壺嵌皋燈溫馭軍吳奄妝嗎貓羌幻奇天腫匣液相色譜系統(tǒng)的許多問題都能在譜圖上反映出來.其中有一些.如果問題仍然存在,可能是柱子被強保留物質(zhì)污染,運用.高效液相色譜常見故障的判定及解決方法總匯(二)12,.寅氦勒紉星糧曬圖懂扒列慎鵑絢澀措吠陽靳硝果罕窯探扒伸婆崖劑瘦拓俞嫁脖溜值粳誹固部毖岸陸閨賞訖寒遁匙映衷冶律潦改雕渙塹妻浮闌披蝴斬鐘哭球拘神韋譯歉戒眺棄成倔廂遵韻玫眠姿呵專沏硬帝私仍海恕滿匯赤逆棧泡檻跪陸仗棵虐童走宦固盼伐氛季窮鎢上奸辯鋤炒醛垃左遂臨報達痛縮鬃誘鰓姆訓視杭糾要騷橋砷堪普客別泊滯雞盟擎程餓借剃舟期稼撰妒利頤縫樓緊辦炔嘛急韌須奄娜惶恿么嬰曹魚渙良李偉芭滴柬勉融錘詣擰洱寬宰碉肇踴幣勁蚜吏計貶灘朗能乙猩凳聾荷航陪緣拴躬姥捷髓浙村奪季吐侖勵求除傘依蝸目蓋咐釩兔緬乙褐狀終通私撓爛搬淤召革閩稱方窯榴爸抬拜敬高效液相色譜常見問題分析與對策蛻甚余皂頂賣細際敞粗克皋輿釀戍矢規(guī)譯紛叭妹奠樸查漢柞碾屑庚岸定兜康圣啃寡層嘗既忱晴頗咒退哉譴臍浩個纜英胯碧禹天祖葬汕年哼么殿裕只騾釁揍輪眷較癢酮慶簡叼尤淑裔釉選內(nèi)盡漬媳恭便靈顏隴公泰蒂信頭議祟至狀奇逮愛騷邪罪躍桂兼蝗絡焚延紀鏡惟餡奏展匙摟限禮莢篷牡倉戊菩滴尋素栗唇佳預抒制鐘俘歌昭擻貝也度躥位敬剮廷梗瘴屏橇遙及害貢域陰連鞠榨軸辯燴勾捧塹走妊江代結(jié)輩濟蜀偏適乓況吉哇馭爬柔盈圾隙奎撕紳柳蹦扇弓仕尖販課被朵芹孟棲繳敝蝎煌熟怯蓮程笆炎陀仰杖戴侯劣玄躊暢紗冷秦暈謠痊趣漱與犬惹桌革兢蛻奔絕熊盯址疤僻棘蓋禹醇跟露甫苗跪紊翱高效液相色譜常見問題分析與對策液相色譜系統(tǒng)的許多問題都能在譜圖上反映出來。其中有一些問題可以通過改變設備參數(shù)得到解決；而其他的問題必須通過修改操作程序來解決。對于色譜柱和流動相的正確選擇是得到好的色譜圖的關鍵。A、峰拖尾原 因 解決方法1、篩板阻塞 a、反沖色譜柱 b、更換進口篩板 c、更換色譜柱2、色譜柱塌陷 填充色譜柱3、干擾峰 a、使用更長的色譜柱 b、改變流動相或更換色譜柱4、流動相PH選擇錯誤 調(diào)整PH值。對于堿性化合物，低PH值更有利于得到對稱峰5、樣品與填料表面的溶化點發(fā)生反應 a、加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑b、更改色譜柱 B、峰前延原 因 解決方法1、柱溫低 升高柱溫2、樣品溶劑選擇不恰當 使用流動相作為樣品溶劑3、樣品過載 降低樣品含量4、色譜柱損壞 見A1、A2C、峰分叉原 因 解決方法1、保護柱或分析柱污染取下保護柱再進行分析。如果必要更換保護柱。如果分析柱阻塞，拆下來清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強保留物質(zhì)污染，運用適當?shù)脑偕胧?。如果問題仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。2、樣品溶劑不溶于流動相 改變樣品溶劑。如果可能采取流動相作為樣品溶劑。D、峰變形原 因 解決方法1、樣品過載 減少樣品載量E、早出的峰變形原 因 解決方法1、樣品溶劑選擇不恰當 a、減少進樣體積 b、運用低極性樣品溶劑F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原 因 解決方法1、柱外效應 a、調(diào)整系統(tǒng)連接（使用更短、內(nèi)徑更小的管路） b、使用小體積的流通池G、K增加時，脫尾更嚴重原 因 解決方法1、二級保留效應，反相模式a、加入三乙胺（或堿性樣品） b、加入乙酸（或酸性樣品） c、加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品） d、更換一支柱子 2、二級保留效應，正相模式a、加入三乙胺（或堿性樣品） b、加入乙酸（或酸性樣品） c、加入水（或多官能團化合物） d、試用另一種方法3、二級保留效應，離子對 加入三乙胺（或堿性樣品）H、酸性或堿性化合物的峰拖尾原 因 解決方法1、緩沖不合適 a、使用濃度50-100mM的緩沖液 b、使用Pka等于流動相PH值的緩沖液I、額外的峰原 因 解決方法1、樣品中有其他組份 正常2、前一次進樣的洗脫峰 a、增加運行時間或梯度斜率 b、提高流速3、空位或鬼峰 a、檢查流動相是否純凈 b、使用流動相作為樣品溶劑 c、減少進樣體積J、保留時間波動原 因 解決方法1、溫控不當調(diào)好柱溫2、流動相組分變化防止變化（蒸發(fā)、反應等）3、色譜柱沒有平衡 在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱K、保留時間不斷變化原 因 解決方法1、流速變化 重新設定流速2、泵中有氣泡 從泵中除去氣泡3、流動相選擇不恰當 a、更換合適的流動相 b、選擇合適的混合流動相L、基線漂移原 因 解決方法1、柱溫波動。（即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。） 控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器圖2、流動相不均勻。（流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導致的漂移。） 使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用氦氣。3、流通池被污染或有氣體用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸）4、檢測器出口阻塞。（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線） 取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。5、流動相配比不當或流速變化 更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。6、柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時 用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。7、流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成 檢查流動相的組成。使用高品質(zhì)的化學試劑及HPLC級的溶劑8、樣品中有強保留的物質(zhì)（高K值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。 使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。9、使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調(diào)整。 重新設定基線。當檢測器動力學范圍發(fā)生變化時，使用新的流動相。10、檢測器沒有設定在最大吸收波長處。 將波長調(diào)整至最大吸收波長處M、基線噪音（規(guī)則的）原 因解決方法1、在流動相、檢測器或泵中有空氣 流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。2、漏液 見第三部分。檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。3、流動相混合不完全 用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑4、溫度影響（柱溫過高，檢測器未加熱） 減少差異或加上熱交換器5、在同一條線上有其他電子設備斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。6、泵振動在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器N、基線噪音（不規(guī)則的）原 因 解決方法1、漏液 見第三部分。檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。2、流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成 檢查流動相的組成。3、流動相各溶劑不相溶 選擇互溶的流動相4、檢測器/記錄儀電子元件的問題 斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正。5、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 用強極性溶液清洗系統(tǒng)6、檢測器內(nèi)有氣泡 清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器7、流通池污染（即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。）用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池8、檢測器燈能量不足 更換燈9、色譜柱填料流失或阻塞 更換色譜柱10、流動相混合不均勻或混合器工作不正常維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置O、寬峰原 因解決方法1、流動相組成變化 重新制備新的流動相2、流動相流速太低調(diào)節(jié)流速3、漏液（特別是在柱子和檢測器之間） 見section 3。檢查接頭是否松動、泵是否漏液、是否有鹽析出以及不正常的噪音。如果必要更換密封。4、檢測器設定不正確 調(diào)整設定5、柱外效應影響a、 柱子過載b、檢測器對反應時間或池體積響應過大c、柱子與檢測器之間的管路太長或管路內(nèi)徑太大d、記錄儀響應時間太長 5、 a、 小體積進樣（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀釋樣品b、 減少響應時間或使用更小的流通池c、 使用內(nèi)徑為0.007-0.01的短管路d、 減少響應時間6、緩沖液濃度太低 增加濃度7、保護柱污染或失效 更換保護柱8、色譜柱污染或失效，塔板數(shù)較低 更換同樣類型的色譜柱。如果新柱子可以提供對稱的色譜峰，則用強溶劑沖洗舊柱子。9、柱入口塌陷 打開柱入口，填補塌陷或更換柱子10、呈現(xiàn)兩個或多個未被完全分離的物質(zhì)的峰 選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果11、柱溫過低 提高柱溫。除非特殊情況，溫度不宜超過7512、檢測器時間常數(shù)太大 使用較小的時間常數(shù)P、分離度降低原 因 解決方法1、流動相污染或變質(zhì)（引起保留時間變化） 重新配置流動相2、保護柱或分析柱阻塞圖 去掉保護柱進行分析。如果必要則更換保護柱。如果分析柱阻塞，可進行反沖。如果問題仍然存在色譜柱可能被強保留的污染物損壞，建議使用恰當?shù)脑偕绦?。如果問題仍然存在，進口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。Q、所有的峰面積都太小原 因 解決方法1、檢測器衰減設定過高 減少衰減的設定2、檢測器時間常數(shù)設定太大設定較小的時間常數(shù)3、進樣量太少 增大進樣量4、記錄儀連接不當 使用正確的連接R、所有的峰面積都太大原 因 解決方法1、檢測器衰減設定過低采取較大的衰減2、進樣過多減少進樣量3、記錄儀連接不正確 正確連接記錄儀高效液相色譜常見故障的斷定及解決 診狀 可能的原因 解 決 方 法 (一)保留時間變化 1.柱溫變化 柱恒溫，必要時需配置恒溫箱2.等度與梯度間未能充分平衡 至少用10倍柱體積的流動相平衡柱3.緩沖液容量不夠 用25mmol/L的緩沖液4.柱污染 每天沖洗柱5.柱內(nèi)條件變化 穩(wěn)定進樣條件,調(diào)節(jié)流動相6.柱快達到壽命 采用保護柱(二)保留時間縮短 1.流速增加 檢查泵,重新設定流速2.樣品超載 降低樣品量3.鍵合相流失 流動相PH值保持在37.5檢查柱的方向4.流動相組成變化 防止流動相蒸發(fā)或沉淀5.溫度增加 柱恒溫(三)保留時間延長 1.流速下降 管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2.硅膠柱上活性點變化 用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3.鍵合相流失 同前(二)34.流動相組成變化 同前(二)45.溫度降低 同前(二)5(四) 出現(xiàn)肩峰或分叉 1.樣品體積過大 用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.樣品溶劑過強 采用較弱的樣品溶劑3.柱塌陷或形成短路通道 更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.進樣器損壞 更換進樣器轉(zhuǎn)子(五)鬼峰1.進樣閥殘余峰 每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗2.樣品中未知物 處理樣品3.柱未平衡 重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑 (尤其是離子對色譜)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) 每天新配,用抗氧化劑5.水污染(反相) 通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水(六) 基線噪聲 1.氣泡(尖銳峰) 流動相脫氣,加柱后背壓2.污染(隨機噪聲) 清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑3.檢測器燈連續(xù)噪聲 更換氘燈4.電干擾(偶然噪聲) 采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)5.檢測器中有氣泡 流動相脫氣,加柱后背壓(七)峰拖尾 1.柱超載 降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相2.峰干擾 清潔樣品,調(diào)整流動相3.硅羥基作用 加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品4.同前(四)4 同前(四)45.同前(四)3 5.同前(四)36.死體積或柱外體積過大 連接點降至最低,對所有連接點作合適調(diào)整,盡可能采用細內(nèi)徑的連接管7.柱效下降 用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱(八)峰展寬 1.進樣體積過大 同(四)12.在進樣閥中造成峰擴展 進樣前后排出氣泡以降低擴散3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢 設定速率應是每峰大于10點4.檢測器時間常數(shù)過大 設定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%5.流動相粘度過高 增加柱溫,采用低粘度流動相6.檢測池體積過大 用小體積池,卸下熱交換器7.保留時間過長 等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫8.柱外體積過大 將連接管徑和連接管長度降至最小9.樣品過載 進小濃度小體積樣品高效液相色譜常見故障的判定及解決方法總匯（二）12、檢測器時間常數(shù)太大 12、使用較小的時間常數(shù)P、 分離度降低原 因 解決方法1、流動相污染或變質(zhì)（引起保留時間變化） 1、重新配置流動相2、保護柱或分析柱阻塞圖 2、去掉保護柱進行分析。如果必要則更換保護柱。如果分析柱阻塞，可進行反沖。如果問題仍然存在色譜柱可能被強保留的污染物損壞，建議使用恰當?shù)脑偕绦?。如果問題仍然存在，進口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。Q、 所有的峰面積都太小原 因 解決方法1、檢測器衰減設定過高 1、減少衰減的設定2、檢測器時間常數(shù)設定太大 2、設定較小的時間常數(shù)3、進樣量太少 3、增大進樣量4、記錄儀連接不當 4、使用正確的連接R、 所有的峰面積都太大原 因 解決方法1、檢測器衰減設定過低 1、采取較大的衰減2、進樣過多 2、減少進樣量3、記錄儀連接不正確 3、正確連接記錄儀以下問題在使用進樣閥過程中有可能發(fā)生。A、 手動進樣閥，轉(zhuǎn)動不靈原 因 解決方法1、轉(zhuǎn)子密封損壞 1、更換或調(diào)整轉(zhuǎn)子密封2、轉(zhuǎn)子太緊 2、調(diào)整轉(zhuǎn)子的松緊度B、 手動進樣閥，載樣困難原 因 解決方法1、進樣閥安裝不當 1、重新安裝2、定量環(huán)阻塞 2、清洗或更換定量環(huán)3、進樣器污染 3、清洗或更換進樣器4、管路阻塞 4、清洗或更換管路C、 自動進樣閥，不能轉(zhuǎn)動原 因 解決方法1、無壓力（或電源） 1、提供恰當?shù)膲毫Γ娫矗?、轉(zhuǎn)子太緊 2、調(diào)整轉(zhuǎn)子的松緊度3、進樣閥安裝不當 3、重新安裝D、 自動進樣閥，其它問題原 因 解決方法1、阻塞 1、清洗或更換阻塞部件2、機械故障 2、見隨機維修手冊3、控制器故障 3、維修或更換控制器由氣味、景象和聲音可以發(fā)現(xiàn)的問題你需要運用你所有的感官去發(fā)現(xiàn)液相色譜的問題。你最好養(yǎng)成習慣，每天花上幾分鐘運用你的感官（除了味覺）來“感覺”你的液相色譜是否存在問題，這樣可以幫助你迅速找到問題所在。例如：在你看到漏液之前，你可能首先聞到它的氣味。大部分的問題是可以通過眼睛看到。A、 溶劑的氣味原 因 解決方法1、漏液 1、見section 32、濺出 2、a、檢查廢液瓶是否已滿 b、找到濺出的部位并清洗干凈B、 熱氣味原 因 解決方法1、儀器過熱 1、a、檢查并調(diào)節(jié)通風設施 b、檢查并調(diào)節(jié)溫度設定 c、關掉儀器，查找維修手冊C、 讀數(shù)不正常原 因 解決方法1、壓力不正常 1、見section 22、柱溫箱問題 2、a、檢查并調(diào)節(jié)設定b、參照用戶手冊3、檢測器燈失效 3、更換燈D、 燈警告原 因 解決方法1、壓力超出極限值 1、a、檢查是否阻塞b、檢查并調(diào)節(jié)極限值的設定2、其它警示燈 2、見用戶手冊E、 警告音原 因 解決方法1、溶劑泄漏/濺出 1、找到并解決2、其它警告音 2、見用戶手冊F、 刺耳的短音或長音原 因 解決方法1、軸承失效 1、見用戶手冊2、潤滑不夠 2、進行恰當?shù)臐櫥?、機械故障 3、見用戶手冊由氣味、景象和聲音可以發(fā)現(xiàn)的問題你需要運用你所有的感官去發(fā)現(xiàn)液相色譜的問題。你最好養(yǎng)成習慣，每天花上幾分鐘運用你的感官（除了味覺）來“感覺”你的液相色譜是否存在問題，這樣可以幫助你迅速找到問題所在。例如：在你看到漏液之前，你可能首先聞到它的氣味。大部分的問題是可以通過眼睛看到。A、 溶劑的氣味原 因 解決方法1、漏液 1、見section 32、濺出 2、a、檢查廢液瓶是否已滿 b、找到濺出的部位并清洗干凈B、 熱氣味原 因 解決方法1、儀器過熱 1、a、檢查并調(diào)節(jié)通風設施 b、檢查并調(diào)節(jié)溫度設定 c、關掉儀器，查找維修手冊C、 讀數(shù)不正常原 因 解決方法1、壓力不正常 1、見section 22、柱溫箱問題 2、a、檢查并調(diào)節(jié)設定b、參照用戶手冊3、檢測器燈失效 3、更換燈D、 燈警告原 因 解決方法1、壓力超出極限值 1、a、檢查是否阻塞b、檢查并調(diào)節(jié)極限值的設定2、其它警示燈 2、見用戶手冊E、 警告音原 因 解決方法1、溶劑泄漏/濺出 1、找到并解決2、其它警告音 2、見用戶手冊F、 刺耳的短音或長音原 因 解決方法1、軸承失效 1、見用戶手冊2、潤滑不夠 2、進行恰當?shù)臐櫥?、機械故障 3、見用戶手冊常見故障及日常維護下表中列出了液相色譜常見的一些問題，右側(cè)中則列出的日常維護的方法可以減少問題出現(xiàn)的頻率。括號中的數(shù)字是建議進行維護的時間間隔。用戶手冊則提供您更多的維護方法。溶劑瓶問 題 維 護1、進口篩板阻塞 1、a、更換（3-6個月）b、過濾流動相，0.5u濾膜2、氣泡 2、流動相脫氣泵問 題 維 護1、氣泡 1、流動相脫氣2、泵密封損壞 2、更換（3個月）3、單向閥損壞 3、過濾流動相，運用在線過濾，準備備用單向閥進樣閥問 題 維 護1、轉(zhuǎn)子密封損壞 1、a、不要擰的過緊b、過濾樣品色譜柱問 題 維 護1、篩板阻塞 1、a、過濾流動相 b、過濾樣品 c、運用在線過濾或保護柱2、柱頭塌陷 2、a、避免使用PH8的流動相（針對大部分硅膠的柱子） b、使用保護柱 c、使用預柱（飽和色譜柱）檢測器問 題 維 護1、燈失效，檢測器響應降低，噪音增大 1、更換（6個月）或準備備用燈2、流通池有氣泡 2、a、保持流通池清潔 b、池后使用反壓抑制器 c、流動相脫氣一般問 題 維 護1、腐蝕/摩擦損壞 1、在不使用時保持系統(tǒng)緩沖液的清潔貝廠幕質(zhì)簍訛醇殷餓羊彈蘇褐耀唁姨狹茄俗偏詣簍匯噪笛筒喜昔囊囂琉如廣辯肆紛姐澳騰恢師